Nanog抑制型突變體及其在Nanog功能研究中的應用的製作方法

2024-01-26 02:07:15

專利名稱：：Nanog抑制型突變體及其在Nanog功能研究中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及Nanog抑制型突變體的構建、表達以及其在Nanog的功能研究中的用途，所述Nanog是一個Homeobox家族基因，可以不依賴於LIF而維持胚胎幹細胞的多能性，是在幹細胞的多能性、自我更新及重編程過程屮起重要作用的轉錄因子。
背景技術：
：胚胎幹細胞(Embryonicstemcells,ES細胞)來自於哺乳動物的胚泡(Blastocyst)的內細胞團(InnerCellMass,ICM)，是最為原始的幹細胞，具有發育的多能性。ES細胞區別丁-其他的細胞最基本的生物學特性，主要有三個第一，ES具有多能性(pluripotency),所謂多能性即ES細胞具有多向的分化潛力，首先它可以分化為內胚層、中胚層和外胚層二個胚層的細胞，進而分化成各種各樣的細胞類型；第二，具有自我更新的能力或者無限增殖能力(self-renewal);第三，具有整合的能力，即將ES細胞注射到早期發育的胚胎中，ES細胞可以整合到胚胎中並可隨胚胎一起發育，能分化成為任何的組織並形成嵌合體(MintzB，等人，(1975)ProcNatlAcadSciUSA,72:3585-3589;川menseeK,等人，(1976)ProcNatlAcadSciUSA,73:549-553;EvansMJ，等人，(1981)，Nature,292:154-156)。研究ES細胞維持自我更新能力和分化潛能的分子機制非常重要，也是胚胎幹細胞能應用於臨床的基礎。因此，基於幹細胞這種全能性或多能性特性的療法是現在許多待解決疾病(例如帕金森氏病)的一種很有前景的解決方案。但是，在將人的ES細胞安全和有效地應用到治療人類疾病之前，我們必須克服人ES帶來的很多難以克服的障礙。目前，ES細胞的基礎生物學研究還不是很清楚，需要進一步深入地了解幹細胞具有這種全能性或者多能性的分子機制。幹細胞的多能性以及自我更新能力的維持，需要多條信號通路以及各種轉錄因子來協調。其中，維持小鼠ES細胞的多能性的轉錄因子包括Oct4、Sox2、FoxD3和Nanog(Pan,G.,等人，(2006)FasebJ20(10)，1730-1732;Boyer,L.A"等人，(2005)Cell122(6)，947-956;Mitsui,K.，等人，(2003)Cell113(5)，631-642;Chambers,I.,等人(2003)Cell113(5),643-655),但是關於幹細胞維持多能性及自我更新的分子機制還不是很清楚。在這些轉錄因子中，小鼠Nanog,是第一個被發現在高表達的情況下可以在不需要LIF通路的情況下維持小鼠幹細胞的多能性(Mitsui,K.，等人，(2003)Cell113(5)，631-642;Chambers,l.,等人(2003)Cell113(5),643-655)。小鼠Nanog蛋白是由305個胺基酸組成，並且包含有一個Homeobox保守結構域。Nanog的表達模式和Oct3/4很相似，也只是在多能性幹細胞中表達，而在分化的成熟細胞中完全消失(Mitsui,K.,等人，(2003)Cell113(5))。在小鼠胚胎發育的過程中，Nanog的表達會隨著這些多能性細胞的分化而逐漸下降(Chambers,I.,等人(2003)Cell113(5),643-655)。Nanog被認為在維持ICM和ES多能性發麵發揮著決定性的作用。Oct3/4是通過阻止ICM和ES細胞向滋養外胚層方向分化來維持其多能性。與Oct3/4的作用模式略有不同，Nanog不僅可以獨立阻止ES細胞向內胚層方向分化，而且還可以主動的維持多能性(Mitsui,K.,等人，(2003)Cell113(5))。Nanog敲除的小鼠胚胎由於缺少epiblasts而不能發育到囊胚階段(Mitsd,K.，等人，(2003)Cell113(5))。Nanog敲除的ES對於小鼠的ES細胞而言，Nanog最重要的角色就是高表達的Nanog可以不依賴於外源性信號因子Lif而維持多能性，表明Nanog可能是外源性信號因子的主要的下遊作用基因。作為一個維持ES細胞多能性的重要轉錄因子，小鼠Nanog只有進入細胞核才能發揮作用，但是至於Nanog的進核機制至今還沒有人報導。在此我們證明了核定位信號突變的Nanog發揮著抑制型突變體的功能，影響野生型Nanog的核定位和轉錄激活能力，這可以為一個非常有用的抑制型工具來研究小鼠Nanog的功能。
發明內容本發明涉及通過將位於Nanog保守結構域Homeobox(序列見SEQIDNO:2)中的核定位信號1和/或2突變成無關序列，破壞其功能，來得到抑制型Nanog突變體，其中所述突變體仍然具有與野生型Nanog形成異源二聚體的能力，並且抑制了野生型Nanog的轉錄激活功能，作為抑制型突變體而發揮功能，因此可能作為一個非常有用的抑制型工具來研究小鼠Nanog的功能。圖1:顯示了小鼠Nanog野生型和核定位信號突變體的具體信息。野生型的小鼠Nanog構建到pCR3.1載體中，然後利用點突變將所指示的目的胺基酸進行突變。圖2:顯示了將小鼠Nanog和核定位信號突變體轉染到細胞中，利用蛋白雜交檢測到的蛋白表達情況。圖3:顯示了將小鼠Nanog和核定位信號突變體轉染到細胞中，利用特定的抗體進行免疫螢光檢測，利用雷射共聚焦顯微鏡觀察其在細胞內的定位情況。圖4:顯示了非多能性細胞HEK293T及多能性細胞P19和F9中，核定位信號突變的小鼠Nanog喪失了激活p5N報告基因的能力。