一種檢測三聚氰胺的方法及其專用試紙的製作方法

2023-12-02 00:54:01 2

專利名稱：一種檢測三聚氰胺的方法及其專用試紙的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測三聚氰胺的方法及其專用試紙。
背景技術：
三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環有機化合物。其含氮量高達66%，白色單晶斜 晶體，無味。因其易於購買和生產，成本低，固有不法廠商針對凱氏定氮法的不足， 將其添加於食品和飼料中以提高蛋白含量，獲取利益。雖然三聚氰胺屬於低毒性化 合物，但其在動物體內會代謝為三聚氰酸，三聚氰胺與三聚氰酸發生反應並累積， 可引起膀胱結石和泌尿道病變。膀胱結石長期刺激，可出現膀胱腫瘤。因此，在實 踐中有必要建立一種敏感度高、操作簡單、成本低、適合大規模推廣的檢測方法
目前，三聚氰胺殘留量的常規檢測方法有兩種一種是色譜分析，如高效液相色 譜法(HPLC)、液相色譜/質譜法(LC/MS)、液相色譜串聯質譜(LC/MSMS)， 由於複雜的儀器設備和繁瑣的過程，不適合現場監控和大量樣本篩査。另一種為免 疫學方法，如酶聯免疫吸附法(ELISA)。它的缺點是檢測時間長，費用較高，不 利於在基層單位進行推廣使用，並且都需要專業技術人員檢測。目前，三聚氰胺殘 留量的常規檢測方法主要有液相色譜/質譜法(LC/MS)、高效液相色譜(HPLC)、 液相色譜串聯質譜(LC/MSMS)等，但是這些方法存在著儀器設備複雜、檢測過 程繁瑣和對檢驗人員的技能要求高的缺點，不適合現場監控和大量樣品的篩查。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測三聚氰胺的試紙。
本發明所提供的檢測三聚氰胺的試紙，包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應 膜和吸水墊，其依次連接；所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的三聚氰胺特異 性抗體；三聚氰胺特異性抗體可為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克隆抗體；反 應膜上包被有檢測區和質控區；當三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體時， 檢測區包被三聚氰胺-載體蛋白偶聯物，質控區包被羊抗兔抗抗體；當三聚氰胺特 異性抗體為三聚氰胺單克隆抗體時，檢測區包被三聚氰胺-載體蛋白偶聯物，質控 區包被羊抗鼠抗抗體；所述半抗原如下其中，所述結合物釋放墊中有1/3-1/2區域被所述樣品吸收墊覆蓋。 所述反應膜包被有檢測區和質控區，其中所述的檢測區位於近於所述結合物釋
放墊的末端的一側，所述質控區位於遠離所述結合物釋放墊的末端的一側；所述檢
測區距所述結合物釋放墊的末端5-8mm，優選為6mm;所述質控區距所述檢測區
4-7mm， 優選為5mm。
所述檢測區和所述質控區均為與所述試紙的長相垂直的條帶狀。 所述結合物釋放墊包被膠體金標記的三聚氰胺單克隆抗體，其包被密度為
0. l-O. 2ug/cm2，優選0. lug/cm2。
所述三聚氰胺單克隆抗體為由保藏號為CGMCC No. 2716的對三聚氰胺藥物單
克隆雜交瘤細胞株C-3-4分泌產生的抗體；所述抗抗體可為羊抗鼠IgG;所述載體
蛋白可為卵血清蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血藍蛋白或甲狀腺蛋白等。 所述試紙中包括底板，所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊固定
在所述底板上。
所述試紙具體可為條狀；為了便於使用，所述條狀的試紙可以覆蓋有保護膜或 裝在盒內。
所述保護膜可以覆蓋所述試紙的兩端(如覆蓋樣品吸收墊、結合物釋放墊和吸 水墊)
所述盒由底座和蓋構成，底坐和蓋通過卡齒和卡孔相連接；所述底座上有與所 述蓋連接的卡齒和與所述試紙相匹配的凹槽；所述蓋上有加樣孔、觀察窗和與底座 卡齒相配的卡孔，所述加樣孔的位置與所述樣品吸收墊的位置相對應，所述觀察窗 與所述反應膜上的檢測區和質控區相對應；所述試紙位於所述凹槽內；所述觀察窗上印有T和C， T表示檢測線，在靠近所述加樣孔側，C表示質控線，在遠離所述加 樣孔側。
底板可由不吸水的韌性材料製成，如硬質塑料、不吸水硬紙，具體可為PVC板 材；樣品吸收墊可由玻璃纖維棉、聚酯材料(聚酯絲或聚酯棉)、尼龍膜、聚偏二 氟乙烯膜或聚酯膜製成；結合物釋放墊可由玻璃纖維製成；吸水墊可為吸濾紙或慮 油紙；反應膜可為硝酸纖維素膜或為純纖維素膜；所述保護膜可為PE材質的保護 膜。
