一種提高作物耐鹽能力促生菌株的篩選方法與流程
2023-07-24 10:19:51
本發明涉及微生物分離與應用技術領域，具體地，涉及一種提高作物耐鹽能力促生菌株的篩選方法。
背景技術：
目前，隨著社會的發展和人口的增加，對耕地資源的需求越來越多。我國有鹽鹼地9913萬公頃，其中環渤海70萬公頃，是重要的潛在耕地資源。鹽鹼地的改良是國際性難題，世界各國都在努力尋找鹽鹼地改良的科學方法，目前可應有的方法有物理的改良技術，如以水壓鹽法，滲管排鹽以及一些耕作措施；化學的改良技術，如使用土壤改良劑；生物改良技術，利用微生物的促生作用，以提高植物耐鹽性和生物產量。其中物理方法並不適宜淡水資源匱乏的地區，使用土壤改良劑，材料用量大，受地方資源的限制，微生物由於成本低，繁殖快，可利用它們的促生、防病、抗衰老等作用，大幅度提高作物的耐鹽、抗旱性和生物產量，從而達到改善鹽鹼地的目的。利用根際促生微生物提高鹽鹼地作物耐鹽促生的方法具有投資少，見效快，效益高的特點，已經成為國際上的研究熱點。但是根據發明人的經驗和相關報導，大部分菌株功能一般，效果不佳且或效果不穩定，優良菌株/菌系的高效率選方法顯得十分重要。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種提高作物耐鹽能力促生菌株的篩選方法。
為了實現上述技術目的，本發明提供了具有提高作物耐鹽能力促生菌株的篩選方法，包括以下步驟:
(1)篩選優勢菌株；
(2)組合優勢菌株。
步驟(1)是將重度鹽鹼地上生長的植物進行原位採集後，將其根際土壤、非根際土壤和根系三個樣品進行稀釋，培養基上培養並分離獲得的細菌菌株。
上述方法中，對分離獲得的細菌進行耐鹽度，耐鹼度，溶磷，固氮，和產IAA、ACCD、嗜鐵素耐鹽促生功能的檢測，篩選具有上述一個或多個優勢功能的菌株。
上述方法中，功能檢測所使用的基礎培養基為1/3KMB培養基或LB培養基，所述1/3KMB培養基的配方為胰蛋白腖6g/L，蛋白腖1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L pH7.0。所述的LB培養基的配方為胰蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0。
其中，耐鹽度檢測是檢測並獲得在含氯化鈉0.1％-5％的培養基中能生長的菌株。
其中，酸鹼度檢測是檢測並獲得在pH值為7.0-9.0的培養基中能夠生長的菌株。
步驟(2)組合優勢菌株是將步驟(1)篩選得到的具有一個或多個優勢功能的菌株按照功能互補，協同共生的原則進行組合。
本發明提供了一種促進鹽鹼地作物生長的生物肥的製備方法，將上述篩選方法獲得的菌株與腐熟的有機肥混合，使混合後肥料的活菌數＞2×107CFU/g。
本發明提供了上述篩選方法在鹽鹼地作物促生中的應用。
本發明提供了上述篩選方法在篩選促生菌株或菌系中的應用。
本發明方法通過一系列耐鹽促生功能篩選，最終獲得具有多種功能或優勢功能的菌株，利用互利共生又功能互補的原則將菌株進行合理組合，以提高菌株組合在作物根際的定殖和功能表達能力，實現一加一大於二的效果。通過該方法篩選獲得的複合菌系，在田間應用效果突出，克服了同類研究因菌株單一或採用簡單組合方法，田間應用效果不穩定和效果差的問題。
具體實施方式
除非另有定義，下文中所使用的所有專業術語與本領域技術人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業術語只是為了描述具體實施例的目的，並不是旨在限制本發明的保護範圍。
除有特別說明，本發明中用到的各種試劑、原料均為可以從市場上購買的商品或者可以通過公知的方法製得的產品。
實施例1重度鹽鹼地植物根系細菌的分離及其促生功能檢測
將重度鹽鹼地上生長的植物進行原位採集，裝入無菌樣品袋中，記錄釆樣的經緯度、溫溼度以及採樣生境。輕柔搖蕩植株樣品，去除根上附著的鬆散土土壤即根圍土壤。稱取根圍土1g，加入5mL生理鹽水，渦旋震蕩器振蕩1min後獲得的土壤懸液，即為根圍土樣1。剪下根系，附帶一點莖幹以使根系都在一起。將根系放在PA瓶中，加入5mL生理鹽水，在渦旋儀上最大頻率振蕩1min。該土壤懸液即為根際土樣2。隨後將根系轉移到新PA瓶中，進行表面滅菌(95％乙醇浸泡5min，5％次氯酸鈉浸泡5min，無菌水洗滌12次)，然後用燒過的無菌鑷子將根轉移到研缽中，加入1ml生理鹽水和適量滅菌石英砂進行研磨，用研缽碾碎後加入4mL生理鹽水溶解，該懸液即為根系樣3。上述獲得的3中樣品懸液振蕩均勻後，靜置1min後依次製成樣品1：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度的土壤稀釋液。樣品2：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度的土壤稀釋液。樣品3：10-1、10-2、10-3、10-4梯度的土壤稀釋液。將上述樣品1：10-3、10-4、10-5；樣品2：10-4、10-5、10-6；樣品3：10-2、10-3、10-4梯度的土壤稀釋液分別塗布到含氯化鈉濃度為5％以及pH8.0的基礎培養基1/3KMB平板上，每個平板塗布菌液100μL，重複2次。30℃倒置培養2d。最終將獲得的單菌落進行保存待用。
