鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記試劑盒及其檢測方法
2023-12-01 13:50:06
鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明主要涉及一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記及其專用引物。具體涉及老芒麥和披鹼草種子基因組DNA的分子標記引物試劑盒及其檢測方法。一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記，其主要特點包括有：老芒麥和披鹼草的PCR檢測體系相同，其中包括2×Eco?Taq?PCR?SuperMix，引物Elymus-F（5′-3′）：AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC，引物Elymus-R（5′-3′）：TGAAATGGCTATCGCTTGACCG，ddH2O和模板DNA。本發明的優點是該技術具有成本低、準確度高、穩定性好、重複性強和簡單快捷等特點，尤其是受測群體較大時，此種方法具有更顯著的經濟效應，為我國的優良牧草的安全生產提供重要保障。
【專利說明】鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明主要涉及一種鑑定老芒麥種子真偽的分子標記及其專用引物。具體涉及老芒麥和披鹼草種子基因組DNA的分子標記引物試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]老芒麥(E.Sibiricus)和披鹼草(Elymus dahuricus)廣泛分布於我國的東北、西北、華北和青藏高原等地區，是草甸草原和草甸群落中的重要成分，能形成優勢種和建植群(陳默君，2002)。隨著我國草地畜牧業的迅速發展，退耕還林(還草)等項目的實施，老芒麥和披鹼草種質資源的需求量也隨之增多。
[0003]老芒麥和披鹼草皆為披鹼草屬物種。披鹼草是中等的飼料，在披鹼草草叢中，葉佔的比例較少，莖杆所佔比例大，而質地粗硬，影響了飼料品質，披鹼草的畝產乾草可高達375-650公斤。老芒麥的葉量豐富，適口性好，粗蛋白含量高，消化率達80%以上，適時刈割既可調製成乾草，也可青飼和放牧，為牛、馬、羊等家畜所喜食，老芒麥的畝產乾草在200-400公斤。綜上所述，披鹼草是高產的飼料品種，老芒麥是高質飼料品種，這使得兩種牧草在畜牧生產領域需嚴格區別開來，因而準確迅速區分開披鹼草和老芒麥，保證高純度的種子，對於確保我國老芒麥和披鹼草種子的質量具有十分重要的意義。
[0004]傳統的分類方法主要依據老芒麥和披鹼草的外部形態特徵差異進行劃分，存在許多不完善之處。經研究分析，老芒麥和披鹼草在長期適應進化過程中，兩個種不同的生態型在形態性狀上具有較多的性狀交叉，所以這兩種牧草的種子、幼苗和葉片在外觀上極為相似，一旦兩種牧草種子混在 在一起，從形態學上將極難區分。這不僅對牧草科學研究造成嚴重幹擾，而且對老芒麥和披鹼草的種植和生產造成巨大的影響。
[0005]21世紀是生命科學的世紀，生物學已經進入微觀分子水平，分子標記已開始應用於作物遺傳資源及育種研究。目前分子標記的方法主要有限制性片斷長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性DNA (RAPD)、擴增片斷長度多態性(AFLP)、簡單重複序列(SSR)、染色體原位雜交(ISH)(李造哲，2000)。雖然國內有文獻已報導利用不同來源微衛星引物對9種披鹼草屬植物進行遺傳分析(嚴學兵，2008)，但是利用分子標記鑑定披鹼草屬植物的方法卻未見報導。
【發明內容】
[0006]本發明的目的一是避免現有檢測技術的缺陷，提出一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的專用引物。
[0007]本發明的目的二是提供一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的試劑盒。
[0008]本發明的目的三是提供一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的方法。
[0009]以便快速、高效和準確的鑑定老芒麥和披鹼草種子。此方法省時高效，操作簡便，在實驗室條件下較短時間內能夠很好完成。研究中，隨機從美國國家種質庫抽取的5份老芒麥、10份披鹼草種質，並和從中國西北地區選取的10份老芒麥種質都可適用，具有很強的推廣價值，有助於種子檢驗人員快速有效區分老芒麥和披鹼草種子。在我國牧草產業化推廣中，該技術具有廣闊的應用前景，為我國的畜牧業糧食安全提供重要保障，從而保證我國畜牧業向增加農民收入，提高國民經濟的方向發展。
[0010]為實現上述目的，本發明採取的技術方案為:一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的專用引物，其主要特點是包括有:
[0011]老芒麥和披鹼草專用引物:Elymus-F(5' -3' ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC ；
[0012]Elymus-R (5' -3/ ):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG。
[0013]一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的試劑盒，其主要特點包括有:
[0014]第一組:老芒麥PCR檢測體系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix,引物 Elymus-F (5 ' -3 , ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC,引物 Elymus-R (5 ' _3 '):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG 和 ddH20 ；
