一種極端嗜鹽古菌質粒及其衍生質粒載體的製作方法

2023-10-23 01:00:57

專利名稱：一種極端嗜鹽古菌質粒及其衍生質粒載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種極端嗜鹽古菌質粒及其衍生質粒載體。
背景技術：
古菌多生長於極端自然環境，被認為是與細菌和真核生物並列的、生命的第三種形式。研究表明，古菌在遺傳信息的傳遞方面(如DNA複製、轉錄、翻譯等)與真核生物相似；而在中央代謝(如產能)方面則與細菌接近。因此，研究古菌不僅對於闡明生命運動的基本規律、揭示生命起源和物種進化等方面的奧秘具有重大意義，而且有助於了解較為複雜的真核生物的一些重要生物學過程。從發展生物技術的角度看，極端環境古菌所產生的極端酶比普通酶更能耐受嚴酷條件(如高溫、酸鹼、有機溶劑等)，因而在許多領域具有良好的應用前景。
極端嗜鹽古菌(Extremely Halophilic Archaea)的最適生長環境含有2-5M NaCl，是主要的極端嗜鹽環境微生物。極端嗜鹽古菌在系統進化樹中位於古細菌的一個分支Euryarchaeta(廣古菌)的頂端，形成一個相對獨立的群體(Proc Natl Acad Sci USA1996，93(17)9188-9193)，與嗜熱古菌和產甲烷古菌相比，嗜鹽古菌是最容易培養的一個類群。極端嗜鹽古菌種類繁多，包括Halobacterium，Halococcus，Haloarcula，Haloferax，Halorubrum，Halobaculum，Halogeome tricum，Haloterrigrna，Halorhabdus，Natrialba，Natronobacterium，Natronococcus，Natronomonas，Natrinema，Natronorubrum，Haloalcalophilium等16個屬。其中Halobacterium，Haloferax等為中性極端嗜鹽古菌，Natronobacterium，Natronococcus等為極端嗜鹽嗜鹼古菌。極端嗜鹽古菌極具開發前景，如在這類微生物中有大量可供開發的極端酶類，生物活性因子，可降解塑料的前體物質，具有研製生物計算機晶片潛力的細菌視紫紅質等。
極端嗜鹽古菌的研究和開發需要相應的遺傳作業系統，但是目前其遺傳作業系統還相當匱乏，中性極端嗜鹽古菌中已構建的幾個系統(J Bacteriol 1990，172756-761；J Biol Chem 1992，2675829-5843)只能用於有限的幾個屬，這在很大程度上限制了這類重要微生物的理論研究和基因工程開發。因此研發極端嗜鹽古菌的新株型的新的遺傳作業系統意義重大。極端微生物遺傳作業系統不僅是研究極端環境微生物遺傳學，以及表達極端酶類和極端微生物生物活性因子的首選系統，而且該系統還具有其它重要特色。極端嗜鹽微生物遺傳作業系統的構建將為該類極端微生物資源的深度開發，如生物納米材料紫膜的生物改性，生物可降解塑料前體物PHA的遺傳工程等，提供首選的工具系統。
質粒系統是微生物生物遺傳作業系統的主要形式。對微生物進行成功的基因轉化必須滿足以下條件1)用於轉化的基因(DNA)必須能通過諸如電轉化，無機離子處理，原生質體融合等物理或化學方法導入該生物體內。2)進入生物體內的外源基因(DNA)必須能被複製(自主複製或者作為宿主基因組的一部分進行複製)。在實際操作中，可通過從欲被轉化的宿主中分離其野生型質粒，然後通過基因重組構建複製型質粒載體，外源DNA被克隆到上述質粒載體後就可很好地實現隨質粒複製的目的。3)應用一種或幾種選擇標記，使轉化體能從非轉化細胞群中被選擇出來。

發明內容
本發明的目的是提供一種極端嗜鹽古菌質粒。
本發明所提供的極端嗜鹽古菌質粒，名稱為pSCM201，來源於極端嗜鹽古菌AS7094，具有序列表中序列3的核苷酸序列。
經測定，極端嗜鹽古菌AS7094的16S rDNA(序列1)與鹽盒菌屬(Haloarcula sp.)16S rDNA有98％的同源性，其cR序列(序列2)與鹽盒菌屬(Haloarcula sp.)cR序列具有99％的同源性，可以肯定AS7094為鹽盒菌屬(Haloarcula sp.)。
序列表中序列3由3463個核苷酸組成。其中，序列3中的自5′端第90-1289位鹼基為一個開放閱讀框架Orf1，Orf1編碼具有序列表中序列4的胺基酸殘基序列的反式作用因子Orf1；序列3中的自5′端第1291-1698位鹼基為第二個開放閱讀框架Orf2，Orf2編碼具有序列表中序列5的胺基酸殘基序列的反式作用因子Orf2；序列3中的自5′端第1771-2409位鹼基為第三個開放閱讀框架Orf3，Orf3編碼具有序列表中序列6的胺基酸殘基序列的反式作用因子Orf3。序列3中的自5′端第1699-1770位鹼基，2410-89位鹼基，均為質粒的順式作用元件。
