一種提高三孢布拉氏黴菌番茄紅素產量的方法

2023-07-18 11:05:56 1

專利名稱：一種提高三孢布拉氏黴菌番茄紅素產量的方法
技術領域：
本發明屬於提高液體深層發酵好氧微生物次級代謝產物的領域，特別涉 及到添加活性炭提高三孢布拉氏黴菌番茄紅素產量的方法。
背景技術：
番茄紅素是一種重要的類胡蘿蔔素，具有很強的抗氧化作用，是抗氧化 性最強的類胡蘿蔔素，具有很強的清除單線態氧功能，保護機體細胞免受氧 化傷害，實現其生理活性，能有效地防治前列腺癌、胃癌、皮膚癌等，對子 宮癌、肺癌細胞的抑制作用顯著高於P—胡蘿蔔素、(X—胡蘿蔔素。
番茄紅素可以由番茄皮中提取，可由化學方法合成，也可以經微生物發 酵產生。從獲得的產品品質和生產技術、資源成本方面考慮，利用微生物技
術生產番茄紅素是未來發展的方向。其中，三孢布拉氏黴菌(萬/d^/e" W^wra) (+ )( — )菌株同時培養時能夠大量合成P-胡蘿蔔素，在上個世紀五十年代 後期己實現工業化生產，在該黴菌發酵過程中，添加適合的含氮雜環類化合 物，可以阻斷番茄紅素環化形成P-胡蘿蔔素的過程，造成番茄紅素的積累。 最早在專利US 3097146中提出了這種方法，在以後的專利文獻US 3,369, 974， JP 48016189, JP 48016190, JP73016189, JP73016190, RU2102416, JP09313167, US3369974中均報導了相關研究成果。近些年來，國內各研究部門和高校也 有相關研究報導。CN1528906A描述了一種用三孢布拉黴發酵生產番茄紅素的 方法，CN1582328A發明了一種無外源胡蘿蔔素生成抑制劑的適宜培養基中能 生產0.3g/L番茄紅素的三孢布拉黴。由於三孢布拉氏黴菌是一種高嗜氧菌， 發酵過程中對氧的需求非常大，生產培養基是糊化後的澱粉漿液，粘度非常 大，給發酵過程中的氧傳遞帶來了極大的困難，國內專利CN1582328A中是 通過增加鼓風和攪拌速率來滿足菌種生長過程中的需氧量，但這種方法需要 耗費大量的能源，使生產成本提高，對工業化生產造成困難。有報導稱，在 發酵液中加入液態烷烴可以增加溶解氧含量，但添加濃度要儘量小，避免對 菌體造成傷害，後期產物分離提取要經過脫毒處理，操作繁瑣。因此，市場 上有待出現一種安全、無毒、廉價的攜氧劑來解決這個問題。
活性炭是一種黑色粉狀，粒狀的無定形具有多孔的碳，主要成分為碳， 還含有少量氧、氫、硫、氮、氯，具有較大的表面積(500 1000米2/克)，有 很強的吸附性能，能在它的表面上吸附氣體、液體或膠態固體。利用這種性 質可以將其加入發酵液中，釋放其攜帶的氧，優化高粘度發酵液的流體性能，降低發酵液粘度，提高溶解氧含量，滿足三孢布拉氏黴菌生長所需氧，提高 番茄紅素產量。

發明內容
本發明的主要目的就是提高三孢布拉氏黴菌液體深層發酵生產番茄紅 素的產量。具體實施方法是在發酵液中加入顆粒狀活性炭，取締液態攜氧劑， 優化生產流程，降低生產成本，提高番茄紅素產量。
活性炭對菌體無任何毒害作用，固體小顆粒可以增加發酵液流體流動， 加快氧在液體中的溶解，高嗜氧菌生長良好。在發酵結束時，固體小顆粒提 高了菌體的過濾速度，提高了工作效率。活性炭亦可吸附殘留在液體中的番 茄紅素，減少損失。