[0015]第二組:披鹼草PCR檢測體系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix,引物 Elymus-F (5 ' -3 , ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC,引物 Elymus-R (5 ' _3 '):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG 和 ddH20。
[0016]一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的方法，其主要包括如下步驟:
[0017]A.收集種子，採用雙層濾紙萌發法，20-300C，萌發5-10天至露白，提取萌發種子基因組DNA備用；
[0018]B.利用老芒麥和披鹼草專用引物，對老芒麥種子基因組DNA進行PCR檢測。PCR檢測體系的總體積為20μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMixlO μ 1，引物Elymus-F (5 ' -3 ' ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ I,引物 Elymus-R (5 ' _3 '):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ 1，ddH206 μ I 和老芒麥 DNA 模板(50ng/ μ I) 2 μ I ;擴增條件為:(1)94°C預變性 3min ;(2)94°C變性 30s ; (3)60°C退火 30s ; (4)72。。延伸 30s ； (5)2-4步驟循環38次；(6) 72°C延伸7min。
[0019]C.利用老芒麥和披鹼草專用引物，對披鹼草種子基因組DNA進行PCR檢測；PCR檢測體系的總體積為20 μ I，其中包括2 X EcoTaq PCR SuperMixlO μ I，引物Elymus-F (5 ' -3 ' ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ I,引物 Elymus-R (5 ' _3 '):TGAAATGGCTATCGCTTGACC G I μ 1，ddH206 μ I 和披鹼草 DNA 模板(50ng/ μ I) 2 μ I ;擴增條件為:(1)94°C預變性 3min ;(2)94°C變性 30s ; (3)60°C退火 30s ; (4)72。。延伸 30s ； (5)2-4步驟循環38次；(6) 72°C延伸7min。
[0020]D.將老芒麥和披鹼草PCR產物在同一張8%非變性丙烯醯胺膠片中電泳，電泳電壓為180V，跑膠2.5h ；EB燃料染色5min，紫外燈下照相；
[0021]E.其電泳擴增條帶大小都在200bp_300bp之間，擴增條帶268bp為老芒麥；擴增條帶255bp為披鹼草。
[0022]本發明的有益效果是，可以快速有效地鑑定出老芒麥和披鹼草種子。此方法具有成本低、準確度高、穩定性好、重複性強和簡單快捷等特點，能夠大批量進行老芒麥和披鹼草種子的鑑定，為保障兩種牧草種子純度鑑定提供可行依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1.老芒麥和披鹼草在形態學上的相似性；[0024]圖中:(A和B)披鹼草和老芒麥單粒種子、(C和D)披鹼草和老芒麥種子、(E和F)披鹼草和老芒麥幼苗及(G和H)披鹼草和老芒麥葉片對照圖，比例尺表示1cm。
[0025]圖2.兩種老芒麥和披鹼草種子(見表1)間的PCR鑑定結果；
[0026]圖中:老芒麥(E.sibiricus)的1_15編號表示老芒麥15個單株，披鹼草(E.dahuricus)的 1-15 編號表示披鹼草 15 個單株，「M」表示 DL500 的 DNA Marker, 「H20」表示以ddH20為模板的負對照組。
[0027]圖3.不同種質的老芒麥和披鹼草種子間的PCR鑑定結果；
[0028]圖中:老芒麥(E.sibiricus)的1_15編號表示老芒麥15個不同種質(見表2),披鹼草(E.dahuricus)的1_10編號表示披鹼草10個不同種質(見表3)，「M」表示DL500的DNA Marker, 「 H2O 」表示以ddH20為模板的負對照組。
[0029]圖4.老芒麥和披鹼草混合種子的PCR鑑定結果。
[0030]圖中:100:0、99:1、98:2、95:5、90:10、75:25、50:50、25:75、10:90、5:95、2:98、
1:99和0:100表示老芒麥和披鹼草基因組DNA模板混合的比例，「M」表示DL500的DNAMarker, 「H20」表示以ddH20為模板的負對照組。
【具體實施方式】
[0031]以下結合實施例對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。
[0032]實施例1:一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的專用引物，包括有:
[0033]老芒麥和披鹼草專用引物:Elymus-F(5' -3/ ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC ；
[0034]Elymus-R (5' -3/ ):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG。
[0035]實施例2:—種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的試劑盒，包括有:
[0036]第一組:老芒麥PCR檢測體系，PCR檢測體系的總體積為20μ1，其中包括
2X EcoTaq PCRSuperMixlO μ 1，引物 Elymus-FG' -3/ ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ I,弓 I 物 Elymus-R (5' -3/ ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I 和 ddH206 μ I;
[0037]第二組:披鹼草PCR檢測體系，PCR檢測體系的總體積為20μ 1，其中包括