在24孔板培養的HEK293T，P19，F9細胞中，分別共轉染p5N報告基因載體(0.2微克)和對照載體(0.4微克,lane1)、野生mNanog(0.4微克，lane2)、1突變mNanog(0.4微克，lane3)、2突變mNanog(0.4微克，lane4)以及雙突變mNanog(0.4微克，lane5)後24小時測量分析的結果。圖5:顯示了核定位信號突變的小鼠Nanog仍然具有與野生型Nanog形成二聚體的能力。在6釐米培4養皿中培養的HEK293T細胞中，分別共轉染野生Nanog-myc(4微克)、1突變Nanog-myc(4微克,)、2突變Nanog-myc(4微克)以及雙突變Nanog-myc(4微克)同帶有Flag標籤的野生Nanog-F，或者是載體。轉染48小時後，用TNE裂解液裂解細胞，並且用抗FLAG的樹脂柱子進行蛋白質的富集，然後進行蛋白檢測。圖6:顯示了將核定位信號突變體與野生型Nanog共同轉染後，利用特定的抗體進行免疫螢光染色，利用雷射共聚焦顯微鏡觀察突變體對野生型小鼠Nanog細胞定位的改變情況。圖7:顯示了非多能性細胞HEK293T及多能性細胞P19和F9中，核定位信號突變的小鼠Nanog對於野生小鼠Nanog激活p5N報告基因的能力的抑制作用。在24孔板培養的HEK293T、P19、F9細胞中，分別共轉染p5N報告基因載體(每個孔0.2微克)、野生mNanog(每個孔0.4微克)和對照載體(每個孔0微克、0.2微克、0.4微克或者0.8微克)、1突變mNanog(每個孔0.2微克或者0.4微克)、2突變mNanog(每個孔0.2微克或者0.4微克)以及雙突變mNanog(每個孔0.2微克或者0.4微克)後24小時測量分析的結果。具體實施例方式如上文所述，本文中使用的Nanog蛋白質是Homeobox家族的一員，在Nanog敲除的小鼠胚胎由於缺少epiblasts而不能發育到囊胚階段(Mitsui,K.,等人，(2003)Cell113(5))。小鼠Nanog過表達的情況下可以不依賴於LIF而維持胚胎幹細胞的多能性，因此在維持胚胎幹細胞中所起的重要作用(Mitsui,K.,等人，(2003)Cell113(5),631-642;Chambers,T.,等人(20(B)Cell113(5),643-655)。本文中使用的Nanog基因可以來自包含其的任何動物，優選來自哺乳動物，最優選來自小鼠。在Nanog中具有一個保守結構域，被稱為"同源異型框(Homeobox)"，其在大多數來源的動物中都是保守的，在這個保守結構域的兩端各有一個核定位信號(NuclearLocalizationSignal,NLS)。例如，在小鼠中，這兩個核定位信號分別為RKQKMR(SEQIDNO:6)和RMKCKR(SEQIDNO:7)。如本領域技術人員眾所周知的，核定位信號是負責將蛋白質由細胞質定位到細胞核內的信號肽序列。在本申請中，通過將核定位信號序列進行失功能突變，即將其符合讀框地突變成為無功能的信號序列，可以使得突變的Nanog蛋白質喪失完全定位在細胞核中的能力，即會有部分滯留在整個細胞質中。所述失功能突變例如可以是將Nanog的NLS序列通過取代突變成無關序列，或者通過缺失和/或添加。優選地，將所述NLS序列進行定點突變成為無關序列。最優選地，無關序列為GIQNMQ(由NLS1突變得來)，或者GMNVDG(由NLS2突變得來)。可以將兩個NLS序列的仟一突變(例如突變的核酸如SEQIDNO:8或SEQIDNO:9所示)，也可以將二者都突變(例如突變的核酸如SEQIDNO:10所示)，這都將影響Nanog的核定位能力，同時影響Nanog的轉錄激活功能。本發明還涉及製備包含能夠表達上述突變蛋白質3的核酸的表達質粒的方法，所述方法包括(a)使用適當的表達載體構建野生型Nanog基因的真核表達質粒；(b)將(a)中構建的質粒進行目的胺基酸的點突變得到突變休；(c)轉染(a)和(b)得到的質粒到細胞中，並檢測其在細胞中的表達；(d)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因在細胞內定位上進行比較；(e)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因在細胞中的轉錄激活能力上進行比較；(f)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因共同轉染，檢測(b)中得到的突變體對(a)中得到的野生型基因的細胞內定位的影響；(g)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野牛型基因共同轉染，在細胞中檢測(b)中得到的突變體存在時，對於(a)屮得到的野生型基因的轉錄激活能力的影響；(h)選擇對於野生型Nanog的細胞內定位以及轉錄激活能力具有影響的突變體。本文中使用的術語"適當的表達載體"包括可以表達蛋白質的任何可商購的載體，優選本領域熟知的修飾過的真核表達載體pCR3.1(JiangA等人，(2003)J.Biol.Chem278,38765-71)。本文中所述的"細胞"可以是能夠獲得的任何細胞，包括具有多能性的和非多能性的細胞，其中所述多能性細胞優選是小鼠畸胎瘤細胞，特別是pl9細胞(pl9細胞來源自小鼠畸胎瘤細胞，McBumeyMW等人，(1982)Dev.Biol89:503-508)和F19細胞(F9細胞來源自小鼠畸胎瘤細胞，StricklandS等人，(1978)Cell15:393-403),所述非多能性細胞優選是本領域技術人員熟知的HEK293T細胞。