靶向於組織因子基因的小核酸及其用途的製作方法
2023-07-29 05:50:36 2
專利名稱：靶向於組織因子基因的小核酸及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及靶向於組織因子基因的小核酸的新用途，具體涉及在治療眼底新生血管相關性疾病中的 應用，尤其是治療年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變等由新生血管異常增生引起的眼病。所述小核酸是治療眼底新生血管相關性疾病的藥物中的活性成分。
背景技術：
小幹擾核酸(small interfering RNA, siRNA)是帶有特定基因密碼的短小核酸鹼基片斷，一般功能長度為21 23bp。其作用原理是與特定靶基因mRNA結合，使之降解而失去功能。這種雙鏈RNA分子介導的高效轉錄的基因沉默現象稱之為核酸幹擾(RNAinterference, RNAi),雙鏈RNA進入細胞內先與細胞內的其他成分結合成一個核酸複合體，從而形成RNA誘導沉默複合體(RNA induced silencing complex, RISC);激活的RISC通過鹼基配對定位到同源mRNA上並切割而導致mRNA降解，從而清除細胞內特定的基因表達。siRNA不僅廣泛應用於生物醫學研究，而且可利用其對致病基因的高效特異性抑制的特性設計藥物。微小RNA (microRNA，miRNA)是調節基因表達的21 23個核苷酸長度的單鏈RNA分子。miRNA是由DNA轉錄的基因編碼，但不翻譯成蛋白質的非編碼RNA ；miRNA形成過程是由稱做pri-miRNA原始轉錄本加工成pre-miRNA的短莖環結構,其作用途徑與siRNA相同，pre-miRNA經Dicer酶切割後形成miRNA,進入RISC,通過鹼基互補配對的方式識別革巴mRNA,並根據互補程度的不同指導沉默複合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。研究表明miRNA參與各種各樣的調節途徑，包括發育、病毒防禦、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。成熟的miRNA分子部分互補到一個或多個mRNA分子，它們的主要功能是下調基因的表達。年齡相關性黃斑變性(age-relatedmacular degeneration, AMD)是 50 歲以上的人視力損害的主要原因之一。發達國家的60歲以上人群發病率在10%以上。隨著中國人口老年化，該病的發病率有上升趨勢。AMD病變發生在視網膜的黃斑區。在臨床上分為乾性和溼性兩型，乾性主要由視網膜細胞凋亡引起，表現為視網膜地圖樣萎縮。病程發展慢但不可逆。溼性的病理特徵為脈絡膜新生血管(choroid neovascularization, CNV)伴有大量滲出，病程發展快，但有效抑制脈絡膜新生血管可在一定程度上改善視力。該病早期的病理變化為視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial cells,RPE)功能受損，細胞外基質積聚導致Bruch膜增厚和玻璃膜疣形成。目前認為AMD的發病機制為氧化應激、炎症反應和免疫反應。在特定的致病因子方面，血管內皮細胞生長因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)在促進溼性AMD的CNV形成上起關鍵作用。乾性AMD目前基本無特異治療方法。溼性AMD治療主要針對脈絡膜新生血管。傳統的療法有雷射光凝，光動力療法，手術和放射。但療效不佳。基因泰克公司2005年成功開發出二種抗VEGF抗體,Avastin和Lucentis後,溼性AMD治療發生了很大的改觀。Lucentis以AMD為適應症。Avastin是美國FDA批准用於直腸癌的藥物，適應症並不包括AMD。但由於其結構與Lucentis相似並且價格便宜也在臨床上廣泛使用。這兩種抗VEGF抗體球內注射可減緩相當部分患者的疾病進展及部分改善視力。抗VEGF —直是AMD眼藥的開發的主要思路。在siRNA方面，可表達VEGF短髮夾RNA (short hairpin RNA, shRNA)腺病毒載體可有效抑制VEGF誘導小鼠CNV。小鼠玻璃體腔注射後可有效地沉默高水平的VEGF，從而阻止CNV的形成(Cashman SM等人.I0VS，2006;47:3496-3504)。