本發明的另一個目的是提供一種製備上述試紙的方法。
本發明所提供的製備上述試紙的方法，是將樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應 膜和吸水墊依次連接；所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的三聚氰胺特異性抗 體；所述三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克隆抗體；所述 反應膜上包括檢測區和質控區，檢測區包被有半抗原和載體蛋白的偶聯物，質控區 包被有抗抗體；
所述樣品吸收墊在進行所述連接前，先在如下溶液中浸泡l-3h，再進行乾燥 含0.3-0. 5% (體積百分含量)鼠血清蛋白、pH值為9. 6-10.0、 0. 1-0. 2mol/L的碳 酸鹽緩衝液；
所述包被有膠體金標記的三聚氰胺特異性抗體的結合物釋放墊是按照如下方 法製備的將包被前的結合物釋放墊先在如下溶液中浸泡20-40秒，乾燥，再進行 所述膠體金標記的三聚氰胺特異性抗體包被含有0.8-1.2% (體積百分含量)牛血 清白蛋白、pH值為7.2-7.8 、 0. 1-0.2mol/L硼砂-硼酸緩衝液。
上述方法中，使所述結合物釋放墊中有1/3-1/2區域被所述樣品吸收墊覆蓋。
所述反應膜包被有檢測區和質控區，其中所述的檢測區位於近於所述結合物釋 放墊的末端的一側，所述質控區位於遠離所述結合物釋放墊的末端的一側；所述檢 測區距所述結合物釋放墊的末端5-8mm，優選為6mm;所述質控區距所述檢測區 4-7mm,優選為5ram。
上述方法中所用的三聚氰胺單克隆抗體為由保藏號為CGMCC No. 2716的對三 聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細胞株C-3-4分泌產生的抗體。
本發明的另一個目的是提供一種檢測三聚氰胺的方法。
本發明所提供的檢測三聚氰胺的方法，是將待檢測樣品進行前處理，然後用上 述任一所述試紙進行檢測；所述前處理的方法如下當所述樣品為牛奶時，樣品前處理的方法為將牛奶與0.05-0. 1M磷酸鹽緩衝 液以l: 15-25的體積比混勻，取樣用於檢測；
當所述樣品為奶粉時，樣品前處理的方法為將每lg奶粉溶於18-25ml、 pH 為6.0-6. 8、 0.01-0.02M磷酸鹽緩衝液中，超聲10-20min，離心，取樣用於檢測；
當所述樣品為飼料時，樣品前處理的方法為將每lg飼料與9-15ml乙腈與鹽 酸的混合溶液混勻，超聲提取10-15 min，取lml上清液，乾燥，加入0. 5-1. 5ml 正己垸混勻，再加入1. 0-2. Oml 0.01-0.02M磷酸鹽緩衝液混勻，離心，取下層水 相用於檢測；所述乙腈與鹽酸的混合溶液中乙腈與0. 05-0. 1M鹽酸的體積比為4-6: 1。
本發明試紙的檢測原理當在試紙的樣品吸收墊端滴加待測樣品溶液後，待檢 溶液通過結合物釋放墊中的金標抗體一起向反應膜擴散，並最終滲入濾紙中；若待 檢測樣品溶液中三聚氰胺的含量高，則擴散過程中待檢測樣品溶液中的三聚氰胺可 與金標抗體相結合，進而完全封閉金抗體上三聚氰胺的抗原結合點，阻止金標抗體 與反應膜上偶聯三聚氰胺載體蛋白的檢測印跡結合，不能顯示檢測印跡，檢測區不 顯色，而羊抗鼠IgG抗體則可與金標抗體結合，質控區顯色，形成一條紅色對照印 跡"I"，呈一條印跡為陽性；若待檢測樣品溶液中三聚氰胺的含量低或無，則金 標抗體上的抗原結合位點不能被封閉，進而金標抗體會與纖維素膜上偶聯三聚氰胺 的載體蛋白檢測印跡結合，檢測區顯示紅色印跡"I "，同樣羊抗鼠IgG抗體也與 金標抗體結合，質控區也顯示紅色對照印跡"I "，形成兩條紅線"II "陰性標記； 如果纖維素膜上沒有紅色標記顯示，則試紙無效。
本發明的膠體金試紙具有敏感度高、特異性高、精密度高、準確度高、成本低、 操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質期長的優點。其中， 採用高特異性的三聚氰胺單克隆抗體，保證了檢測結果的可靠性；將結合物釋放墊 部分區域用樣品吸收墊覆蓋，能夠延長檢測結果觀察時間，同時也使待檢測樣品溶 液被充分吸收進而能與金標抗體完全接觸、充分反應，從而減少誤差；試紙上單克 隆抗體包被量的設計、檢測區與結合物釋放墊之間的距離及質控區與檢測區的距離 的設計都進一步提高了試紙檢測的精確度。用本發明試紙檢測三聚氰胺的方法，簡 便、快速、直觀、準確，適用範圍廣，成本低，易推廣應用。


圖l為試紙剖面結構示意圖。
圖2為帶有保護膜的試紙的俯視圖。
圖3為帶有試紙盒的試紙的剖面結構示意圖。