可以通過本領域已知的任何手段轉染,多能性細胞和多能性細胞，例如脂質體轉染、病毒(例如腺病毒)介導的轉染、電穿孔等。優選地使用脂質體轉染技術。可以使用本領域熟知的各種方法檢測蛋白質在細胞中的表達以及核定位情況，例如通過Western印跡檢測蛋白質表達，通過免疫螢光實驗檢測蛋白質在細胞中的定位。通過使用我們以前研究中設計的p5N報告基因(其是一段人造重複序列連接在螢光素酶基閒前)(Pan,G.J.和Pei,D.Q.(2005)JBiolChem280:1401-1407),利用報告基因檢測系統，可以檢測Nanog以及其突變體對於p5N報告基因的激活情況，從而驗證它們的轉錄激活能力，以下的實施例中表明，核定位信號突變後的Nanog蛋白質幾乎完全喪失了激活p5N報告基因的轉錄激活能力。除了螢光素酶基因外，本領域技術人員已知也可以使用其它報告基因用於指示Nanog的活性，例如胭脂鹼合成酶基因(nos)、章魚鹼合成酶基因(ocs)、新黴素磷酸轉移酶基因(nptll)、氯黴素乙醯轉移酶基因(cat)、慶大黴素轉移酶基因、葡萄糖苷酶基因。另外，近來的研究表明，一系列可能被Nanog調控的基因，例如Rexl，Oct4等，也可以代替上述人造重複序列用於檢測Naong的轉錄激活活性(ShiW丄等人，(2006)JBiolChem281:23319-23325;ZhangX.F.等人，(2008)JBiolChem283:35825-35833)。本文所使用的遺傳工程的方法包括本領域已知的任何方法，如分子克隆技術、蛋白雜交技術、雙螢光報告系統活性檢測、免疫螢光反應檢測等，這些方法4在Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗指南，第3版(2002);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F,M.Ausubel等人編著(1987))等多種參考文獻中均有詳細的描述。另外，由於上文中已經描述了，本文中製備的核定位信號突變體(NLS1突變體，NLS2突變體以及NLS1/NLS2突變體)能夠影響Nanog的正常核定位，並且一定程度上抑制的野生型Nanog的轉錄激活能力。因此，該突變體的構建，可以作為一個很好的抑制型工具，為我們研究Nanog是如何行使作為轉錄因子的功能，以及它如何不需要LIF的情況下維持小鼠胚胎幹細胞的多能性提供了借鑑意義。因此，本發明還涉及使用本發明的突變體作為抑制型工具研究Nanog功能的方法，以及其用於研究Nanog功能的用途。實施例下列實施例例舉了發明人的標準實驗室實踐，用於示例本發明的模式，而不應將本發明理解為限定於這些實施例的範圍。這些實施例。根據本文公開和本領域技術人員的普遍水平，技術人員將理解下列僅用於示例，可以在不超過本發明的範圍內進行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術，除非特別說明，均是本領域技術人員熟知的分子生物學、細胞生物學、生物化學等各個領域的常規技術。實施例l:多能性細胞系的培養小鼠多能性細胞系(P19及F9細胞)培養在0.1。/。明膠包被基質上，用添加了15。/。胎牛血清FBS(GIBCO)的培養基在37'C培養箱屮培養(參見Pan,G等人，(2005)JBiolChem280(2)，1401-1407)。實施例2:Nanog載體(SEQIDNO:l)的構建用終體積為20ul的反應體系逆轉錄2ug的總RNA(參見Pan，G等人，(2006)FasebJ20(10),1730-1732)，得到cDNA文庫。利用表l的引物擴增小鼠N肌og片段，然後用瓊脂糖凝膠電泳回收。表1:克隆Nanog片段的引物tableseeoriginaldocumentpage7通過在pCR3.1載體的多克隆位點EcoRV插入PCR片段構建真核表達質粒，即在37'C下通過EcoRV酶切pCR3.1載體(以下簡稱載體)4小時，然後將從多能性細胞cDNA中擴增的小鼠Nanog片段，在連接酶的存在下16'C連接4小時，得到野生型小鼠Nanog的真核表達載體。實施例3:核定位信號序列突變的小鼠Nanog真核表達載體的構建通過PSORTlI軟體預測整個小鼠Nanog的胺基酸序列(SEQIDNO:5)後，我們發現在其保守Homeobox結構域的氨基端和羧基端分別具有一個核定位信號(NuclearLocalizationSignal,NLS)，即核定位信號l(NLS1，RKQKMR，SEQIDNO:6)和核定位信號2(NLS2，RMKCKR，SEQIDNO:7)。我們利用分子生物學手段(點突變PCR技術)，利用表2的特定的突變引物進行定點突變，將核定位信號l和核定位信號2分別突變為無關的序列一GIQNMQ和GMNVDG，如圖1所示，得到目的突變體，S卩l突變mNanog(SEQIDNO:8)，2突變mNanog(SEQIDNO:9)和雙突變mNanog(SEQIDNO:10)。