一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法
2023-07-15 21:00:56 3
一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法
【專利摘要】本發明涉及一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法，具體是，將普通工業生產產黃青黴菌菌株從米孢子出發，經調配溶液、紫外誘變、初篩、復篩、驗證而獲得高產菌株。採用米孢子紫外誘變和篩選獲得高產菌株，開拓了工業產黃青黴菌育種的新途徑。該方法操作程序簡便，所用儀器設備少，成本低，是一種易於推廣的產黃青黴菌的育種方法。
【專利說明】一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法
[0001]摘要
本發明涉及一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法，具體是，將普通工業生產產黃青黴菌菌株從米孢子出發，經調配溶液、紫外誘變、初篩、復篩、驗證而獲得高產菌株。採用米孢子紫外誘變和篩選獲得高產菌株，開拓了工業產黃青黴菌育種的新途徑。該方法操作程序簡便，所用儀器設備少，成本低，是一種易於推廣的產黃青黴菌的育種方法。
【技術領域】
[0002]本發明屬於工業發酵生產用產黃青黴菌的高產菌株選育，特別涉及的是一種用特定濃度的米孢子進行紫外輻照誘導突變進行選育，從而獲得高產菌株的方法。
【背景技術】
[0003][0003]青黴素作為我國兩大戰略性原料藥品之一，不僅是人們健康生活的保障，同時也對我國在世界藥品市場的地位有重要的影響。
[0004]我國青黴素工業菌種的發酵能力，發酵指數和生產成本與國外企業相比還有很大差距，國外工業菌株發酵能力約是我國的1.8倍，其發酵成本僅佔售價的25%，而我國發酵產品的生產成本佔到售價的50% — 60%。這使得我國發酵產品的利潤空間和發酵工業的贏利能力遠低於國外同類企業。我國更多是以規模生產在國際市場參與競爭。
[0005]青黴素的技術創新勢在必行。而在技術創新中，優良菌株的選育工作是其中的重要組成部分，一個耐受性好 的高產菌株可以直接提高發酵效率，帶來巨大的經濟效益。
[0006]
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種廉價高效的，選育工業發酵生產用的高產菌株的方法。產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法，該方法，誘變周期短、操作程序簡便，正向突變率高，收效顯著。
[0008]本發明的技術方案是:將工業發酵用米孢子的懸濁液在紫外燈下輻照，將輻照後的孢子液塗布在含青黴素的PDA平板培養基上，在培養箱中培養，以菌落的形態為特徵選出優良菌株，然後再用含青黴素的PDA平板復篩，從中選出表現優良的菌株，接種到搖瓶中發酵驗證，以效價為特徵選出優良高產菌株。
[0009]米孢子是工業發酵生產接種用的小米孢子。米孢子懸濁液是將工業發酵用米孢子用滅菌水洗脫，製成IXio6 Ix IO7個孢子/Cm3的懸濁液。經過多次試驗與摸索，米孢子懸濁液的濃度在該範圍內，紫外輻照的效果最好。
[0010]輻照過程是:在無菌工作檯上，取上述濃度的懸濁液2(T50ml置於玻璃皿中，在滅菌用普通紫外燈下15~20cm處輻照15~20分鐘。在該時間段中輻照的效率最高。
[0011]在黑暗的環境裡，將輻照後的孢子液均勻的塗布在含青黴素的PDA平板培養基上，青黴素的濃度為10(Tl50ug/ml。一般每次塗布20-30個培養皿。在培養箱中遮光，25°C培養6天觀察菌落的特徵和形態。
[0012]菌落呈圓臺型突起、突起布滿褶皺、褶皺厚實均勻、顏色呈灰綠色、突起高且粗壯的為待驗證的菌株，一般每個平板上會有3飛個符合要求的菌株，把這些菌株全部挑出、編號、接種到含青黴素的平板培養基上進行復篩，同樣在培養箱中25°C靜置培養6天。最符合上述優良菌落特徵的菌株挑出、編號，進一步驗證，將挑出的菌株接種到IOml試管培養基中，在搖床上25°C，搖床200轉/分鐘，培養56小時，再轉接到裝有30ml培養基的250ml搖瓶中，搖床上26°C，搖床200轉/分鐘繼續培養6天，每天補加2ml濃度為30%的苯乙酸滅菌溶液。
[0013]用培養六天後的發酵液，測青黴素的效價，效價在3X 104IU/ml以上的即為優良高產菌株。
[0014]本發明的優點是:
1、採用特定濃度下的紫外誘變育種，突變效率高，操作程序簡便，所用儀器設備少，成本低，是一種易於推廣的產黃青黴菌育種方法。
[0015]2、復篩和驗證保證了誘變後新菌株的耐受性和穩定性，高產效果明顯，在不到一個月的時間裡選育到2株新菌株，效價增產分別為7%和11%，經濟效益顯著。
[0016]【具體實施方式】:
實施例1:
