檢測抗hcv藥物細胞毒性的方法
2023-07-21 19:39:26
專利名稱：：檢測抗hcv藥物細胞毒性的方法
技術領域：
：本發明屬於抗病毒藥物篩選領域，具體地，涉及一種檢測抗HCV藥物細胞毒性的方法。
背景技術：
：據估計全球約1.7億人感染HCV，在初次感染HCV的約80X的病例中出現持久性感染和慢性肝病疾病，雖然慢性HCV感染可以保持無症狀，但也可以造成嚴重的肝臟受損最終發展成為肝硬化和肝癌。目前沒有對HCV有效的疫苗，臨床治療中採用幹擾素-a(interferon-a，IFN_a)聯合利巴韋林，病毒學持續應答達到50%，但長期使用利巴韋林會導致溶血性貧血等不良反應，所以開發新的治療藥物具有重大意義。用於抗HCV藥物的篩選系統主要有複製子系統，能在細胞中自主複製的HCV基因組，可應用於針對結構蛋白作為藥物靶點的的篩選；假病毒系統(HCVpp)用於HCV感染性的研究、抗體中和、作用於病毒E1和E2蛋白的藥物篩選；HCV細胞培養系統(HCVcc)則是HCV完整增殖周期、抗HCV治療方法和開發C型肝炎疫苗的強有力技術平臺。藥物細胞毒性對於體外抗HCV藥物的篩選藥物的藥效評價是必不可少的一步，以MTT法檢測藥物對細胞的毒性可計算出藥物對細胞的生長抑制率，通過GraphpadPrism5計算得到IC5。(IC5。半數抑制濃度，將細胞生長抑制50%所需的濃度)。再與藥物抗HCVEC5。相比，可得出TI值，進行體外抗病毒藥效評價。迄今，現有技術中未見以HCV細胞培養系統(HCVcc)為基礎，利用MTT法檢測抗HCV藥物的細胞毒性的方法的報導。
發明內容本發明目的是利用HCV細胞培養系統的Huh7.5.1細胞，對抗HCV藥物進行MTT法細胞毒性檢測，並為體外抗HCV藥物的篩選提供實驗依據。利用靈敏、經濟的MTT法檢測抗HCV藥物對Huh7.5.1細胞毒性，為篩選抗HCV藥物不可缺少的一步，並對抗HCV陽性藥物幹擾素(interferon,IFN)和利巴韋林(ribavirin,RBV)進行細胞毒性檢測，為體外篩選抗HCV藥物的順利進行提供依據。本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的檢測抗HCV藥物細胞毒性的方法，包括採用MTT法測定細胞生長曲線，確定實驗細胞密度，然後用MTT法檢測IFNa-lb及利巴韋林細胞毒性；利用2a型嵌合病毒J6/JFH1轉染Huh7.5.1細胞產生有感染性的病毒顆粒這一HCV細胞培養體系(HCVcellculture,HCVcc)，利用分析細胞活性、細胞生長增殖的MTT法檢測抗HCV藥物的細胞毒性，計算出藥物對細胞的生長抑制率，通過Gr即hpadPrism5計算得到IC5。。採用MTT法測定細胞生長曲線，確定實驗細胞密度是用(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數後，調整細胞濃度為9X10Wls/ml，鋪於96孔板(lOOiU/well);(2)補加培養基至終體積為200iil/well，將培養板置於37°C5%C02培養，每三天補充50-100新鮮培養基，設3個重複孔，同時設空白調零組；(3)每天於實驗孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培養箱孵育4h後，吸棄上清，加入1501DMS0，震蕩溶解10min，用酶標儀測各孔0D49。值；(4)繪製Huh7.5.1細胞生長曲線。用MTT法檢測IFNa-lb及利巴韋林細胞毒性步驟是用(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數後，調整細胞濃度為9Xl(^個/ml，鋪於96孔板(lOOiU/well);(2)加入以無血清培養基稀釋的藥物，8個稀釋梯度，每個梯度設三個重複孔，同時設置空白對照(只含培養基)、細胞對照及藥物顏色對照，補加培養基至終體積為200iil/well，將培養板置於37°C5%C02培養箱培養；(3)第三天於實驗孔加入20iil5mg/mlMTT溶液，37。C5%0)2培養箱孵育處後，吸棄上清，加入150ii1DMSO，震蕩溶解10min，用酶標儀測各孔0D49。值；(4)計算細胞生長抑制率，及以Gr即hpadPrism5計算IC5。值。細胞生長抑制率(％)=a-5，，)xioo對照孔OD值。