序列表中的序列4是由399個胺基酸殘基組成的蛋白質，序列表中的序列5是由135個胺基酸殘基組成的蛋白質，序列表中的序列6是由212個胺基酸殘基組成的蛋白質。
pSCM201為雙鏈DNA質粒，拓撲學形狀是環狀，可用來轉化嗜鹽古菌。極端嗜鹽古菌AS7094可在完全培養基上生長，菌落呈圓形，邊緣整齊，37℃生長7-10天菌落為紅色。
質粒pSCM201的物理圖譜如圖1所示，其包括的常見限制性內切酶位點有ClaI，Hind III，Nco I等酶切位點各一個，兩個Sal I酶切位點。其中，序列3中的自5′端第1-6位鹼基為Hind III酶切位點；序列3中的自5′端第656-661位鹼基為Cla I酶切位點；序列3的自5′端第3224-3229位鹼基為NcoI酶切位點；序列3中的自5′端第1642-1647位鹼基和序列1中的白5′端第2221-2226位鹼基為兩個SalI酶切位點。質粒pSCM201不含Apa I，BamH I，Bgl II，EcoR I，EcoR V，Kpn I，NdeI，Pvu II，Sac II，Sma I，Sph I，Xba I等常見內切酶位點，因此這些內切酶位點可作為pSCM201的衍生載體的多克隆位點。
基於本發明質粒pSCM201構建的表達載體，如pSCM204和pSCM206也屬於本發明保護範圍。
由於質粒pSCM201能夠在嗜鹽古菌中自主複製，在保證其提供的複製所需的元件完整的前提下，向其中引入性質明確的其它功能DNA片段，即可構成可轉化極端嗜鹽古菌的重組載體或衍生質粒載體。
在質粒pSCM201的非編碼區引入大腸桿菌質粒複製子及適於在大腸桿菌中篩選的抗性標記基因，在此基礎上引入在極端古菌中有效的抗性選擇基因，即可構成E.coli-Halobacteria穿梭克隆載體，方便在大腸桿菌中進行基因操作及在極端嗜鹽古菌中進行遺傳分析和應用研究。如在質粒pSCM201的自5′端第2614至2703位鹼基之間引入大腸桿菌質粒複製子ColE1 ori及適於在大腸桿菌中篩選的抗性標記基因AmpR及多克隆位點，在多克隆位點EcoRI和KpnI之間引入在極端古菌中有效的抗性選擇基因MevR，即可構成E.coli-Halobacteria穿梭克隆載體pSCM204(其物理圖譜如圖2所示)。
pSCM204含有來自pSCM201完整的在極端嗜鹽古菌中複製所需的複製原點，即通過PCR獲得的DNA序列pSCM201 ori；含有在大腸桿菌中複製所需的複製原點，即大腸桿菌質粒複製子ColE1 ori；並含有在大腸桿菌及在極端嗜鹽古菌中篩選轉化子的抗性選擇標記基因AmpR和MevR，以及用於外源基因插入的克隆位點如Kpn I，Pst I，NdeI等。pSCM204是一個有效的E.coli-Halobacteria穿梭克隆載體，可轉化大腸桿菌和極端嗜鹽古菌，並在其中克隆表達外源基因。對pSCM204在宿主Haloarcula.hispanica中的穩定性實驗表明，該穿梭載體在無抗性選擇壓力存在的條件下生長200代，質粒載體的保持率仍超過98％。pSCM204的高度穩定性為其進一步構建表達載體表達極端嗜鹽古菌中有用蛋白質提供了可靠的保障。
在pSCM201的其中兩個開放開放閱讀框(Orf2、Orf3)內部設計引物將整個質粒擴增出來，然後按pSCM204的構建策略構建相應的克隆載體，用來研究Orf2、Orf3是否是pSCM201複製所必需的。例如採用PCR方法在Orf2的內部設計了一對引物將整個質粒擴增出來然後直接連到pUCm-T載體上，再加上MevR構建成pSCM206(其物理圖譜如圖3所示)，該質粒可以從某些方面研究Orf2的功能。
以穿梭克隆載體(如pSCM204)為基礎，在其多克隆位點引入適當的啟動子，同時可在啟動子下遊引入目的基因，轉化相應的宿主菌(如Haloarcula.hispanica)，以合適的條件加以誘導得到足夠量的目的蛋白。如以pSCM201為基礎構建表達載體研究目前在嗜鹽古菌中最具應用潛力的紫膜蛋白，也是一個極具吸引力的研究方向。因此，基於pSCM201構建而成各種表達載體均在本專利保護之列。
由本發明的極端嗜鹽古菌質粒及其衍生質粒載體轉化所得到的微生物也屬於本發明的保護範圍。
本發明的極端嗜鹽古菌質粒及其衍生質粒載體為極端嗜鹽古菌的研究和開發提供了工具系統，將在極端嗜鹽古菌的研究和開發中發揮重要作用。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。


