一種優秀冰雪運動員線粒體dna分離與純化方法
2023-07-22 07:41:36
專利名稱：一種優秀冰雪運動員線粒體dna分離與純化方法
技術領域：
本發明涉及一種線粒體DNA(mtDNA)提取與純化的方法，本發明特別適用於優秀冰雪運動員血液來源的mtDNA的提取與純化，屬於體育科學和生物科學的交叉學科。
背景技術：
線粒體是存在於絕大多數真核細胞內的一種基本的重要的細胞器，它含有自己的DNA,具有相對獨立的遺傳系統它是細胞進行氧化磷酸化的場所。線粒體基因組不僅是研究DNA結構與複製轉錄的良好模型，也是研究真核細胞核酸與蛋白質合成非常合適的模型系統。線粒體基因組與核基因組的同源基因結構對比也被廣泛應用於核基因和核外基因的進化研究中。mtDNA是共價閉合的環狀雙鏈分子，對於不同的生物其分子量大小不一樣。研究證實人類mtDNA的全部核苷酸序列為16569bp。mtDNA不同於核DNA的一個突出特點就是以母性遺傳方式遺傳，在遺傳過程中mtDNA通過卵細胞質傳遞給後代。這種遺傳方式便於進行群體分析，一個個體就能代表一個母性集團，因此只需少量個體樣本便能反映一個群體的遺傳結構。優秀的冰雪運動員要具有良好的心肺功能、有氧代謝能力，其線粒體中酶活性及個數較正常人偏高。人血液中的血細胞有紅細胞、白細胞和血小板。紅細胞無細胞核和細胞器，血液中的mtDNA主要來源於白細胞和血小板。正常人安靜時血液中的白細胞總數在4000 10000個/mm3 或4 11.0X 109/L之間變動。白細胞生理性增高往往有以下情況，如劇烈運動、體力勞動、冷熱水浴後、酷熱和嚴寒、紫外線照射、情緒激動、刺激等因素都可導致白細胞數量增高。故總體上講優秀冰雪運動員血液中白細胞的數量應較正常人偏多。
發明內容
本發明的目的是提供一種提取mtDNA的方法。本發明的目的是提供一種純化mtDNA的方法本發明所提供的提取mtDNA的方法特別適用於優秀冰雪運動員。本發明聚焦於優秀冰雪運動員血液來源的mtDNA的提取與純化。本發明對傳統的mtDNA提取與純化的方法進行了篩選、改進及優化，提取高獲得率和高純度的測序級mtDNA。
具體實施例方式主要器械:低溫冷凍離心機、紫外分光光度計、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統、移液器、恆溫浴槽。藥品與試劑:溶液I:139.6mmol/L NH4Cl, 16.96mmol/L 三羥甲基胺基甲烷 Tris-HCl，ρΗ7.2 ;
溶液II:25mmol/L Tris-HCl ρΗ7.4,0.136mol/L NaCl，2.7mmol/L KCl ；溶液III:0.lmol/L NaCl, IOmmoI/L Tris-HCl pH7.6，lmmol/L EDTA ；溶液A:10mmol/L Tris-HCl pH7.5, NaCllOmmol/L, MgCl25mmol/L ；溶液B:10mmol/L Tris-HCl pH8.0, NaC1400mmol/L, EDTA2mmol/L。實驗步驟1、抽取優秀冰雪運動員靜脈全血5mL，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。
2、破碎紅細胞(I)取EDTA抗凝血2mL,加入IOmL的溶液I,混勻，靜置30min, 500r/min,離心8min。(2)用溶液II適量懸浮沉澱，分盛2個Eppendorf管中，以1500r/min速度離心4min。(3)用溶液II再懸浮沉澱，以1500r/min速度離心4min。(4)用適量溶液III洗I次，沉澱白細胞。3、高鹽法提取mtDNA(I)取IO7細胞沉澱，加入溶液Α5500μ L，混勻，以3000r/min速度離心8min，棄上清。(2)取沉澱加溶液B5500 μ L，顛倒混勻，以3500r/min速度離心lOmin，棄上清。(3)棄上清，沉澱加溶液B950 μ L，混勻後加入20mg/mL蛋白酶K50 μ L和10 %SDS120 μ L，快速混勻。40°C過夜或50°C 4小時。(4)加入300 μ L飽和醋酸鈉，顛倒混勻，輕搖15S。4°C以13000r/min速度離心20min,取上清於Eppendrof管中。(5)取上清後再加入300 μ L飽和醋酸鈉，顛倒混勻，輕搖15S。4°C以13000r/min速度離心20min。4、mtDNA 的純化(I)加入適量用 TE 溶解的 RNase (200mg/mL)，37°C，30min,消化 RNA。(2)上清中加入等體積酚:氯仿:異醇(25: 24: I)，溫和振蕩8min，4°C下以12000r/min 速度離心 12min。(3)取上層水相加入等體積氯仿，溫和振蕩8min,4°C以12000r/min速度離心12min。(4)取上清液加入等體積異丙醇，-20°C放置30min，以13000r/min速度離心25min,棄上清。(5)用70%冰乙醇漂洗沉澱，以15000r/min速度離心lOmin，棄上清。(6)再用70%冰乙醇漂洗沉澱，以15000r/min速度離心lOmin，徹底去上清。沉澱於空氣中自然部分乾燥25min，加入適量TE液溶解。5、mtDNA 樣品鑑定(I)紫外分光光度法測定:樣品經適當稀釋，用紫外分光光度計測其D260/D280值
鑑定純度。(2)瓊脂糖凝膠電泳:電泳用DYY-1112型電泳儀，I %瓊脂糖凝膠，取6 μ L溶解液2 μ L上樣液混勻後點樣，紫外燈下觀察並拍照。
權利要求
1.一種改進的高鹽法提取與純化mtDNA方法，其特徵在提取mtDNA的高獲得性。
1)加入裂解細胞的溶液A、B後離心的轉速分別上升到3000r/min與3500r/min，但是離心時間分別降低到8min與lOmin。
2)mtDNA的純化方法中將用異丙醇沉澱mtDNA的離心轉速降低到13000r/min同時離心時間增加到25min。
3)高鹽法提取mtDNA中增加了消化RNA步驟，即用TE溶解的RNase(200mg/mL)，37°C，30min。
全文摘要
本發明對已有的mtDNA的提取和純化方法進行整合和改進，形成一種新的提取與純化方法，克服了Triton法產量低、易降解的弊端。高鹽沉澱法操作簡單，易重複，可依需用量擴大反應體系，使mtDNA質量得以輕鬆控制且純度較高。鑑於優秀冰雪運動員較於常人的特殊體質特徵，該方法特別適用於優秀冰雪運動員血液來源的mtDNA的提取與純化方法。
文檔編號C12N15/10GK103173437SQ20131012167
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月10日 優先權日2013年4月10日
發明者劉春華, 鄭麗, 徐金慶, 孫玉姣, 陸濤峰, 關偉軍 申請人:哈爾濱體育學院