圖4為帶有試紙盒的試紙的檢測結果的判斷。 圖5為三聚氰胺與溴乙酸叔丁酯反應中產生的中間產品I 。 圖6為中間產品I通過水解反應得半抗原。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。 實施例1、檢測三聚氰胺的試紙的構成
一、不帶有保護膜或試紙盒的試紙(圖l):
所述試紙由樣品吸收墊1、結合物釋放墊2、反應膜3、吸水墊4和底板7組成； 所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊依次按順序黏貼在所述底板
上，結合物釋放墊從其始端起有l/3區域被樣品吸收墊覆蓋，結合物釋放墊的末端
與反應膜的始端相連，反應膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底
板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；
所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的由保藏號為CGMCC No. 2716的對三 聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細胞株C-3-4分泌的抗體，包被量為0. lug/cm2。
所述反應膜上有檢測區5和質控區6，檢測區和質控區均為與所述試紙的長相 垂直的條帶狀；檢測區位於近於結合物釋放墊末端的一側，距結合物釋放墊末端 5mm;質控區位於遠離結合物釋放墊末端的一側，距所述檢測區4mm;檢測區包被有 三聚氰胺-載體蛋白偶聯物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶聯物)，質控區 包被有羊抗鼠IgG;所述半抗原如下底板由PVC板材製成；樣品吸收墊可由玻璃纖維棉製成；結合物釋放墊由玻璃 纖維製成；吸水墊為吸濾紙；反應膜為硝酸纖維素膜。
所述試紙為3-5mm寬的矩形條狀。
二、 帶有保護膜的試紙(稱作試紙條)(圖2):
所述試紙由樣品吸收墊1、結合物釋放墊2、反應膜3、吸水墊4和底板7組成；
所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊依次按順序黏貼在所述底板 上，結合物釋放墊從其始端起有1/2區域被樣品吸收墊覆蓋，結合物釋放墊的末端 與反應膜的始端相連，反應膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底 板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；
所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的由保藏號為CGMCC No. 2716的對三 聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細胞株C-3-4分泌的抗體，包被量為0. 2ug/cm2。
所述反應膜上有檢測區5和質控區6，檢測區和質控區均為與所述試紙條的長 相垂直的條帶狀；檢測區位於近於結合物釋放墊末端的一側，距結合物釋放墊末端 8rara;質控區位於遠離結合物釋放墊末端的一側，距所述檢測區7mm;檢測區包被有 三聚氰胺-載體蛋白偶聯物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶聯物)，質控區 包被有羊抗鼠IgG;所述半抗原同一中所述相同。
將所述試紙兩端黏貼保護膜，再用機器切成3-5mm寬的小條，優選3mm。
保護膜8-1覆蓋在吸水墊上手柄端，保護膜8-2覆蓋在樣品吸收墊和結合物釋 放墊上的檢測端，在樣品吸收墊和結合物釋放墊的交界處有隔離線並印有max字樣。
底板由PVC板材製成；樣品吸收墊由尼龍膜製成；結合物釋放墊由玻璃纖維制 成；吸水墊為慮油紙；反應膜為純纖維素膜；所述保護膜為PE材質的保護膜。
三、 帶有試紙盒的試紙(稱作試紙卡)(圖3)
所述試紙由樣品吸收墊1、結合物釋放墊2、反應膜3、吸水墊4和底板7組成；
所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊依次按順序黏貼在所述底板 上，結合物釋放墊從其始端起有1/3區域被樣品吸收墊覆蓋，結合物釋放墊的末端 與反應膜的始端相連，反應膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底 板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；