圖1為質粒pSCM201的物理圖譜圖2為重組載體pSCM204的物理圖譜圖3為重組載體pSCM206的物理圖譜具體實施方式
實施例1、獲得質粒pSCM201的方法對67株極端嗜鹽古菌進行質粒普查，結果表明在AS7094菌株中含有一小質粒，命名為pSCM201。將pSCM201提取後作酶切實驗，發現其含有兩個單酶切位點，即HindIII、NcoI。將pSCM201用HindIII酶切後連到作同樣酶切的pBluescriptII SK-；NcoI酶切後連到作同樣酶切的pUCm-T載體複製形式上進行測序。測序結果表明，質粒pSCM201具有序列表中序列3的核苷酸序列，其中，序列3中的自5′端第90-1289位鹼基為一個開放閱讀框架Orf1，Orf1編碼具有序列表中序列4的胺基酸殘基序列的質粒複製所需的反式作用因子；序列3中的自5′端第1291-1698位鹼基為第二個開放閱讀框架Orf2，Orf2編碼具有序列表中序列5的胺基酸殘基序列的質粒複製所需的反式作用因子；序列3中的自5′端第1771-2409位鹼基為第三個開放閱讀框架Orf3，Orf3編碼具有序列表中序列6的胺基酸殘基序列的質粒複製所需的反式作用因子；序列3中的自5′端第1699-1770位鹼基、2410-89位鹼基均為順式作用元件。該質粒還包括各一個Cla I酶切位點(序列1中的自5′端第656-661位鹼基)，HindIII(序列1中的自5′端第1-6位鹼基)酶切位點，Nco I酶切位點(序列1中的自5′端第3224-3229位鹼基)；兩個SalI酶切位點(序列1中的自5′端第1642-1647位鹼基和序列1中的自5′端第2221-2226位鹼基)。
實施例2、以質粒pSCM201為基礎的重組載體pSCM204的構建以pSCM201為模板，以orf4FCTAGATCTTGCCACCCCTATGACAGC和orf4RGCCTCGAGTGTGCTATCTGATTCCTT為引物在以下反應體系和循環程序下進行PCR擴增。其中，反應體系10×PCR buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，2.5mM Mg2+1.5μl，orf4F(10μM)1μl，orf4R(10μM)1μl，pSCM201 1μl，Taq酶(5U/μl)0.3μl，ddH2O15.7μl。以上所用PCR反應試劑均購自華美公司。循環程序94℃3min；94℃1min，57℃1min，72℃3.5min，30個循環；72℃7min。將得到的PCR產物和pUcm-T載體(購自上海生工生物工程公司)直接連接，同時將極端嗜鹽菌來源的莫維諾林(mevinolin)抗性基因(MevR，J Biol Chem 1992，2675829-5834)引入連有pSCM201PCR產物的pUcm-T載體的複製形式的多克隆位點區域作為在極端嗜鹽古菌中的抗性選擇標記基因，得到應用型的E.coli-Halobacteria穿梭克隆載體pSCM204(如圖2所示)。MevR抗性基因來源於極端嗜鹽古菌種比較常用的一個穿梭克隆載體pUBP2(ProcNatl Acad Sci USA 1990，876772-6776)。引入方法如下用EcoRI和KpnI對pUBP2和連有pSCM201 PCR產物的pUcm-T載體的複製形式進行雙酶切，然後回收pUBP2酶切產物中MevR抗性基因，與雙酶切後的連有pSCM201 PCR產物的pUcm-T載體的複製形式進行連接，轉化大腸桿菌JM109。將構建好的pSCM204轉化與AS7094親緣關係較近的Haloarcula.hispanica(微生物所菌種保藏中心)，轉化採用原生質體轉化方法(J.Bacteriol 1987，1691341-1344)。將得到的轉化子轉接後提取質粒，測序結果表明轉化子的序列是正確的。通過迴轉大腸桿菌JM109及用迴轉大腸桿菌JM109所得到的質粒重新轉化Haloarcula.hispanica，均能夠得到陽性克隆。對pSCM204在Haloarcula.hispanica的穩定性實驗表明，該穿梭載體能夠在無抗性選擇壓力存在的條件下存在超過200代而不丟失。穩定性實驗方法如下將在含有莫維諾林(5μg/ml)的液體AS-168培養基(每升中含有5.0g酸水解酪素(Difco)，5.0g酵母抽提物(Difco)，1.0g穀氨酸鈉，3.0g檸檬酸鈉，200g NaCl，20g MgSO4.7H2O，2.0g KCl，0.36g FeCl2.4H2O，0.36mg MnCl2.4H2O，pH7.2-7.4)中長至對數末期的Haioarcula.hispanica接種至不含莫維諾林的液體AS-168培養基中連續傳代培養，每2天轉接一次，以每天10代的速率計算，共轉接10次。每次將得到的菌體稀釋，分別塗布不含和含有莫維諾林(5μg/ml)的固體AS-168培養基，統計得到的菌落數，將含有莫維諾林的固體培養基得到的菌落數除以不含莫維諾林的固體培養基得到的菌落數即可得到pSCM204在Haloarcula.hispanica中的存在率，結果表明pSCM204在不含莫維諾林的培養基中生長200代存在率仍然達到98％，說明該克隆載體是非常穩定的，這位以後基於此構建各種穿梭表達載體奠定了基礎。