然而近年來發現VEGF除了病理性地促進CNV的形成外，還有很強的針對非血管細胞的生理性功能。VEGF通過激活VEGF受體2對視網膜節細胞有直接保護作用(Nishijima K等人Am J Pathol.2007;171:53-67)。離體試驗也發現VEGF可減少視網膜節細胞在氧化應激時的損傷。如加入Avastin, VEGF的這種保護作用消失(Brar等人Mol Vis. 2010; 16:1848-53)。這些研究結果提示在臨床上過度直接抑制VEGF可能造成的風險。組織因子(Tissue factor, TF，又稱促凝血酶原激酶、凝血因子III和CD142)屬於二型細胞因子受體超家族，是凝結因子7 (clotting factor VII，FVII)和其活化成分 (FVIIa)的受體。組織因子是一種跨膜單鏈糖蛋白，其由263個胺基酸殘基的位於胞內的羧基端和23個胺基酸殘基的跨膜區，以及胞內219個胺基酸殘基的氨基端組成，其中胞內氨基端含有與 FVII/FVIIa 結合的區域(Chu AJ. Front. Biosci. 11，256-271 (2006))。組織因子在多個器官組織上表達，其中包括眼組織。炎症和氧化應激可刺激組織因子高表達(Cho等人Lab Invest. 2010 Nov I)。已知組織因子與多個AMD的病變的發生機制有關。其中包括細胞凋亡、炎症反應、新生血管和補體激活。Bora等用組織因子抗體有效地抑制7 小鼠模型 CNV 的形成(Bora PS 等人:PNAS. 2003; 100:2679-84)。
發明內容
本發明的目的在於提供一種治療眼底新生血管相關性疾病的新途徑，利用靶向TF基因的小核酸分子來抑制病理狀態下TF基因的異常高表達，以達到抑制新生血管的形成，從而達到治療眼底新生血管相關性疾病的目的。為了達到上述目的，本發明提供了靶向於組織因子基因的小核酸在製備治療眼底新生血管相關疾病的藥物中的應用。所述的小核酸用作藥物的活性成分，小核酸可以是調節TF基因表達的siRNA或微小RNA (microRNA, miRNA)。在一個優選的實施方式中，所述的siRNA分子，其具有如下序列結構
正義鏈5』 -GAGCCUCUGUAUGAGAACUNN-3』 (SEQ ID NO: I)
反義鏈5』 -AGUUCUCAUACAGAGGCUCNN-3』 (SEQ ID NO: 2)
其中，N為胞嘧啶核苷C、鳥嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U ;脫氧胞嘧啶核苷dC、脫氧鳥嘌呤核苷dG、脫氧腺嘌呤核苷dA或脫氧胸腺嘧啶核苷dT。換句話說，該雙鏈siRNA分子的主幹序列為
正義鏈5』 -GAGCCUCUGUAUGAGAACU-3』 (SEQ ID NO: 3)
反義鏈5』 -AGUUCUCAUACAGAGGCUC-3』 (SEQ ID NO: 4)。在一個優選的實施方式中，上述序列中3』端的「NN」是兩個脫氧胸腺嘧啶核苷dT。所述的眼底新生血管相關疾病為新生血管異常增生相關疾病。所述的新生血管異常增生相關疾病為年齡相關性黃斑變性和糖尿病視網膜病變中的至少一種。本發明經篩選的靶向TF基因的小核酸分子可抑制病理狀態下TF基因異常高表達，玻璃體腔注射後不僅可減少TF基因引起的細胞凋亡，從而防止AMD向乾性方面發展；還可以阻斷TF基因引起的CNV形成，從而防止溼性AMD的形成。靶向TF基因的小核酸的使用可避免對VEGF的過度直接抑制可能引起的副作用。因此靶向TF基因的小核酸可望治療眼底新生血管相關性疾病。
圖I是提純的不同實驗組的細胞總RNA電泳檢測圖，實驗組分別為TF_sl轉染組、TF_s2轉染組、TF_s3轉染組和正常組。圖2為實施例I中不同實驗組TF基因的mRNA相對表達量柱形圖，橫坐標表示各處理實驗組，縱坐標表示TF基因相對看家基因GAPDH的mRNA相對表達量。 圖3為實施例2中不同實驗組TF基因的mRNA相對表達量柱形圖，橫坐標表示各處理實驗組，縱坐標表示TF基因相對看家基因GAPDH的mRNA相對表達量。