所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的由保藏號為CGMCC No. 2716的對三 聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細胞株C-3-4分泌的抗體，包被量為0. lug/cm2。
所述反應膜上有檢測區5和質控區6，檢測區和質控區均為與所述試紙條的長相垂直的條帶狀；檢測區位於近於結合物釋放墊末端的一側，距結合物釋放墊末端 6mm;質控區位於遠離結合物釋放墊末端的一側，距所述檢測區5mm;檢測區包被有 三聚氰胺-載體蛋白偶聯物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶聯物)，質控區 包被有羊抗鼠IgG;所述半抗原同一中所述相同。
所述試紙裝在試紙盒內；所述試紙盒由底座9和蓋10構成，底坐和蓋通過卡 齒12和卡孔13嵌合連接；
所述底座上有與所述蓋連接的卡齒12和與所述試紙相匹配的凹槽；
所述蓋上有加樣孔ll、觀察窗14和與底座相連的卡孔13 (與卡齒相配)；所 述加樣孔的位置與所述樣品吸收墊的位置相對應，所述觀察窗與所述反應膜上的檢 測區和質控區相對應。所述觀察窗上印有T和C， T表示檢測線，在靠近所述加樣 孔側，C表示質控線，在遠離所述加樣孔側。
切好後的試紙位於盒底座的凹槽內，盒的蓋和底座通過卡齒和卡孔連接成封閉 系統。
底板由PVC板材製成；樣品吸收墊由尼龍膜製成；結合物釋放墊由玻璃纖維制 成；吸水墊為慮油紙；反應膜為純纖維素膜；所述保護膜為PE材質的保護膜。試
紙卡中的蓋由塑料製成，底座由塑料製成。
將上述試紙條或試紙卡均用鋁箔袋真空包裝，在18 25i:的環境中儲存，有效 期一年。
實施例2、實施例1中所述試紙的製備方法 一、試紙的製備
該試紙的製備方法主要包括如下步驟
1) 製備包被三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標記物的結合物釋放墊；
2) 製備含有包被三聚氰胺-載體蛋白偶聯物的檢測區和包被羊抗鼠IgG的質控 區的反應膜；
3) 將樣品吸收墊、上述結合物釋放墊、反應膜、吸水墊和底板組裝成試紙。
4) 將組裝好的試紙兩端黏貼保護膜；用機器切成3mm寬的小條；或者將組裝 好的試紙用機器切成3rara寬的小條，裝在特製的塑料盒中。
下面分步詳細敘述 (一)各部件的製備
1、三聚氰胺-載體蛋白偶聯物的合成與鑑定三聚氰胺是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發機體產生 免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯後才具有免疫原性。
1) 半抗原的合成
a、 取0.5g (3.97咖o1)三聚氰胺於乾燥的50ml圓底燒瓶中，加35ml DMF攪拌 溶解，取O. 44g(7. 93隱o1) K0H、 0. 12g無水Nal加至上述溶液中，滴加0.646ml溴乙 酸叔丁酯，充分混合後，加熱升溫65'C反應10h。反應結束後，冷卻至室溫，加水 稀釋，用乙酸乙酯萃取，乾燥，旋蒸，得黃色油狀物，乙酸乙酯石油醚=2: l過 柱得產品I (如圖5所示)；
b、 取0. 32g中間產品I用5ml甲醇溶解，再加入5ml三氟乙酸，室溫攪拌20h。 反應完成後旋蒸除去溶劑，得油狀物，用甲醇與乙酸乙酯l: l混合溶劑溶解，向 溶液中滴加石油醚，直至有白色渾濁出現，加熱使之變澄清，放置冷卻，析出白色 沉澱，真空抽濾，得半抗原產品(如圖6所示)。
2) 包被原的製備-三聚氰胺半抗原與人血清白蛋白偶聯物的合成
將步驟(1)製備的半抗原IO mg、 40 mg碳化二亞胺(DEC)和15 mg N—羥基 琥珀醯亞胺(NHS)充分溶解於l mL DMF中，在加熱條件下攪拌24 h，得到反應液I 液；稱取BSA 20 mg，使之充分溶解在3.0 mL PBS (pH 8.2)中，得到反應液II液 (半抗原與牛血清白蛋白的摩爾配比為26: 1);將I液緩慢加入到II液中，並於室溫 下攪拌5h，用O. 01 mol/L PBS緩衝液透析3 d，每天換2次透析液，以除去未反應的 小分子物質，以12000 rpm的速度離心30 min，收集上清，得到半抗原與牛血清白蛋 白的偶聯物，分裝，於-2(TC保存備用。
3) 免疫原的製備-三聚氰胺半抗原與甲狀腺蛋白的合成