實施例3、pSCM206的構建及其應用為了研究Orf2的功能，構建了載體pSCM206(其物理圖譜如圖4所示)，其具體構建方法如下採用PCR方法在Orf1的內部設計了一對引物將整個質粒擴增出來然後直接連到pUCm-T載體上，再連上MevR構建成pSCM206。PCR引物為orf135dFTGCCCGCTGTCTGATTCG和orf135dRCCAGACGGAACCACCATC在以下反應體系和循環程序下進行PCR擴增。反應體系10×PCR buffer 2.5μl；2.5mM dNTP 2μl；2.5mM Mg2+1.5μl；orf135dF(10μM)1μl；orf135dR(10μM)1μl；pSCM2011μl；Taq酶(5U/μl)0.3μl；ddH2O 15.7μl。以上所用PCR反應試劑均購自華美公司。循環程序94℃3min；94℃1min，54℃1min，72℃3.5min，30個循環；72℃7min。連MevR方法同實施例2。將pSCM206採用原生質體轉化方法(J.Bacteriol1987，1691341-1344)轉化Haloarcula.hispanica，雖然得到了轉化子，但在無莫維諾林選擇的條件下，pSCM206遠不如pSCM204穩定，表明Orf2對pSCM201的複製雖然不是必需的，但可能在質粒的分配過程中起重要作用。
序列表160621012111474212DNA213鹽盒菌屬(Haloarcula sp.)4001attccggttg atcctgccgg aggccattgc catcggagtc cgatttagcc atgctagtcg 60cacgagttca gactcgtggc atatagctca gtaacacgtg gccaaactac cctacagacc 120gcgataacct cgggaaactg aggccaatag cggatataac tctcaggctg gagtgccgag 180agttagaaac gttccggcgc tgtaggatgt ggctgcggcc gattaggtag atggtggggt 240aacggcccac catgccgata atcggtacgg gttgtgagag caagaacccg gagacggtat 300ctgagacaag ataccgggcc ctacggggcg cagcaggcgc gaaaccttta cactgcacga 360cagtgcgata gggggactcc gagtgcgagg gcatatagcc ctcgcttttc tgtaccgtaa 420ggtggtacag gaacaaggac tgggcaagac cggtgccagc cgccgcggta ataccggcag 480tccaagtgat ggccgatatt attgggccta aagcgtccgt agcttgctgt gtaagtccat 540tgggaaatcg accagctcaa ctggtcggcg tccggtggaa actacacagc ttggggccga 600gagactcaac gggtacgtcc ggggtaggag tgaaatcctg taatcctgga cggaccacca 660atggggaaac cacgttgaga gaccggaccc gacagtgagg gacgaaagcc agggtctcga 720accggattag atacccgggt agtcctggct gtaaacaatg ctcgctaggt atgtcacgcg 780ccatgagcac gtgatgtgcc gtagtgaaga cgataagcga gccgcctggg aagtacgtcc 840gcaaggatga aacttaaagg aattggcggg ggagcaccac aaccggagga gcccgcggtt 900tcattggact caacgccgga catctcaccg gtcccgacag