一種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法
2023-08-11 15:51:41 2
一種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法
【專利摘要】本發明提供一種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法，屬於胚胎低溫生物學【技術領域】。本發明方法包括：(1)牛胚胎冷凍用細管中先加入一段解凍液，然後裝入一段空氣；(2)裝入一段冷凍液，再裝入一段空氣；(3)裝入一段冷凍液，並在該段冷凍液中置入牛胚胎，再裝入一段空氣；(4)裝入一段解凍液並封閉管口，冷凍；(5)甩管解凍，直接移植；冷凍液為含有EG、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液，解凍液為含FBS的mPBS溶液。本發明方法操作簡便，對操作人員技術要求不高，冷凍後的牛胚胎甩管解凍後可直接移植，解凍後的胚胎存活率100％，擴張率94％，移植後妊娠率達57％，是一種高效、簡便易行的方法，適用於產業化推廣。
【專利說明】一種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物胚胎冷凍保存及胚胎移植【技術領域】，具體地涉及一種牛胚胎玻璃 化冷凍甩管解凍和直接移植方法。
【背景技術】
[0002] 自從Rail等（1985)發明胚胎玻璃化冷凍保存方法以來，使冷凍勿需藉助冷凍儀， 可在室溫下進行操作，程序得到極大地簡化。後經許多研宄者的改進，目前卵母細胞/胚胎 的玻璃化冷凍方法僅需1分鐘左右即可完成一個程序。在此過程中，許多研宄者創造性地 發明了許多冷凍的承載物體，並被命名為多種方法。如今常用的主要有以下幾種方法：尼龍 環玻璃化法（Cryoloop)、開放式拉管法（OPS，Open Pulled Straw)、微細玻璃管法（GMP)、微 滴法（Microdrops)、半細管法（hemi-straw)。但上述方法在應用中仍存在著諸多的問題， 如：尼龍環玻璃化法一次冷凍卵母細胞/胚胎數量有限，且需要特殊的冷凍管固定裝置才 易於長期保存。開放式拉管法（OPS)由於細管重量較輕，冷凍時易漂浮在液氮面，且該方法 的細管管壁較薄，易斷裂，在液氮中極易斷裂而造成卵母細胞/胚胎丟失，不利於卵母細胞 /胚胎的長期保存。微細玻璃管法（GMP)突出問題是冷卻速率慢（最高限制在20000°C/ min左右），易造成卵母細胞/胚胎損傷；並且GMP在冷凍中容易斷裂，造成卵母細胞/胚胎 丟失；且GMP的直徑和體積很小，限制了一次冷凍卵母細胞/胚胎的數量；而且GMP的虹吸 效果十分顯著，這也增加了操作的難度。微滴法（Microdrops)缺點是在貯存過程中無法進 行標識，容易汙染，不利於卵母細胞/胚胎的長期貯存。半細管玻璃化冷凍法（hemi-straw) 缺點是操作較難，對專業技術人員的水平要求較高，需要有操作熟練的技術人員，不太適用 於初學者。國內外對牛胚胎冷凍甩管解凍和直接移植法的研宄還存在操作比較複雜，冷凍 液毒性較高及冷凍效率較低等諸多問題。這些因素影響了玻璃化冷凍方法在牛胚胎移植生 產中的推廣應用。
[0003] 為了適應牛胚胎移植大規模生產需要，簡化胚胎冷凍解凍操作程序，降低生產成 本，提高胚胎移植效率，國內外研宄人員進行了牛胚胎冷凍甩管解凍和直接移植法的試驗。 該方法的共同點是以牛凍精細管做為玻璃化冷凍載體，稀釋液（即解凍液）段佔比較大，牛 胚胎在管外經預處理液平衡後，置於玻璃化冷凍液段中，投入液氮冷凍保存。解凍時從液氮 中取出細管，經空氣浴，水浴解凍後，甩管混勻管內液體。牛胚胎在管內平衡一段時間後，剪 掉封口端，然後直接裝入移植槍進行胚胎移植。表1為國內外牛胚胎冷凍甩管解凍和直接 移植法的研宄進展。
[0004] 表1國內外牛胚胎冷凍甩管解凍和直接移植法研宄進展