將步驟(1)製備的三聚氰胺半抗原10mg、 40mg碳化二亞胺(DEC)和15mg N— 羥基琥珀醯亞胺(NHS)充分溶解於lmL DMF中，在加熱條件下攪拌24 h，得到反應 液I液；稱取甲狀腺蛋白25mg，使之充分溶解在3. OmL PBS (pH8.2)中，得到反應 液II液(半抗原與甲狀腺蛋白的摩爾配比為18: 1);將I液緩慢加入到II液中，並於 室溫下攪拌5h，用O. 01mol/L PBS緩衝液透析3d，每天換2次透析液，以除去未反應 的小分子物質，以12000 rpm的速度離心30min，收集上清,得到三聚氰胺半抗原與 甲狀腺蛋白的偶聯物，分裝，於-20。C保存備用。
4) 三聚氰胺-載體偶聯物的鑑定
將載體蛋白、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺-載體蛋白偶聯物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS調零，用紫外分光光度計在波長200-800 nm範圍內掃描，得到載體蛋白、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺-載體蛋白偶聯物的吸 收曲線。三者出現不同的吸收曲線，表明三聚氰胺與載體蛋白偶聯成功。
2、 三聚氰胺單克隆抗體的製備 (1)製備單抗
a. 動物免疫
將步驟(1)得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為150Pg/只，使 其產生抗血清。
b. 細胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9: 1 (數量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融 合，篩選得到穩定分泌三聚氰胺單克隆抗體的對三聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細胞 株，將此細胞株命名為C-3-4，該細胞株已於2008年10月20日保藏於中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路， 中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No.2716。
c. 細胞凍存和復甦
將雜交瘤細胞C-3-4用凍存液製成1 X 19個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保 存。復甦時取出凍存管，立即放入37X:水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養 瓶內培養。
d. 單克隆抗體的製備與純化
增量培養法將雜交瘤細胞CGMCCNo.2716置於細胞培養基中，在37。C條件下 進行培養，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，-20°C 保存。
所述細胞培養基為向RPMI-1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血 清在細胞培養基中的終濃度為20% (質量百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞培養基中 的終濃度為0.2% (質量百分含量)；所述細胞培養基的pH為7.4。
3、 羊抗鼠抗抗體的製備羊抗鼠IgG購自創生生物產地Genestsbio貨號 6102030。
4、 三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標記物的製備 (1)膠體金的製備
用雙蒸去離子水將1%氯金酸(購於sigma公司，產品目錄號T09041)稀釋成0.01% (質量百分含量)，置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每100ml 0. 01%氯金酸 加入2ml 1%檸檬酸三鈉(購於廣州化學試劑廠，產品目錄號BG11-AR-01KG)，繼 續煮沸，至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫後補足失水。製備好的膠體金外觀 純淨、透亮、無沉澱和漂浮物，有效期為一個月。
(2)三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標記物的製備
在磁力攪拌下，用0. lM碳酸鉀調膠體金的pH值至8.2，按50-100[ig抗體/ml 膠體金的標準向膠體金溶液中加入上述三聚氰胺單克隆抗體，繼續攪拌混勻30min， 加入10。/。BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置30min。 12000rpm、 4'C離心30min，棄上清液，沉澱用復溶緩衝液洗滌兩次，用體積為初始 膠體金體積1/20的復溶緩衝液將沉澱重懸，得到的三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標 記物溶液的濃度為50ug單抗/ml溶液，置4。C備用，保存60天。