tagtaatgac ggtcagcttg 960acgactttac ttcgacgcta ctgagaggag gtgcatggcc gccgtcagct cgtaccgtga1020ggcgtcctgt taagtcaggc aacgagcgag acccacactt ctagttgcca gcaacacccc1080tgcggtggtt gggtacacta ggaggactgc cattgctaaa atggaggaag gaatgggcaa1140cggtaggtca gtatgccccg aatggaccgg gcaacacgcg ggctacaatg gctctgacag1200tgggatgcaa cgccgagagg cggagctaat ctccaaacgg agtcgtagtt cggattgcgg1260gctgaaaccc gcccgcatga agctggattc ggtagtaatc gcgtgtcaga agcgcgcggt1320gaatacgtcc ctgctccttg cacacaccgc ccgtcaaagc acccgagtgg ggtccggatg1380
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1 5 10 15Lys Val Arg Pro Glu Ala Pro Thr Thr Phe Tyr Asp Gly Asp Val Gln20 25 30Ile Pro Gly Tyr Gly Thr Pro Pro Glu Arg Cys Arg Ala Leu Ser Pro35 40 45Val Gly Phe Cys Glu Ala Gly His Thr Ile Leu Gly Arg Ser Ser Cys50 55 60Gly Thr Arg Tyr Cys Pro Asp His Trp Arg Asp Trp Cys Glu Asp Ala65 70 75 80Val Val Ser Ala Val Ala Arg Leu Ala Ala Tyr Arg His Ala Val Asp85 90 95Gly Ala Glu Lys Arg Leu Ser His Ile Val Ala Ser Pro Pro Gln Asp100 105 110Arg Ser Tyr Ser Lys Arg Ala Met Trp Glu Thr Arg Ser Glu Ala Thr115 120 125Thr Cys Trp Lys Met Arg Val Ser Val Ala Gly Cys Arg Val Thr His130 135 140Pro Tyr Arg Thr Asn Glu Arg Gly Asp Met Leu Phe Glu Thr Ala Val145 150 155 160Glu Ser Gly Glu Ile Pro Glu Glu Thr Gly Arg Trp Ala Phe Leu Arg165 170 175Glu Val Ser Glu Asp Trp Glu Asp Phe Thr Arg Tyr Ile Asp Ala Ser180 185 190Pro His Tyr His Thr Ile Ala Ala Ala Pro Ser Val Glu Pro Gly Asp195 200 205Ala Pro Asp Asp Trp Val Val Glu Arg Ile Arg Thr Leu Lys Pro Phe210 215 220Tyr Phe Arg Asp Thr Glu Ala Tyr Arg Ala Met Val Ala Pro Val Tyr225 230 235 240Tyr Thr Leu Thr His Gly Ala Val Glu Asp Ala Lys His Thr Leu Thr245 250 255Tyr Phe Gly Asp Val His Pro Ala Ser Phe Asp Pro Glu Glu Glu Leu