本發明的提供了一種三孢布拉氏黴菌番茄紅素產量的方法，其特徵在於.. 在發酵開始之前或之中在發酵液中加入活性炭。
進一步，加入的活性炭的粒徑是60目 200目。
進一步，加入的活性炭的質量濃度是0.5 2.0g/L起始發酵液。
進一步，加入活性炭的時間是發酵第0 2天。
本發明的具體技術路線如下
1) 平板培養取去皮土豆20g，加入200ml去離子水煮開，冷卻後濾掉 土豆，清液加入2g葡萄糖，2g瓊脂，溶解後分裝115°C30分鐘滅菌，製備PDA 培養基。取三孢布拉氏黴菌(+ )( — )菌株孢子懸液分別塗布於含有PDA 培養基的平板中，於28。C避光培養3天，22'C培養2天。
2) 活性炭經過鹽酸活化處理，烘乾後備用。
3) 種子培養培養基由澱粉、葡萄糖、玉米漿熬製而成，加入溶解的鉀 鹽和鎂鹽，pH調節至6.4，將平板培養好的三孢布拉氏黴菌(+ )( — )菌 株，分別取菌皮接入裝有種子培養基的250ml錐形瓶中，在26 28'C180 200 轉/分的條件下，避光震蕩培養36 40小時。
4) 發酵培養發酵培養基由澱粉、豆餅粉、玉米漿熬製而成，加入溶解 的鉀鹽和鎂鹽，pH調節至6.7，將培養好的(+ )、(一)菌種子液按體積比 1:4的比例混合，以體積比10%的接種量接入裝有發酵培養基的500ml錐形瓶 中，活化處理後的活性炭根據實驗要求加入發酵培養基。在26~28°C、 220~250 轉/分的條件下，避光震蕩培養120小時。在發酵48小時時加入菸鹼或吡啶類 代謝阻斷劑。
5) 菌體收集發酵結束後，用紗布過濾發酵液收集溼菌體，45'C0.08MP真空乾燥得到幹菌體。
6)番茄紅素含量分析粉碎幹菌體，準確稱取0.03 0.05g幹菌粉，石油 醚萃取，用高效液相色譜法測定番茄紅素含量。
色譜條件
分離柱Diamonsil C18， ID5|im， 250X4.6mm;
流動相乙腈二氯甲烷(75:25，V/V);
檢測條件波長450nm;柱溫28"C;流速1.5mL/min。
番茄紅素與番茄紅素標準品的保留時間比較確定，含量測定由外標法確定。


圖l空白菌提取物色譜圖(最高峰為番茄紅素檢測峰) 圖2實施例2中活性炭添加量為1.0g/L時菌體提取物色譜圖(最高峰為 番茄紅素檢測峰)
具體實施例方式
實施例l:①平板培養取去皮土豆20g，加入200ml去離子水煮開，冷 卻後濾掉土豆，清液加入2g葡萄糖，2g瓊脂，溶解後分裝115'C30分鐘滅菌， 製備PDA培養基。取三孢布拉黴(+ )( — )菌株孢子懸液分別塗布於含有 PDA培養基的平板中，於28'C避光培養3天，22"C培養2天。②活性炭預處 理將活性炭經過200目、100目、60目、16目、5目篩子過濾，篩出不同 粒徑的活性炭，分別浸泡在質量百分比濃度為0.5%的鹽酸中2小時，抽濾， 去離子水洗至中性，4(TC烘乾備用。③種子培養基製備稱取澱粉40g，葡萄 糖20g，玉米漿50g，KH2PO41.5g,MgSO40.1 g ，溶於l升去離子水中，加 熱攪拌糊化至變粘稠，調節pH至6.4。分裝於250ml錐形瓶中，115'C30分 鍾滅菌。④發酵培養基製備稱取澱粉20g,豆餅粉40 g,玉米漿30 g KH2P04lg， MgSO4 0.1g，溶於l升去離子水中，加熱攪拌糊化至變粘稠，調節 pH至6.7。