復溶緩衝液含牛血清白蛋白(BSA)、吐溫-80和PVP-300吡咯烷酮的0. 02M、 pH9. 0的硼酸溶液，其中牛血清白蛋白(BSA)在復溶緩衝液中的終濃度為0. 02-0. 1 % (體積百分含量)，吐溫-80在復溶緩衝液中的終濃度為0.05-0.2% (質量百分 含量)，PVP-300吡咯烷酮在復溶緩衝液中的終濃度為0.3X (質量百分含量)。
5、 將三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標記物包被到結合物釋放墊 將結合物釋放墊浸泡於含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩衝液中的終濃度
為有1.0% (體積百分含量))和pH值為7.6 、 0.2mol/L硼砂-硼酸緩衝液中浸溼 30秒，37。C烘2h備用；用Biodot點膜儀將製備好的三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標 記物均勻包被在結合物釋放墊上，每5cm2結合物釋放墊包被10pL三聚氰胺單克隆 抗體-膠體金標記物(即每平方釐米結合物釋放墊包被0.1ug抗體)，真空乾燥，真 空封裝，置4"C備用。
還可以每5cm2結合物釋放墊包被20)iL三聚氰胺單克隆抗體-膠體金標記物， 即得到每平方釐米包被0.2ug抗體的結合物釋放墊。
6、 樣品吸收墊的準備將樣品吸收墊置於含鼠血清蛋白(鼠血清蛋白在緩衝 液中的終濃度為0.4% (體積百分含量))、pH為9.9、 0. lmol/L碳酸鹽緩衝液浸泡2h， 37r烘2h備用；
7、 反應膜的製備
包被過程用磷酸緩衝液將三聚氰胺-牛血清白蛋白偶聯物稀釋到10mg/mL，用 Biodot點膜儀將其包被於硝酸纖維素膜上的檢測區，包被量為0. 7嗎/cm2;用0. OIM、
13pH 7. 4 PBS緩衝液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200pg/ml，用Biodot點膜儀將其包被 於硝酸纖維素膜上的質控區，包被量為0. 7pg/cm2。
封閉將包被好的反應膜至於37t:， 2小時後密封保存。
封閉液含人血清白蛋白(人血清白蛋白在封閉液中的終濃度為0.5% (質量百 分含量))、蔗糖(蔗糖在封閉液中的終濃度為0.5% (質量百分含量))、pH值 為7. 0、 0. 05mol/L Tris-緩衝液。 (二)各部件的組裝
1、 含有保護膜的試紙的組裝
將所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊依次按順序黏貼在所述底
板上；結合物釋放墊從其始端起有l/2區域被樣品吸收墊覆蓋，結合物釋放墊的末
端與反應膜的始端相連，反應膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與
底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；在組裝好試紙兩端黏貼保護膜， 再用機器切成3mm寬的小條。
將試紙用鋁箔袋真空包裝，在18 25'C的環境中儲存，有效期一年。
2、 含有試紙盒的試紙的組裝
將所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜、吸水墊依次按順序黏貼在所述底 板上；結合物釋放墊從其始端起有1/3區域被樣品吸收墊覆蓋，結合物釋放墊的末 端與反應膜的始端相連，反應膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與 底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；將試紙用機器切成3mm寬的小 條，裝在試紙盒裡。將試紙用鋁箔袋真空包裝，在18 25'C的環境中儲存，有效期 一年。
二、試劑盒的敏感性和特異性檢驗 (一)敏感性試驗
將三聚氰胺標準品(北京艾傑爾科技有限公司，CAS: 108-78-1)稀釋成如下 不同濃度0、 0.05、 0.1、 0.15、 0.3mg/L;所用的稀釋液的組成為含有在稀釋 液中的終濃度為8% (質量百分含量)的DMS0、 pH為6.6、 0. 2mol/L的磷酸鹽緩衝 液。