具體實施例方式為方便起見，本發明中提及的術語「小核酸」或「小核酸分子」，應當理解，它們表示的意思和範圍相同。本文中術語「組織因子」、「組織因子基因」或「TF基因」，應當理解，它們表示的意思和範圍相同。本發明中，術語「小核酸」是指具有基因調節功能的siRNA或miRNA。本發明所述的眼底新生血管相關性疾病包括年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變等。因此，包含上述小核酸分子的製備治療眼底新生血管相關性疾病的藥物的劑型可以為多種形式，只要適合於相應疾病的給藥、並且恰當地保持小核酸分子的活性。比如，對於注射用給藥系統，劑型可以是凍乾粉。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學可接受的輔助劑，只要其適合於相應的給藥體系、並且恰當地保持小核酸分子的活性。比如，在臨床使用中，對於眼科用藥，可以將本發明的小核酸溶於不含有RNA酶的無菌水中，輕輕混勻後眼內玻璃體腔注射。以下在人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)中，用靶向TF基因的siRNA分子，對本發明進行詳細描述。應理解，下述實施例僅用於闡明本發明，並非是對本發明進行限制。實施例I
IARPE-19細胞培養
ARPE-19 細胞在含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基(美國 Invitrogen 公司)，37°C、5% CO2培養箱(美國Thermo公司)中培養。2 siRNA設計與合成
設計靶向TF基因的siRNA序列。根據美國NCBI資料庫中的TF基因序列(NCBI庫號NM_001993)，用siRNA設計軟體設計3對siRNA，並由百奧邁科生物技術有限公司合成，將正義鏈和對應的反義鏈退火成siRNA雙鏈，轉染前配置成濃度為20 u M0序列如下
權利要求
1.靶向於組織因子基因的小核酸在製備治療眼底新生血管相關疾病的藥物中的應用。
2.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述的小核酸為siRNA。
3.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述的小核酸為miRNA。
4.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的siRNA，其具有如下序列結構 正義鏈5』 -GAGCCUCUGUAUGAGAACUNN-3』 反義鏈5』 -AGUUCUCAUACAGAGGCUCNN-3』 其中，N為胞嘧啶核苷C、鳥嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U、脫氧胞嘧啶核苷dC、脫氧鳥嘌呤核苷dG、脫氧腺嘌呤核苷dA或脫氧胸腺嘧啶核苷dT。
5.如權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述的眼底新生血管相關疾病為新生血管異常增生相關疾病。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的新生血管異常增生相關疾病為年齡相關性黃斑變性和糖尿病視網膜病變中的至少一種。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述的藥物是眼科用藥。
全文摘要
本發明涉及靶向於組織因子(TissueFactor,TF)基因的小核酸及其用途，具體涉及其在製備治療眼底新生血管相關疾病的藥物中的應用。所述的眼底新生血管相關疾病尤其是指治療年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變等由新生血管異常增生引起的眼病。本發明經篩選的靶向TF基因的小核酸分子可抑制病理狀態下TF基因異常高表達，玻璃體腔注射後不僅可減少TF基因引起的細胞凋亡，從而防止AMD向乾性方面發展；還可以阻斷TF基因引起的CNV形成，從而防止溼性AMD的形成。靶向TF基因的小核酸的使用可避免對VEGF的過度直接抑制可能引起的副作用。因此靶向TF基因的小核酸可望治療眼底新生血管相關性疾病。
文檔編號A61P27/02GK102727513SQ20111009473
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月15日 優先權日2011年4月15日
發明者唐小軍, 庹旌生, 朱遠源, 李鐵軍 申請人:百奧邁科生物技術有限公司