分別準確稱取不同粒徑活性炭各0.05g於500ml錐形瓶中，將糊 化好的發酵培養基量各取50ml倒入錐形瓶中，混勻，用八層紗布塞好瓶口， 外面用牛皮紙包紮好，121。C20分鐘滅菌。⑤種子培養取平板培養的三孢布 拉氏黴菌(+ )、(一)菌株分別接種於種子培養基中，標號，於28"C180 轉/分避光培養得到(+ )、(一)菌種子液。⑥發酵以(+ )菌種子液 (一)菌種子液為1:4的體積比例按照體積比10%的接種量接種於發酵培養基 中，28。C220轉/分避光培養，在培養第48小時加入阻斷劑，發酵120小時後收集菌體，45'C0.08MP真空乾燥得到幹菌體。⑦分析測定粉碎幹菌體，準 確稱取0.03g，加入石油醚萃取至無色，用高效液相色譜法分析番茄紅素含量。 所得結果如下
添加200目活性炭，番茄紅素產量為733mg/L發酵液，比空白提高64%。 添加100目活性炭，番茄紅素產量為799mg/L發酵液，比空白提高79%。 添加60目活性炭，番茄紅素產量為677mg/L發酵液，比空白提高52%。
實施例2:①平板培養取去皮土豆20g，加入200ml去離子水煮開，冷 卻後濾掉土豆，清液加入2g葡萄糖，2g瓊脂，溶解後分裝115°C30分鐘滅菌， 製備PDA培養基。取三孢布拉氏黴菌(+ )( — )菌株孢子懸液分別塗布於 含有PDA培養基的平板中，於28'C避光培養3天，22"C培養2天。②活性炭 預處理將IOO目活性炭浸泡在質量百分比濃度為0.7%的鹽酸中2小時，抽 濾，去離子水洗至中性，4(TC烘乾備用。③種子培養基製備稱取澱粉40g,葡 萄糖20g，玉米漿50 g， KH2P041.5 g，MgS04 0.1 g ,,溶於1升去離子水中，加 熱攪拌糊化至變粘稠，調節pH值至6.4。分裝於250ml錐形瓶中，115°C30 分鐘滅菌。④發酵培養基製備稱取澱粉20g，豆餅粉40g,玉米漿30g, KH2P04 lg，MgSO40.1g，溶於1升去離子水溶解，加熱攪拌糊化至變粘稠，調 節pH值至6.7。準確稱取0.005、 0.025、 0.05、 0.1、 0.15、 0.5g活化好的活 性炭於500ml錐形瓶中，將糊化好的發酵培養基量取50ml倒入其中，混勻， 用八層紗布塞好瓶口，外面用牛皮紙包紮好，12rC20分鐘滅菌。⑤種子培養: 取平板培養的三孢布拉氏黴菌(+ )、(一)菌株分別接種於種子培養基中， 標號，於26。C190轉/分避光培養得到(+ )、(一)菌種子液。⑥發酵以 (+ )菌種子液(一)菌種子液為l:4的體積比例按照體積比10%的接種量 接種於發酵培養基中，26°C230轉/分避光培養，培養第48小時時加入阻斷劑， 發酵120小時後收集菌體，45X:0.08MP真空乾燥得到幹菌體。⑦分析測定 粉碎幹菌體，準確稱取0.04g，加入石油醚萃取至無色，用高效液相色譜法分 析番茄紅素含量。
所得結果如下-
添加100目活性炭濃度是0.5g/L，番茄紅素產量為609mg/L發酵液，比 空白提高37%。
添加100目活性炭濃度是1.0g/L，番茄紅素產量為799mg/L發酵液，比 空白提高79%。添加100目活性炭濃度是2.0g/L，番茄紅素產量為592mg/L發酵液，比 空白提高33%。