分別用試紙條和試紙卡進行檢測。每次向樣品吸收墊滴加lml樣品，結果為 滴試0、 0.05mg/L濃度時，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性；當 滴試O. lmg/L濃度時，試紙卡也出現肉眼可見的兩條紅色條線，但檢測區顏色很淡很模糊，呈陽性；當滴試O. 15、 0.3mg/L濃度的標準液時試紙卡檢測區不顯色，呈 陽性。表明，本試紙卡檢測三聚氰胺的靈敏度為0. lmg/L。 (二)特異性試驗
特異性常用交叉反應率表示，是指抗體與結構不同的抗原決定簇發生結合的能 力。本試紙條對三聚氰胺檢測靈敏度為O. lmg/L，將三聚氰胺類似物(三聚氰酸、 三嗪、三嗪二胺)按O, 0.05， 0.1, 0.6， 2， 5， 10 mg/L進行稀釋，用實施例l中 所述的兩種試紙分別進行檢測，結果如表l所示，三聚氰酸、三嗪、三嗪二胺藥物 在5mg/L濃度時試紙卡檢測線均顯色，可以得出三聚氰胺對以上藥物的交叉反應率 均小於1%。
表l、特異性試驗結果
藥物 交叉反應率(％)
三聚氰胺100
三聚氰酸小於l
三嗪小於l
三嗪二胺小於l
實施例3、試紙的應用
一、用實施例1中所述試紙檢測三聚氰胺
本發明的試紙可以檢測牛奶樣品、奶粉樣品和飼料樣品。 一般的檢測方法如下
1、 樣品的處理
牛奶樣品取lml牛奶樣本用19ml的0.05M磷酸鹽緩衝液稀釋並混勻，取樣 進行檢測；
奶粉樣品取lg奶粉溶於20ml的0. lM磷酸鹽緩衝液(pHi. 7)中，超聲10min， 離心，取樣進行檢測；
飼料取3g勻質後的飼料與30ml乙腈-0. 1M鹽酸(V:V=84: 16)混勻，超聲 提取1.5 min，取lml上清液，50。C水浴吹乾，加入2ml正己烷混勻，再加入4ml 0. 02M 磷酸鹽緩衝液混勻，離心，取樣用於檢測。
2、 檢測方法及判斷向本試紙中的樣品吸收墊中滴加需檢測的樣品溶液後，在io分鐘內觀看檢測結果。
三聚氰胺藥物在樣品中濃度高於試紙的樣本最低檢測限時，膠體金抗體與三聚 氰胺結合，從而在檢測區內因為競爭反應不會與三聚氰胺偶聯物結合而不出現紅色 條帶，呈陽性。陰性樣品在檢測過程中由於缺少抗體抗原競爭反應，將會在檢測區 與質控區內出現紅色條帶。如圖4所示。
陽性當質控區顯示出紅色條帶，而檢測區不顯色時，判為陽性。(圖4A) 陰性當質控區顯示出紅色條帶，檢測區同時也顯示出紅色條帶，判為陽性。 (圖4 B)
無效當質控區不顯示出紅色條帶，則無論測試區顯示出紅色條帶與否，該試
紙卡判為無效。(圖4 C) 下面具體舉例
取已知含有三聚氰胺濃度大於2mg/kg (mg/L)的牛奶、奶粉樣本和三聚氰胺濃 度大於4mg/kg的飼料陽性樣品各20份和三聚氰胺濃度小於2mg/kg(mg/L)的牛奶、 奶粉樣本和濃度小於4rag/kg的飼料陰性樣品20份，用3個批次生產的試紙分別進 行檢測，(每批試紙條和試紙卡各10個)計算其陰陽性率。結果如表2和表3所 示。
表2、檢測陽性樣本結果
陽性牛奶樣品陽性奶粉樣品陽性飼料樣品
(20份)(20份)(20份)
120份陽性20份陽性20份陽性
220份陽性20份陽性20份陽性
320份陽性20份陽性20份陽性
表3、檢測陰性樣本結果
陰性牛奶樣品陰性奶粉樣品陰性飼料樣品
批l- (20份)(20份)(20份)
119份陰性19份陰性20份陰性
220份陰性19份陰性18份陰性
319份陰性19份陰性19份陰性
結果表明用3個批次生產的試紙條和試紙卡檢測陽性牛奶、奶粉、伺料樣本
時，陽性符合率都為100%;檢測20份陰性牛奶樣本時結果出現了2份陽性，檢測 20份陰性奶粉樣本時結果出現了 3份陽性，檢測20份陰性飼料樣本時結果出現了3份陽性，其牛奶陰性符合率均為98%以上；奶粉、飼料陰性符合率均為96%以上。 說明本發明的檢測三聚氰胺試紙可以對三聚氰胺進行快速檢測。
權利要求
1、一種檢測三聚氰胺的試紙，包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊，其依次連接；所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的三聚氰胺特異性抗體；所述三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克隆抗體；所述反應膜上包括檢測區和質控區，檢測區包被有半抗原和載體蛋白的偶聯物，質控區包被有抗抗體；所述半抗原如下
2、 根據權利要求1所述的試紙，其特徵在於所述樣品吸收墊與所述結合物 釋放墊的連接方式為所述結合物釋放墊中有1/3-1/2區域被所述樣品吸收墊覆蓋。
3、 根據權利要求1或2所述的試紙，其特徵在於所述檢測區位於近於所述 結合物釋放墊的末端的一側，所述質控區位於遠離所述結合物釋放墊的末端的一 側；所述檢測區距所述結合物釋放墊的末端5-8mm，優選為6ram;所述質控區距所 述檢測區4-7mm，優選為5mm。