本發明方法的主要步驟為(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數後，調整細胞濃度為9X10Wls/ml，鋪於96孔板(lOOiU/well);(2)加入以無血清培養基稀釋的藥物，8個稀釋梯度，每個梯度設三個重複孔，同時設置空白對照(只含培養基)、細胞對照及藥物顏色對照，補加培養基至終體積為200iil/well，將培養板置於37°C5%C02培養；(3)第三天於實驗孔加入20iil5mg/mlMTT溶液，37。C5%0)2培養箱孵育處後，吸棄上清，加入150ii1DMSO，震蕩溶解10min，用酶標儀測各孔0D49。值；(4)計算細胞生長抑制率，及以Gr即hpadPrism5計算IC5。值細胞生長抑制率(％)=(1-S，，)x100對照孔OD值。本發明以HCV細胞培養系統(HCVcc)為基礎，利用MTT法檢測抗HCV藥物的細胞泰性。MTT全稱為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，以PBS配製，過濾除菌保存。MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，但不能測定細胞絕對數。其原理為活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時在細胞色素C的作用下，生成藍色(或藍紫色)不溶於水的甲臢(Formazan)，並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。以二甲基亞碸(DMSO)溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。MTT比色法以簡單、經濟、快速、靈敏、無放射性汙染為特色，成為分析細胞活性、細胞生長增殖的常用方法，近年來MTT法應用於抗癌藥物、藥敏實驗的常用方法。但由於MTT法形成的藍紫色結晶需要加入有機溶劑二甲基亞碸溶解才能比色，操作步驟也會對實驗結果有所影響，但是與其它方法MTS、XTT法等比較，MTT法能檢測細胞密度範圍更寬，並且無放射性汙染，也更經濟，因此MTT法成為首選藥物篩選細胞毒性的方法。圖1為Huh7.5.1細胞生長曲線；圖2為利巴韋林細胞毒性。具體實施例方式下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以此來限定本發明。實施例1:l、Huh7.5.1細胞生長曲線採用MTT法測定細胞生長曲線，確定實驗細胞密度。(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數後，調整細胞濃度為9X10Wls/ml，鋪於96孔板(lOOiU/well)。(2)補加培養基至終體積為200iil/well，將培養板置於37°C5%C02培養，每三天補充50-1001新鮮培養基。設3個重複孔，同時設空白調零組。(3)每天於實驗孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培養箱孵育4h後，吸棄上清，加入1501DMSO，震蕩溶解10min，用酶標儀測各孔0D49。值。(4)繪製Huh7.5.1細胞生長曲線。從圖1可知從3-7天細胞處於指數生長期，並在第3天細胞佔板底約70-80%，為藥物篩選的最佳密度，因此選擇9X10、ells/ml為實驗最適細胞密度，並在第三天進行細胞毒性檢測為最適時間。2、MTT法檢測IFNa-lb及利巴韋林細胞毒性(1)取對數生長期的Huh7.5.1細胞，O.25%胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數後，調整細胞濃度為9X10、ells/ml，鋪於96孔板(lOOiU/well)於37°C5%C02培養，貼壁5h。(2)加入以無血清培養基稀釋的藥物，8個稀釋梯度，每個梯度設三個重複孔，同時設置空白對照(只含培養基)、細胞對照及藥物顏色對照，補加培養基至終體積為200iil/well，將培養板置於37°C5%C02培養。(3)第三天於實驗孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培養箱孵育4h後，吸棄上清，加入1501DMSO，震蕩溶解10min，用酶標儀測各孔0D49。值。(4)計算細胞生長抑制率，及以Gr即hpadPrism5計算IC5。