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Ala Arg Leu Leu Asp Ala Leu Met Phe Gln Thr Glu Pro Pro Ser Arg65 70 75 80Pro Arg Trp Asn Phe Glu Gly Asp Pro Val Glu Tyr Arg Asp Thr Tyr85 90 95Arg Tyr Gln Leu Ala Leu Tyr Gly Arg Leu Asp His Thr Leu Asp Gly100 105 110Tyr Gly Glu Met Leu His Arg Asp Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Pro Asp115 120 125Phe Ser Ser Ala Leu Asp Glu130 1352106211212212PRT213鹽盒菌屬(Haloarcula sp.)4006Met Val His Met Ala Thr Thr Glu Asn Ser Gly Gly Val Arg Ala Trp1 5 10 15Asp Ser Ala Lys Gln Phe Ala Val Asp Arg Leu Lys Glu Glu Thr Glu20 25 30Ser Leu Ser Pro Ser Ala Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Cys Ser Gly Asp35 40 45His Met Arg His Cys Leu Ala Asp Leu Ala Lys Glu Glu Leu Val Glu50 55 60Arg Ile Gly His Gly Glu Tyr Thr Ala Gly Glu Gln Ala Gly Glu Gln65 70 75 80Val Leu Gln His Glu Asp His Thr Asp Ser Arg Asp Glu Asp Ser Pro85 90 95Glu Asp Thr Glu Asp Thr Gly Asn Ile Gly Pro Ser Val Asp Gly Pro100 105 110Ala Arg Ser Glu Asp Pro Asp Thr Thr Gly Gly Ser Pro Val Glu Ile
115 120 125Glu Glu Asp Glu Arg Ala Glu Val Glu Leu Ser Glu Ser Asp Glu Glu130 135 140Asp Gly Asp Gly Glu Arg Val Asp Val Asp Arg Asp Gly Asp Gly Gly145 150 155 160Arg Ser Val Gly Val Tyr Ile Ile Ala Gly Thr Val Leu Leu Val Leu165 170 175Ala Ala Leu Trp Leu Ser Ile Gln Asp Gln Ser Asp Glu Thr Pro Glu180 185 190Gln Pro Gly Gln Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ala Val Asp Pro Asp Val195 200205Trp Gly Ala Glu210
權利要求
1.一種極端嗜鹽古菌質粒，它具有序列表中序列3的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的質粒，其特徵在於所述序列3中的自5′端第90-1289位鹼基編碼具有序列表中序列4的胺基酸殘基序列的反式作用因子；序列3中的自5′端第1291-1698位鹼基編碼具有序列表中序列5的胺基酸殘基序列的反式作用因子；序列3中的自5′端第1771-2409位鹼基編碼具有序列表中序列6的胺基酸殘基序列的反式作用因子；序列3中的自5′端第1699-1770位鹼基，2410-89位鹼基，均為順式作用元件。
3.基於權利要求1所述極端嗜鹽古菌質粒構建的表達載體。
4.根據權利要求3所述的表達載體，其特徵在於所述載體為pSCM204。
5.根據權利要求3所述的表達載體，其特徵在於所述載體為pSCM206。
6.由權利要求1-5所述質粒轉化得到的微生物。
全文摘要
本發明公開了一種極端嗜鹽古菌質粒及其衍生質粒。本發明所提供的極端嗜鹽古菌質粒，名稱為pSCM201，來源於極端嗜鹽古菌AS7094，它具有序列表中序列3的核苷酸序列。pSCM201的衍生質粒包括pSCM204，pSCM206。本發明的極端嗜鹽古菌質粒及其衍生質粒將在極端嗜鹽古菌的研究和開發中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/63GK1712533SQ20041004975
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月25日 優先權日2004年6月25日
發明者向華, 孫超岷 申請人:中國科學院微生物研究所