4、 根據權利要求l 、 2或3所述的試紙，其特徵在於所述結合物釋放墊上 包被的三聚氰胺特異性抗體的包被密度為0. 1-0. 2ug/cm2，優選為0. lug/cm2。
5、 根據權利要求1-4中任一所述的試紙，其特徵在於所述三聚氰胺單克隆 抗體為由保藏號為CGMCC No. 2716的對三聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細胞株C-3-4 分泌產生的抗體；所述抗抗體為羊抗鼠IgG。
6、 根據權利要求1-5中任一所述的試紙，其特徵在於所述試紙中包括底板， 所述樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊固定在所述底板上。
7、 一種製備權利要求1-6中任一所述試紙的方法，是將樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊依次連接；所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的三聚 氰胺特異性抗體；所述三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克 隆抗體；所述反應膜上包括檢測區和質控區，檢測區包被有權利要求1中所述半抗 原和載體蛋白的偶聯物，質控區包被有抗抗體；所述樣品吸收墊在進行所述連接前，先在如下溶液中浸泡卜3h，再進行乾燥含0.3-0.5% (體積百分含量)鼠血清蛋白、pH值為9. 6-10.0、 0. 1-0. 2mol/L的碳 酸鹽緩衝液；所述包被有膠體金標記的三聚氰胺特異性抗體的結合物釋放墊是按照如下方 法製備的將包被前的結合物釋放墊先在如下溶液中浸泡20-40秒，乾燥，再進行 所述膠體金標記的三聚氰胺特異性抗體包被含有0.8-1.2% (體積百分含量)牛血 清白蛋白、pH值為7.2-7.8 、 0. l-0.2mol/L硼砂-硼酸緩衝液。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述樣品吸收墊與所述結合物 釋放墊的連接方式為所述結合物釋放墊中有1/3-1/2區域被所述樣品吸收墊覆蓋；所述檢測區位於近於所述結合物釋放墊的末端的一側，所述質控區位於遠離所 述結合物釋放墊的末端的一側；所述檢測區距所述結合物釋放墊的末端5-8mm，優 選為6mm;所述質控區距所述檢測區4-7mra，優選為5mm。
9、 根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述三聚氰胺單克隆抗體 為由保藏號為CGMCC No. 2716的對三聚氰胺藥物單克隆雜交瘤細胞株C-3-4分泌 產生的抗體。
10、 一種檢測三聚氰胺的方法，是將待檢測樣品進行前處理，然後用權利要求 l-6中任一所述試紙進行檢測；所述前處理的方法如下當所述樣品為牛奶時，樣品前處理的方法為將牛奶與0.05-0. 1M磷酸鹽緩衝 液以l: 15-25的體積比混勻，取樣用於檢測;當所述樣品為奶粉時，樣品前處理的方法為將每lg奶粉溶於18-25ml、 pH 為6. 0-6. 8、 O.O卜0.02M磷酸鹽緩衝液中，超聲10-20min，離心，取樣用於檢測；當所述樣品為飼料時，樣品前處理的方法為將每lg飼料與9-15ml乙腈與鹽 酸的混合溶液混勻，超聲提取10-15 min，取lml上清液，乾燥，加入0. 5-1. 5ml 正己垸混勻，再加入1.0-2.0ml 0.01-0.02M磷酸鹽緩衝液混勻，離心，取下層水 相用於檢測；所述乙腈與鹽酸的混合溶液中乙腈與0. 05-0. 1M鹽酸的體積比為4-6: 1。
全文摘要
本發明公開了一種檢測三聚氰胺的方法及其專用試紙。該試紙包括樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊，其依次連接；所述結合物釋放墊上包被有膠體金標記的三聚氰胺特異性抗體；所述三聚氰胺特異性抗體為三聚氰胺多克隆抗體或三聚氰胺單克隆抗體；所述反應膜上包括檢測區和質控區，檢測區包被有半抗原和載體蛋白的偶聯物，質控區包被有抗抗體。用本發明試紙檢測三聚氰胺的方法，簡便、快速、直觀、準確，適用範圍廣，成本低，易推廣應用。
文檔編號G01N33/558GK101477124SQ20081024031
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月17日 優先權日2008年12月17日
發明者萬宇平, 何方洋, 馮才偉, 馮才茂, 汪善良, 趙正苗 申請人:北京望爾康泰生物技術有限公司;北京望爾生物技術有限公司