值。(IC5。半數抑制濃度，將細胞生長抑制50%所需的濃度)的值。細胞生長抑制率(％)=(1-B，0D，)x100對照孔OD值。通過細胞生長抑制率，以Gr即hpadPrism5軟體計算得出IFNa-lb無實際細胞毒性，利巴韋林IC5。=20.14iig/ml。表1為IFNa-lb及利巴韋林細胞毒性結果。表lIFNa-lb與利巴韋林細胞IC5。tableseeoriginaldocumentpage6注n.d.:nonedetective.從上述試驗可得出結論本發明利用2a型嵌合病毒J6/JFH1轉染Huh7.5.1細胞產生有感染性的病毒顆粒這一HCV細胞培養體系(HCVcellculture,HCVcc)，利用分析細胞活性、細胞生長增殖的MTT法檢測抗HCV藥物的細胞毒性，計算出藥物對細胞的生長抑制率，通過Gr即hpadPrism5計算得到IC5。。實驗得出最佳實驗細胞密度為9X104cells/ml，正常細胞對照OD，值於O.45-0.55之間，同時IFNa-lb無實際細胞毒性，利巴韋林細胞ICs。為20.14iig/ml。本發明操作簡單、經濟、快速、靈敏、無放射性汙染，並能準確檢測藥物細胞毒性，有較好的重複性，能為體外抗病毒藥效評價的順利進行提供準確的檢測方法。權利要求檢測抗HCV藥物細胞毒性的方法，包括採用MTT法測定細胞生長曲線，確定實驗細胞密度，然後用MTT法檢測IFNα-1b及利巴韋林細胞毒性；利用2a型嵌合病毒J6/JFH1轉染Huh7.5.1細胞產生有感染性的病毒顆粒這一HCV細胞培養體系，利用分析細胞活性、細胞生長增殖的MTT法檢測抗HCV藥物的細胞毒性，計算出藥物對細胞的生長抑制率，通過GraphpadPrism5計算得到IC50。2.如權利要求l所述的方法，其特徵在於用MTT法測定細胞生長曲線，確定實驗細胞密度(1)取對數生長期的Huh7.5.l細胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數後，調整細胞濃度為9X10、ells/ml，鋪於96孔板lOOiU/well;(2)補加培養基至終體積為200iil/well，將培養板置於37°C5%C02培養，每三天補充50-1001新鮮培養基；設3個重複孔，同時設空白調零組；(3)每天於實驗孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培養箱孵育4h後，吸棄上清，加入150ii1DMSO，震蕩溶解10min，用酶標儀測各孔0D49。值；(4)繪製Huh7.5.1細胞生長曲線。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於用MTT法檢測IFNa-lb及利巴韋林細胞毒性步驟為(1)取對數生長期的Huh7.5.l細胞，O.25X胰酶消化，800-1000rpm/mim離心3min，血球計數板計數後，調整細胞濃度為9X10、ells/ml，鋪於96孔板lOOiU/well;(2)加入以無血清培養基稀釋的藥物，8個稀釋梯度，每個梯度設三個重複孔，同時設置只含培養基的空白對照、細胞對照及藥物顏色對照，補加培養基至終體積為200iU/well，將培養板置於37°C5%C02培養箱培養；(3)第三天於實驗孔加入20ii15mg/mlMTT溶液，37°C5%C02培養箱孵育4h後，吸棄上清，加入150ii1DMSO，震蕩溶解10min，用酶標儀測各孔0D49。值；(4)計算細胞生長抑制率，及以Gr即hpadPrism5計算IC5。值，細胞生長抑制率(％)=(1-=)xlOO全文摘要本發明利用2a型嵌合病毒J6/JFH1轉染Huh7.5.1細胞產生有感染性的病毒顆粒這一HCV細胞培養體系(HCVcellculture，HCVcc)，利用分析細胞活性、細胞生長增殖的MTT法檢測抗HCV藥物的細胞毒性，計算出藥物對細胞的生長抑制率，通過GraphpadPrism5計算得到IC50。本發明操作簡單、經濟、快速、靈敏、無放射性汙染，並能準確檢測藥物細胞毒性，有較好的重複性，能為體外抗病毒藥效評價的順利進行提供準確的檢測方法。文檔編號G01N21/31GK101775432SQ20091016325公開日2010年7月14日申請日期2009年12月29日優先權日2009年12月29日發明者馮悅,劉麗,唐穎蕾,夏雪山,魏大巧申請人:昆明理工大學