將工業發酵用米孢子用滅菌水洗脫，製成I X IO6個孢子/Cm3的懸濁液。在無菌工作檯上，取上述濃度的懸濁液20ml置於直徑90mm玻璃皿中，在滅菌用普通紫外燈下15cm處輻照15分鐘。在黑暗的環境中，將輻照後的孢子液均勻的塗布在含青黴素100 ug/ml的PDA平板培養基上，塗布20個培養皿。在培養箱中遮光、25°C培養6天觀察菌落的特徵和形態。菌落呈圓臺型突起、突起布滿褶皺、褶皺厚實均勻、顏色呈灰綠色、突起高且粗壯的為待驗證的菌株，將符合要求的菌株，全部挑出、編號、接種到含青黴素100 ug/ml的PDA平板培養基上進行復篩，同樣在培養箱中25°C靜置培養6天，最符合上述優良特徵的菌株挑出、編號。再將挑出的菌株接種到IOml試管培養基中，在搖床上25°C，搖床200轉/分鐘，培養56小時；再轉接到裝有30ml培養基的250ml搖瓶中，搖床上26°C，搖床200轉/分鐘繼續培養6天，每天補加2ml濃度為30%的苯乙酸滅菌溶液。用培養六天後的發酵液，測青黴素的效價，效價在3X 104IU/ml以上的即為優良高產菌株。通過本實施例，獲得一個耐受性好遺傳穩定的新菌株，其效價為3.21X104IU/ml，可增產7%。其中本實施例中用到的培養基配方如下:
試管培養基):蔗糖2，玉米漿6.7，碳酸鈣0.5，ρΗ5.8
搖瓶培養基(％):乳糖13，玉米漿3，甘油1.5，碳酸鈣1，硫酸鈉0.5，磷酸二氫鉀0.3，硫酸鎂0.005%,硫酸銅0.002%，磷酸二氫鉀0.03，硫酸亞鐵0.0015，ρΗ5.9。
[0017]實施例2:
將工業發酵用米孢子用滅菌水洗脫，製成I X IO7個孢子/Cm3的懸濁液。在無菌工作檯上，取上述濃度的懸濁液50ml置於直徑90mm玻璃皿中，在滅菌用普通紫外燈下20cm處輻照20分鐘。在黑暗的環境中將輻照後的孢子液均勻的塗布在含青黴素150 ug/ml的PDA平板培養基上，塗布30個培養皿。在培養箱中遮光、25°C培養6天觀察菌落的特徵和形態。菌落呈圓臺型突起、突起布滿褶皺、褶皺厚實均勻、顏色呈灰綠色、突起高且粗壯的為待驗證的菌株，將符合要求的菌株，全部挑出、編號、接種到含青黴素150 ug/ml的PDA平板培養基上進行復篩，同樣在培養箱中25°C靜置培養6天，最符合上述優良特徵的菌株挑出、編號。再將挑出的菌株接種到IOml試管培養基中，在搖床上25°C，搖床200轉/分鐘，培養56小時，再轉接到裝有30ml培養基的250ml搖瓶中，搖床上26°C，搖床200轉/分鐘繼續培養6天，每天補加2ml濃度為30%的苯乙酸滅菌溶液。用培養六天後的發酵液，測青黴素的效價，效價在3X 104IU/ml以上的即為優良高產菌株。通過本實施例，獲得一個耐受性好遺傳穩定的 新菌株，其效價為3.30X 104IU/ml，可增產11%。其中本實施例中用到的培養基配方如下:
試管培養基(％ ):蔗糖2，玉米漿6.7，碳酸鈣0.5，ρΗ5.8
搖瓶培養基(％):乳糖13，玉米漿3，甘油1.5，碳酸鈣1，部分無機鹽類硫酸鈉0.5，磷酸二氫鉀0.3，硫酸鎂0.005%,硫酸銅0.002%，磷酸二氫鉀0.03，硫酸亞鐵0.0015,ρΗ5.9 ο
【權利要求】
1.一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法，其特徵在於:將工業發酵用米孢子的懸濁液在紫外燈下輻照，將輻照後的孢子液塗布在含青黴素的PDA平板培養基上，在培養箱中培養，以菌落的形態為特徵選出優良菌株，然後再用含青黴素的PDA平板復篩，選出表現優良的菌株，接種到搖瓶中微量發酵，以效價為特徵選出優良高產菌株。
2.如權利要求1所述的一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法，其特徵在於所述米孢子懸濁液是將工業發酵用米孢子用滅菌水洗脫，製成1X 1O6^l X 1O7個孢子/ml的懸濁液。
3.如權利要求1所述的一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法，其特徵在於所述的輻照條件是:取該懸濁液2(T50ml置於玻璃皿中，在普通紫外燈下15~20cm處，輻照15~20分鐘。
4.如權利要求1所述的一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法，其特徵在於:所述的含青黴素的PDA平板培養基中，青黴素的濃度為100~l50ug/ml。
5.如權利要求1所述的一種產黃青黴菌的紫外誘變育種及篩選方法，其特徵在於所述的菌落特徵是:菌落總體圓臺型突起，突起布滿褶皺，褶皺厚實均勻，顏色呈墨綠色，突起聞且粗壯。
【文檔編號】C12R1/82GK103834634SQ201210471742
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月21日 優先權日:2012年11月21日
【發明者】張偉寶 申請人:青島百草匯中草藥研究所