實施例2提高鹽鹼地作物生產性能優良菌株/系和菌株組合篩選方法
將稀釋分離獲得的細菌菌株進行活化後，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌2次後，重懸於1mL生理鹽水中待用。①準備好含氯化鈉0％，5％，pH＝9.0的1/3KMB平板，CAS，有機磷，無機磷，阿須貝，ADF 8種平板，依次將每種菌懸液點到8種平板上，30℃倒置培養7d。②將重懸液按百分之一的接種量，接種到含有色氨酸終濃度為100mg/L的1/3KMB液體培養基中，30℃，48-72h培養。然後進行IAA檢測(500μg/ml色氨酸)。記錄每株菌的促生結果，並整理成excel統計表。
依據生物功能互補，營養吸收互補，協同共生的原則，將多株功能菌進行組配，通過盆栽試驗，檢驗提高植物耐鹽、促生、防病等應用效果，篩選優良複合菌系。
實施例3全功能菌系組合及玉米盆栽篩選試驗
以功能互補為原則，以儘量多地涵蓋生物功能譜為目標，分別挑選具有不同功能的優勢菌株，如具有較強產IAA、解磷、固氮功能的解澱粉芽孢桿菌ZCM18【該菌株於2016年9月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No.12959，分類名為解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)】，具有較強產嗜鐵素、拮抗病原真菌和產乙烯脫氨酶的優勢菌株特基拉芽孢桿菌ZCM5【該菌株於2016年9月12日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No.12960，分類名為特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)】功能互補的耐鹽鹼菌株，進行組合。各菌株單獨培養，按發酵液中活菌數量1：1配成複合菌液，複合菌液的活菌數為1×1010cfu/mL，將菌液接種到含鹽0.3％土壤玉米種子周圍，每顆玉米種子500μL。陽性對照為單一優勢菌株處理，空白對照組接種無菌水，每顆玉米種子500μL。重複10次。光照室培養25d，統計玉米的株高、地上乾重、根乾重等生物量指標。經比較，優良菌株組合處理的植株生物量都優於單一菌株處理，分別比對照組增加34.7％、46.8％和15.0％。
表1全功能菌系玉米盆栽試驗數據
實施例4全功能單一菌株玉米盆栽篩選試驗
挑選具有較強耐鹽鹼、促生等功能齊全的單一菌株進行玉米盆栽試驗。將菌株進行培養，最終將培養物調節為1×1010cfu/mL。試驗組將菌液接種到玉米種子周圍，每顆玉米種子500μL。對照組接種無菌水到玉米種子周圍，每顆玉米種子500μL。重複10次。光照室培養25d後統計玉米的株高、地上乾重、根乾重等生物量指標。結果表明，試驗組的上述生物量分別比對照組增加23.3％，11.0％，15.0％。
表2全功能菌株玉米盆栽試驗數據
實施例5全功能菌系生物肥製備和鹽鹼地玉米田間應用試驗
如實施例3的方法，將優良菌系分別培養並製備複合菌培養液，活菌數量達到1×1010cfu/mL。將菌液按照5％的量噴灑在有機肥顆粒上製備成菌數為1×108cfu/g的生物肥。田間試驗的地點設在河北省滄州市海興縣鹽鹼地低產田，含鹽範圍0.1-0.3％。採用常用的精量播種、施肥一體播種機，將生物肥(養分含量5％)與復混肥料(養分含量39％)混合後一併施入，肥種相距3-5cm。採用等養分比較法，處理組使用15公斤/畝生物肥加18公斤/畝39％復混肥料，對照使用39％復混肥20公斤/畝。最終統計玉米的根乾重和產量。最終處理組的根乾重和產量分別比對照組增加26.2％，19.3％。
表3全功能菌系進行玉米田間試驗數據
以上的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案做出的各種變型和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。