表l:小鼠Nanog抑制型突變體所用PCR引物:SEQIDNO引物名稱序列(5'3')SEQIDNO:11NLS1RK/GI突變-正義鏈ggagaacaaggtccttgccgggatccagaagatgcggactgtgttctcSEQIDNO:12NLSlRK/GI突變-反義鏈gagaacacagtccgcatcttctggatcccggca3ggaccttgttctccSEQIDNO:13NLS1KMR/NMQ突變-正義鏈ggtccttgccaggaagca肌catgcagactgtgttctctc3ggcccSEQUDNO:14NLS1KMR/NMQ突變-反義鏈gggcctgagagaacacagtctgcatgtttgcttcctggcaaggaccSEQIDNO:15NLS2RMK/GMN突變-正義鏈cctggtttcaaaaccaagggatgaactgcaagcggtggcagSEQIDNO:16NLS2RMK/GMN突變-反義鏈ctgccaccgcttgcagttcatcccttggttttgaaaccaggSEQIDNO:17NLS2CKR/VDG突變-正義鏈ggtttcaaaaccaaaggatgaaggtcgacgggtggcagaaaaaccagtggSEQIDNO:18NLS2CKR/VDG突變-反義鏈ccactgg腦ctgccacccgtcgaccttcatcctttggttttgaaacc實施例4:Westem印跡反應檢測野生型Nanog及其突變體的表達將構建正確的野生小鼠Nanog和核定位信號的突變體對於蛋白質印跡分析(參見PanGuangjing等人,(2005)JBiolChem280(2)，1401-1407)將上述裂解的細胞系用PBS洗滌，用RIPA緩衝液(50mMTris-HCL,pH7.5，150mMNaCl，0.25°/。脫氧膽酸鈉，0.1%NP40，0.1%TritonX-100)在冰上裂解10分鐘後超聲，並15000rpm4'C離心15分鐘去掉細胞殘骸。加入等體積2xSDS上樣緩衝液煮沸5分鐘後，細胞裂解液用10%SDS-PAGE電泳分離並轉移到PVDF膜上(Millipore，MA)。上述膜用5%脫脂牛奶封閉並用小鼠抗Nanog抗體(l:1000,ABCAM，批號237819)孵育3小時，再用辣根過氧化物酶偶聯的抗小鼠二抗(1:5000,Sigma，St丄ouis，MO)孵育1小時。然後用TBS和TBST交替洗滌上述膜各三次，每次5分鐘。最後用化學發光顯色法進行顯影。從圖2中可以看出，野生mNanog及l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog都可以很好的表達，足以進行其他實驗驗證。實施例5:野生Nanog及突變體在細胞內的定位在分析Nanog及其突變體在細胞內定位的實驗中，我們首先利用Lipofectamine2000(InvitrogenCA，USA)瞬時轉染野生型Nanog及l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog。24小時後，我們將轉染後細胞培養基吸掉，用PBS清洗1次；然後加入適量含有4%多聚甲醛的固定液，室溫固定30分鐘；用8含有2毫克/毫升甘氨酸的PBS溶液，室溫放置5niin淬滅醛基吸掉固定液，加入還有0.2^TritonX-100的PBS;室溫放置10分鐘來透化細胞，用PBS洗2次；用含有10%正常羊血清(NormalGoatSerum，NGS)的PBS，室溫封閉60分鐘；用稀釋到含有2XNGS的PBS中的一抗室溫孵育60分鐘或者4'C過夜；然後ffl洗液搖蕩清洗玻片5次，每次5分鐘；將TRITC標記的二抗稀釋到含有2XNGS的PBS中，室溫孵育60分鐘；用洗液清洗玻片5次，每次5分鐘用含有0.1-1毫克/毫升DAPI的PBS染細胞核1分鐘後，放置十PBS中，用封片液或者90%的甘油封片後，放置片盒中備用。雖然野生型和突變體在細胞內都產生能用蛋白質雜交檢測到到的完整的蛋白質(圖2),但二者在細胞水平上的定位卻有很大差異。如圖3所示，野生型Nanog蛋白(a)完全定位在細胞核中，而將核定位信號序列突變後的三個突變體蛋白(l突變mNa加g,b;2突變rnNanog，c;雙突變mNanog,d)卻有部分蛋白滯留在整個細胞質中。這些初步結果表明，Nanog蛋白中的兩個NLS序列對於Nanog的正確核定位至關重要。實施例6:野生Nanog及突變體對報告基因p5N的激活我們以甜的研究已經表明，Nanog對我們所構建的p5N報告基因(以下簡稱報告基因)有十幾倍的激活作用(和空載體相比)，該p5N報告基因可以用以檢測Nanog的活性(Pan，GJ.和Pei，D.Q.(2005)JBiolChem280:1401-1407)。在本實施例的圖4巾，我們首先驗證了我們所構建的小鼠野生mNanog可以很好的激活自身的p5N報告基因，即在非多能性細胞HEK293T細胞中可以激活p5N報告基因10倍左右，在多能性細胞P19中可以激活p5N報告基因16倍左右，而在多能性細胞F9中可以激活p5N報告基因40倍左右。其次，我們驗證了在所用到的非多能性細胞系和多能性細胞系中，所構建的突變體(l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變inNanog)兒乎完全喪失了激活p5N報告基因的能力。在報告基因分析中，種植在24孔板中的HEK293T非多能性細胞系和P19、F9多能性細胞系用Lipofectamine2000anvitrogenCA,USA)瞬時轉染p5N報告基因(每孔0.2微克)和效應質粒(effectorplasmid)(每孔0.4微克)，參見生產商的說明書。同時共轉染pCMV-Renilla質粒(每24孔板共轉染2納克，Promega，WI)作為內參，並且所有孔轉染的DNA總量用載體補齊。36小時後，細胞用PBS洗滌，並用50微升的lxPLB緩衝液(Promega，WI)裂解。用雙重螢光素酶報告基因分析系統(Promega，CA)和TD2020光度計(TurnerDesign,CA)測量螢光素酶活性。每個轉染都成對進行，並至少重複五次。