[0005]
【權利要求】
1. 一種玻璃化冷凍液在冷凍牛胚胎中的應用，其特徵在於，將牛胚胎置於該冷凍液中， 於液氮中冷凍保存；所述冷凍液為含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。
2. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於，冷凍液通過以下方法配製得到： a) mPBS溶液中加入聚蔗糖和蔗糖，使其終濃度分別為300g/L和0. 5mol/L，得到FS溶 液； b) 向FS溶液中加入乙二醇，二者體積比為65 :35,得到EFS35溶液即為冷凍液。
3. -種用於解凍牛胚胎的解凍液，其特徵在於，其為向mPBS溶液中加入胎牛血清，二 者體積比為9:1。
4. 權利要求3所述的解凍液在冷凍甩管解凍牛胚胎中的應用，其特徵在於，含有以下 步驟： (1) 牛胚胎冷凍用細管中先加入一段解凍液，然後裝入一段空氣； (2) 接著裝入一段冷凍液，再裝入一段空氣； (3) 裝入一段冷凍液，並在該段冷凍液中置入牛胚胎，再裝入一段空氣； (4) 裝入一段解凍液並封閉管口，投入液氮冷凍； (5) 甩管解凍，直接移植； 所述冷凍液為EFS35,其為含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。
5. -種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法，其特徵在於，包括如下步驟： (1) 牛胚胎冷凍用細管中先加入一段解凍液，然後裝入一段空氣； (2) 接著裝入一段冷凍液，再裝入一段空氣； (3) 裝入一段冷凍液，並在該段冷凍液中置入牛胚胎，再裝入一段空氣； (4) 裝入一段解凍液並封閉管口，投入液氮冷凍； (5) 甩管解凍，直接移植； 所述冷凍液為EFS35,其為含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液；所述解凍液為含 10% (V/V)胎牛血清的mPBS溶液。
6. 如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述冷凍液通過以下方法配製得到： a) mPBS溶液中加入聚蔗糖和蔗糖，使其終濃度分別為300g/L和0. 5mol/L，得到FS溶 液； b) 向FS溶液中加入乙二醇，二者體積比為65 :35,得到EFS35溶液即為冷凍液。
7. 如權利要求5所述的方法，其特徵在於，步驟（1)加入的解凍液長度為7. 5cm，空氣 為 0? 5cm ; 步驟（2)中加入的冷凍液長度為0. 4cm，空氣長度為0. 5cm ; 步驟（3)中加入的冷凍液長度為0. 5-0. 7cm，空氣長度為0. 5cm ; 步驟（4)中加入的解凍液長度為0. 9-1. lcm。
8. 如權利要求5所述的方法，其特徵在於，在牛胚胎置入冷凍液之前，還包括在 20-25°C下，將牛胚胎移入乙二醇溶液中平衡2.5-3min，然後移入步驟（3)的冷凍液中；所 述乙二醇溶液為乙二醇與mPBS溶液按照體積比1:9混合配製而成。
9. 如權利要求5-8任一所述的方法，其特徵在於，從牛胚胎移入冷凍液到投入液氮中 冷凍應在30秒之內完成。
10. 如權利要求5-8任一所述的方法，其特徵在於，從液氮中取出冷凍牛胚胎的細管， 在空氣中停留5-10秒，然後浸入20-25°C水浴中平行晃動，待細管內的溶液融化後，手持細 管快速甩動使管內的冷凍液和稀釋液充分混勻，細管自解凍後於室溫下平衡6-15min移植 於受體。
【文檔編號】A01N1/02GK104488853SQ201510015346
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月12日 優先權日:2015年1月12日
【發明者】朱士恩, 傅祥偉, 周豔華, 張有文 申請人:中國農業大學