實施例3:①平板培養取去皮土豆20g,加入200ml去離子水煮開，冷 卻後濾掉土豆，清液加入2g葡萄糖，2g瓊脂，溶解後分裝115°C30分鐘滅菌， 製備PDA培養基。取三孢布拉氏黴菌(+ ) (_)菌株孢子懸液分別塗布於 含有PDA培養基的平板中，於28'C避光培養3天，22"C培養2天。②活性炭 預處理將100目活性炭浸泡在質量百分比濃度為1.0%鹽酸中2小時，抽濾， 去離子水洗至中性，4(TC烘乾備用。③種子培養基製備稱取澱粉30g,葡萄 糖15g,玉米漿45g，KH2PO41.5g,MgSO40.1g,溶於1升去離子水中，加熱攪 拌糊化至變粘稠，調節pH值為6.4。分裝於250ml錐形瓶中，115'C30分鐘 滅菌。④發酵培養基製備稱取澱粉30g，豆餅粉50g,玉米漿40g,KH2PO4 lg，MgSO40.1g，溶於l升去離子水中，加熱攪拌糊化至變粘稠，調節pH值 至6.7，。在其中一瓶中加入0.05g活性炭，其餘不加，將糊化好的發酵培養 基量取50ml倒入500ml錐形瓶中，混勻，用八層紗布塞好瓶口，外面用牛皮 紙包紮好，121。C20分鐘滅菌。⑤種子培養取平板培養的三孢布拉氏黴菌 (+ )、(一)菌株分別接種於種子培養基中，標號，於27°C200轉/分避光 培養得到(+ )、(一)菌種子液。⑥發酵以(+ )菌種子液(一)菌種 子液為1:4的體積比例按照體積比10%的接種量接種於發酵培養基中，27°C 250rpm培養，在培養了 24、 48、 72、 96小時時分次加入活性炭粉末0.05g， 培養了48小時時加入阻斷劑，發酵120小時後收集菌體，45"C0.08MP真空 乾燥得到幹菌體。⑦分析測定粉碎幹菌體，準確稱取0.05g，加入石油醚萃 取至無色，用高效液相色譜法分析番茄紅素含量。
所得結果如下
發酵開始時添加100目活性炭，番茄紅素產量為764mg/L發酵液，比空 白提高68°/。。
發酵開始後第1天添加100目活性炭，番茄紅素產量為654mg/L發酵液， 比空白提高43%。
發酵開始後第2天添加100目活性炭，番茄紅素產量為537mg/L發酵液, 比空白提高18°/。。
權利要求
1、一種提高三孢布拉氏黴菌番茄紅素產量的方法，其特徵在於在發酵開始之前或之中在發酵液中加入活性炭。
2、 根據權利要求l的方法，其特徵在於其中加入的活性炭的粒徑是60目 200目。
3、 根據權利要求1的方法，其特徵在於其中加入的活性炭的質量濃度是0.5 2.0g/L起始發酵液。
4、 根據權利要求1的方法，其特徵在於其中加入活性炭的時間是發酵第0 2天。
全文摘要
本發明涉及一種提高三孢布拉氏黴菌番茄紅素產量的方法，屬於提高好氧微生物液體深層發酵生產次級代謝產物的領域，特別涉及到添加活性炭提高三孢布拉氏黴菌(Blakeslea trispora)生產番茄紅素的方法。方法是在發酵液中加入活性炭，利用活性炭吸附氣體的性質，增加發酵液中溶解氧的濃度，改善發酵液粘度，促進三孢布拉氏黴菌的生長，番茄紅素的產量提高為原產量的150％以上。本方法成本低廉、操作簡便、效果明顯，可以取代液態烷烴、過氧化氫作攜氧劑，避免了化學物質對菌種的毒害性，簡化了番茄紅素後提純工藝，為工業化生產提供了良好的依據。
文檔編號C12R1/645GK101555490SQ20091008437
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月22日 優先權日2009年5月22日
發明者劉淑惠, 袁其朋 申請人:北京化工大學