由圖4可以看出，將小鼠Nanog的核定位信號序列突變後，無論是一個突變還是兩個都突變，突變體對於p5N報告基因都完全喪失了激活能力，這在研究Nanog的功能研究中有深遠的意義，說明了保守Homeobox結構域對於小鼠Nanog作為轉錄因子是很重要的。實施例7:核定位信號序列的突變不影響Nanog形成二聚體的能力文獻報導顯示Nanog可以通過羧基端形成同源二聚體(WangJ等人，(2008)PNAS105:8801-8802)。9為闡明兩個NLS序列是否會影響Nanog形成二聚體的能力，我們進行了免疫共沉澱實驗。我們將帶有Flag標籤的Nanog與帶有Myc標籤的野生型Nanog(野生Nanog-F)及NLS突變體Nanog的表達質粒(l突變Nanog-myc、2突變Nanog-myc以及雙突變Nanog-myc)進行共轉染後，利用抗Flag的樹脂柱子進行免疫沉澱。我們知道帶有Flag標籤的Nanog蛋白會與抗Flag的樹脂柱子結合而被沉澱下來，而帶有myc標籤的蛋白如果不是和帶有Flag標籤的Nanog蛋白相互作用的話就不會被沉澱下來，若帶有myc標籤的NLS突變體Nanog能夠與帶Flag標籤的Nanog形成二聚體則也會同時被沉澱出來。然後用抗myc的抗體進行免疫印跡來檢測沉澱產物，我們就會發現如果一.者能發生相互作用就可以檢測到一條目的條帶，反之則沒有任何條帶。如圖5所示，野生型Nanog能夠與含有myc標籤的野生型Nanog形成二聚體，在免疫沉澱產物中檢測到一條帶(lane14),說明該系統能夠成功檢測Nanog是否如文章報導能形成同源二聚體。在同樣條件下，我們分別驗證了l突變Nanog、2突變Nanog以及雙突變Nanog與帶FIag標籤的野生型Nanog能形成二聚體。這些結果表明，這兩個NLS序列在突變後並不影響Nanog形成二聚體的能力實施例8:突變體Nanog影響野生型Nanog在細胞內的定位既然核定位信號突變體Nanog本身影響了Nanog的核定位情況，並且使其本身喪失了轉錄激活功能，同時並不影響Nanog形成二聚體的能力。為了驗證這些突變體是否通過與野生Nanog相互作用而幹擾野生型Nanog的核定位，我們在將含有GFP標籤的野生型Nanog分別和含有myc標籤的核定位信號突變體Nanog(1突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog)共同轉染到Hela細胞中，進行實施例5中的免疫螢光實驗，來觀察這些突變體是否會影響野生型小鼠Nanog的核定位情況。發明人驚奇地發現由於核定位信號突變體的原因，野生型Nanog的一部分蛋白被滯留在細胞質中(比較，圖6中a，b，c，d)。這個實驗結果表明核定位信號突變體一l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog影響了小鼠Nanog的正常核定位。實施例9:突變體Nanog影響野生型Nanog對p5N報告基因的激活能力同樣，核定位信號突變體Nanog本身影響了野生型Nanog的核定位情況，由於突變體Nanog本身喪失了轉錄激活功能，同時並不影響Nanog形成二聚體的能力。為了驗證這些突變體是否通過與野生Nanog相互作用而影響野生型Nanog的轉錄激活能力。在本實施例中，我們將突變型Nanog(l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog)與野生型Nanog在p5N報告基因的存在下共同轉染，然後進行p5N報告基因激活能力的分析(如實施例6)，來驗證NLS突變體Nanog是否能影響野生型Nanog的轉錄激活功能。結果如圖7所示，不管是在非多能性細胞HEK293T細胞中還是在多能性細胞P19和F9細胞中，在野生型Nanog的量保持一致的基礎上，隨著突變體轉染劑量的增加，野生型小鼠Nanog激活p5N報告基因的能力受到一定程度的抑制(比較lane2-8)。這表明，突變體Nanog(l突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog)能夠影響野生Nanog的轉錄激活能力。通過以上的實驗，我們得出核定位信號突變體一1突變mNanog、2突變mNanog、雙突變mNanog,一方面喪失了各自的轉錄激活功能及正常的核定位；另一方面，通過和野生型Nanog的相互作用來幹擾抑制野生型Nanog的正常核定位和激活p5N報告基因S的能力，因而發揮著抑制型突變體的功能。因此，可以作為很有力的小鼠Nanog的抑制型工具，方便Nanog的功能研究。序列表<110〉清華大學中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院〈120〉Nanog抑制荊突變體及其在Nanog功能研究中的應W參考33<170〉Patentln版本3.3<210〉1<211〉918DNA小鼠(Musmusculus)<220〉Nanog基閃1atgagtgtgggtcttcctggtccccacagtttgcctagttctgaggaagcatcgaattct60gggaacgcctcatcaatgcctgcagtttttcatcccgagaactattcttgcttacaaggg120tctgctactgagatgctctgcacagaggctgcctctcctcgcccttcctctgaagacctg180cctcttcaaggcagccctgattcttctaccagtcccaaacaaaagctctcaagtcctgag240gctgacaagggccctgaggaggaggagaacaaggtccttgccaggaagcagaagatgcgg300actgtgttctctcaggcccagctgtgtgcactcaaggacaggtttcagaagcagaagtac360ctcagcctccagcagatgcaagaactctcctccattctgaacctgagctataagcaggtt420aagacctggtttcaaaaccaaaggatgaagtgcaagcggtggcagaaaaaccagtggttg480aagactagcaatggtctgattcagaagggctcagcaccagtggagtatcccagcatccat540tgcagctatccccagggctatctggtgaacgcatctggaagcctttccatgtggggcagc600cagacttggaccaacccaacttggagcagccagacctggaccaacccaacttggaacaac660cagacctggaccaacccaacttggagcagccaggcctggaccgctcagtcctggaacggc720cagccttggaatgctgctccgctccataacttcggggaggactttctgcagccttacgta780cagttgcagcaaaacttctctgccagtgatttggaggtgaatttggaagccactagggaa840agccatgcgcattttagcaccccacaagccttggaattattcctgaactactctgtgact900ccaccaggtgaaatatga918<210〉2<211〉61<212〉PRT小鼠NanogHomeobox結構域蛋白質〈400〉2ArgLysGinLysMetArgThrValPheSerGinAlaGinLeuCysAlaLeuLysAspArg15101520PheGinLysGinLysTyrLeuSerLeuGinGinMetGinGluLeuSerSerlieLeuAsn25303540LeuSerTyrLysGinValLysThrTrpPheGinAsnGinArgMetLysCysLysArgTrpGin45505560328薩引物<400〉3accatgagtgtgggtcttcctggtcccc28425腿引物134ctctgtgactccaccaggtgaaata25<211〉〈213>5305PRT小鼠<220〉<221〉Nanog蛋白質5MetSerValGlyLeuProGlyProHisSerLeuProSerSerGluGluAlaSerAsnSer15101520GlyAsnAlaSerSerMetProAalValPheHisProGluAsnTyrSerCysLeuGinGly25303540SerAlaThrGluMetLeuCysThrGluAalAlaSerProArgProSerSerGluAspLeu45505560ProLeuGinGlySerProAspSerSerThrSerProLysGinLysLeuSerSerProGlu65707580AlaAspLysGlyProGluGluGluGluAsnLysValLeuAlaArgLysGinLysMetArg859095100ThrValPheSerGinAalGinLeuCysAlaLeuLysGluArgPheGinLysGinLysTyr105110115120LeuSerLeuGinGinMetGinGluLeuSerSerlieLeuAsnLeuSerTyrLysGinVal125130135140LysThrT卬PheGinAsnGinArgMetLysCysLysArgTrpGinLysAsnGinTrpLeu14515015516014LysThrSerAsnGlyLeulieGinLysGlySerAlaProValGluTyrProSerlieHis165170175180CysSerTyrProGinGlyTyrLeuValAsnAalSerGlySerLeuSerMetTrpGlySer185190195200GinThrTrpThrAsnProThrTrpSerSerGinThrTrpThrAsnProThrTrpAsnAsn205210215220GinThrTrpThrAsnProThrTrpSerSerGinAlaTrpThrAlaGinSerTrpAsnGLy225230235240GinProTipAsnAlaAlaProLeuHisAsnPheGlyGluAspPheLeuGinProTyrVal245250255260GinLeuGinGinAsnPheSerAlaSerAspLeuGluValAsnLeuGluAlaThrArgGlu265270275280SerHisAlaHisPheSerThrProGinAlaLeuGluLeuPheLeuAsnTyrSerValThr285290295300ProProGlyGlulie*30566PRT小鼠Nanog核定位信號1蛋白質6ArgLysGinLysMetArg15〈210〉76PRT〈213〉小鼠Nanog核定位信號2蛋白質7ArgMetLysCysLysArg158918〈212>DNA小鼠(Musmusculus)1突變mNanog基因8atgagtgtgggtcttcctggtccccacagtttgcctagttctgaggaagcatcgaa/ttct60gggaacgcctcatcaatgcctgcagtttttcatcccgagaactattcttgcttacaaggg120tctgctactgagatgctctgcacagaggctgcctctcctcgcccttcctctgaagacctg180cctcttcaaggcagccctgattcttctaccagtcccaaacaaaagctctcaagtcctgag240gctgacaagggccctgaggaggaggagaacaaggtccttgccgggatccagaacatgcag300actgtgttctctcaggcccagctgtgtgcactcaaggacaggtttcagaagcagaagtac360ctcagcctccagcagatgcaagaactctcctccattctgaacctgagctataagcaggtt420aagacctggtttcaaaaccaaaggatgaagtgcaagcggtggcagaaaaaccagtggttg480aagactagcaatggtctgattcagaagggctcagcaccagtggagtatcccagcatccat540tgcagctatccccagggctatctggtgaacgcatctggaagcctttccatgtggggcagc600cagacttggaccaacccaacttggagcagccagacctggaccaacccaacttggaacaac660cagacctggaccaacccaacttggagcagccaggcctggaccgctcagtcctggaacggc720cagccttgga3tgctgctccgctccataacttcggggaggactttctgcagccttacgta780cagttgcagc犯朋cttctctgcc3gtgstttgg3ggtgaatttgg犯gccactaggg朋840agccatgcgcattttagcaccccacaagccttggaattattcctgaactactctgtgact900ccaccaggtgaaateitga918〈210>9小鼠(Musmusculus)<220〉〈221〉2突變mNanog基因〈400〉9atgagtgtgggtcttcctggtccccacagtttgcctagttctgaggaagcatcgaattct60gggaacgcctcatcaatgcctgcagtttttcatcccgagaactattcttgcttacaaggg120tctgctactgagatgctctgcacagaggctgcctctcctcgcccttcctctgaagacctg180cctcttcaaggcagccctgattcttctaccagtcccaaacaaaagctctcaagtcctgag240gctgacaagggccctgaggaggaggagaacaaggtccttgccaggaagcagaagatgcgg300actgtgttctctcaggcccagctgtgtgcactcaaggacaggtttcagaagcagaagtac360ctcagcctccagcagatgcaagaactctcctccattctgaacctgagctataagcaggtt420aagacctggtttcaaaaccaagggatgaacgtcgacgggtggcagaaaaaccagtggttg棚aagactagcaatggtctgattcagaagggctcagcaccagtggagtatcccagcatccat540tgcagctatccccagggctatctggtgaacgcatctggaagcctttccatgtggggcagc600cagacttggaccaacccaacttggagcagccagacctggaccaacccaacttggaacaac660cagacctggaccaacccaacttggagcagccaggcctggaccgctcagtcctggaacggc720cagccttggaatgctgctccgctccataacttcggggaggactttctgcagccttacgta780cagttgcagcaaaacttctctgccagtgatttggaggtgeiatttggaagccactagggaa840agccatgcgcattttagcaccccacaagccttggaattattcctgaactactctgtgact900ccaccaggtgaaatatga91810〈211>918〈212〉腿〈213〉小鼠(Musmusculus)<221〉雙突變mNanog基因〈400〉10atgagtgtgggtcttcctggtccccacagtttgcctagttctgaggaagcatcgaattct60gggaacgcctceitcaatgcctgcagtttttcatcccgagaactattcttgcttacaaggg120tctgctactgagatgctctgcacagaggctgcctctcctcgcccttcctctgaagacctg180cctcttcaaggcagccctgattcttctaccagtcccaaacaaaagctctcaagtcctgag240gctgacaagggccctgaggaggaggagaacaeiggtccttgccgggatccagaacatgcag300actgtgttctctcaggcccagctgtgtgcactcaaggacaggtttcagaagcagaagtac360ctcagcctccagcagatgcaagaactctcctccattctgaacctgagctataagcaggtt420aagacctggtttcaaaaccaagggatgaacgtcgacgggtggcaga犯aaccagtggttg480aagactagcaatggtctgattcagaagggctcagcaccagtggagtatcccagcatccat540tgcagctatccccagggctatctggtgaacgcatctggaagcctttccatgtggggcagc600cagacttggaccaacccaacttggagcagccagacctggaccaacccaacttggaacaac660cagacctggaccaacccaacttggagcagccaggcctggaccgctcagtcctggaacggc720cagccttggaatgctgctccgctccataacttcggggaggactttctgcagccttacgta780cagttgcagcaaaacttctctgccagtgatttggaggtgaatttggaagccactagggaa840agccatgcgcattttagcaccccacaagccttggaattattcctgaactactctgtgact900ccaccaggtgaaatatga918<210〉1148DNA引物11ggagaacaaggtccttgccgggatccagaagatgcggactgtgttctc48〈210>12〈211〉48腿引物12gagaacacagtccgcatcttctggatcccggcaaggaccttgttctcc48〈210>13<211〉46DNA引物13ggtccttgccaggaagcaaacatgcagactgtgttctctcaggccc461446DNA引物14gggcctgagagaacacagtctgcatgtttgcttcctggcaaggacc461541〈400〉15cctggtttcaaaaccaagggatgaactgcaagcggtggcag411641DNA引物16ctgccaccgcttgcagttcatcccttggttttgaaaccagg41〈210>1750〈212>DNA引物17ggtttcaaaaccaaaggatgaaggtcgacgggtggc卿aaaaccagtgg501850薩<213〉引物18ccactggtttttctgccacccgtcgaccttcatcctttggttttgaaacc50權利要求1.Nanog的核定位信號被突變的核定位序列突變蛋白質，其中核定位信號1和/或核定位信號2被失功能突變，從而影響Nanog蛋白質的核內定位的能力，但是其仍然能與野生型Nanog形成異源二聚體，並且抑制野生型Nanog的轉錄激活功能。2.權利要求1中的突變蛋白質，其中所述失功能突變是將核定位序列突變成無關序列。3.權利要求1或2所述的蛋白質，其中Nanog的核定位信號1如SEQIDNO:6所示，和/或核定位信號2如SEQIDNO:7所示。4.權利要求2所述的蛋白質，其中所述蛋白質中核定位信號1的序列被突變為序列GIONMQ，和/或核定位信號2的序列被突變為序列GMNVDG。5.權利要求1-4中任一項所述的突變的蛋白質，其中所述Nanog來源於小鼠。6.編碼權利要求1或2所述的突變蛋白質的核酸。7.如權利要求6所述的核酸，其如SEQIDNO:8所示。8.如權利要求6所述的核酸，其如SEQIDNO:9所示。9.如權利要求6所述的核酸，其如SEQIDNO:10所示。10.如權利要求7-10所述的核酸所編碼的蛋白質。11.獲得包含能夠表達權利要求1-5中任一項的突變蛋白質的核酸的表達質粒的方法，其中，所述方法包括(a)使用適當的表達載體構建野生型Nanog基因的真核表達質粒；(b)將(a)中構建的質粒進行目的胺基酸的點突變得到突變體；(c)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因在細胞內定位上進行比較；(d)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因在細胞中的轉錄激活能力上進行比較；(e)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基因共同轉染，檢測(b)中得到的突變體對(a)中得到的野生型基因的細胞內定位的影響；(f)將(b)中得到的突變體同(a)中得到的野生型基肉共同轉染，在細胞中檢測(b)中得到的突變體存在時，對於(a)中得到的野生型基因的轉錄激活能力的影響；(g)選擇對於野生型Nanog的細胞內定位以及轉錄激活能力具有影響的突變體。12.使用權利要求卜5中任一項的突變蛋白質作為Nanog的抑制型突變體工具抑制Nanog轉錄激活能力，從而研究Nanog功能的方法。13.權利要求1-5中任一項的突變蛋白質用於通過抑制N肌og的轉錄激活能力來研究Nanog在細胞中的功能的用途。14.使用權利要求6-10中任一項的突變的核酸作為Nanog的抑制型突變體工具抑制Nanog轉錄激活能力，從而研究Nanog功能的方法。15.權利要求6-10中任一項的突變的核酸用於通過抑制Nanog的轉錄激活能力來研究Nanog在細胞中的功能的用途。全文摘要本發明涉及通過將位於Nanog保守結構域Homeobox(序列見SEQIDNO2)中的核定位信號1和/或2突變成無關序列，破壞其功能，來得到抑制型Nanog突變體，其中所述突變體仍然具有與野生型Nanog形成異源二聚體的能力，並且抑制了野生型Nanog的轉錄激活功能，作為抑制型突變體而發揮功能，因此可能作為一個非常有用的抑制型工具來研究小鼠Nanog的功能。文檔編號C07K14/47GK101492502SQ20091003721公開日2009年7月29日申請日期2009年2月17日優先權日2009年2月17日發明者娟張,張小飛,裴端卿申請人:清華大學;中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院