2X EcoTaq PCRSuperMixlO μ 1，引物 Elymus-FG' -3/ ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ I,弓 I 物 Elymus-R (5' -3/ ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I 和 ddH206 μ I。
[0038]實施例3:—種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的試劑盒，包括有:
[0039]第一組:老芒麥PCR檢測體系與實施例2相同，數量為實施例2的兩倍。
[0040]第二組:披鹼草PCR檢測體系與實施例2相同，數量為實施例2的兩倍。
[0041]實施例4:一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的試劑盒，包括有:
[0042]第一組:老芒麥PCR檢測體系與實施例2相同，數量為實施例2的五倍。
[0043]第二組:披鹼草PCR檢測體系與實施例2相同，數量為實施例2的五倍。
[0044]實施例5:—種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的試劑盒，包括有:
[0045]第一組:老芒麥PCR檢測體系與實施例2相同，數量為實施例2的十倍。
[0046]第二組:披鹼草PCR檢測體系與實施例2相同，數量為實施例2的十倍。
[0047]實施例6:—種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的方法，包括如下步驟:
[0048]Α.收集種子，採用雙層濾紙萌發法，25°C萌發5-10天至露白，提取萌發種子基因組DNA備用；
[0049]B.利用老芒麥和披鹼草專用引物，對老芒麥種子基因組DNA進行PCR檢測。PCR檢測體系的總體積為50μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix (上海生工，產品編號:SK2082)25 μ 1，引物 Elymus-F (5' -3/ ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC1 μ 1，引物 Elymus-R(5 ' -3 ' ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I，ddH2020 μ I 和老芒麥 DNA 模板(50ng/ μ I)
3μ I。擴增條件為:(1)941:預變性31^11;(2)941:變性308;(3)601:退火308 「4)72。。延伸30s ；(5) 2-4步驟循環38次；(6) 72°C延伸7min ；
[0050]C.利用老芒麥和披鹼草專用引物，對披鹼草種子基因組DNA進行PCR檢測。PCR檢測體系的總體積為50μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix (上海生工，產品編號:SK2082)25 μ 1，引物 Elymus-F (5' -3/ ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC1 μ 1，引物 Elymus-R(5 ' -3 ' ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I，ddH2020 μ I 和披鹼草 DNA 模板(50ng/ μ I)3 μ I。擴增條件為:(1)94°C預變性 3min ;(2)94°C變性 30s ;(3)60°C退火 30s 「4)72。。延伸30s ；(5) 2-4步驟循環38次；(6) 72°C延伸7min ；
[0051]D.將老芒麥和披鹼草PCR產物在同一張8%非變性丙烯醯胺膠片中電泳，電泳電壓為180V，跑膠2.5h ；EB燃料染色5min，紫外燈下照相；
[0052]E.其電泳擴增條帶大小都在200bp_300bp之間，擴增條帶268bp為老芒麥；擴增條帶255bp為披鹼草。見圖2.[0053]實施例7:鑑定兩種老芒麥和披鹼草種子間的分子標記的方法，包括如下步驟:
[0054]從15份老芒麥和10份披鹼草種質中各抽取一種種質作為參試材料(見表1)。米用雙層濾紙萌發法，25° C萌發5-10天至露白，提取這兩個種質各15份單粒種子的基因組DNA，共3份。將其濃度稀釋為50ng/l.! 1，用作模板，採用Elymus-F和Elymus-R引物進行PCR擴增。
[0055]PCR檢測體系的總體積為50μ 1，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix (上海生工，產品編號:SK2082)25y 1，引物 Elymus-F (5' -3' ): AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ 1，引物Elymus-R (5' -3' ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ I，ddH2020 μ I 和 DNA 模板(50ng/ μ I)
3μ I。擴增條件為:(1)941:預變性31^11;(2)941:變性308;(3)601:退火308 「4)72。。延伸30s ；(5) 2-4步驟循環38次；(6) 72°C延伸7min。
[0056]將30份老芒麥和披鹼草的PCR產物在同一張8%非變性丙烯醯胺膠片中電泳，電泳電壓為180V，跑膠2.5h。然後EB燃料染色5min，紫外燈下照相。
[0057]其效果為:
[0058]圖2顯示老芒麥(W622137)和披鹼草(PI655096)各15個單粒種子的基因組DNA為模板，其電泳擴增條帶大小都在200bp-300bp之間，並且老芒麥(W622137)的電泳擴增片段大於披鹼草(PI655096)的電泳擴增片段。
[0059]表1.老芒麥和披鹼草種子參試種質的信息描述
[0060]
【權利要求】
1.一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的引物，其特徵是包括有: 老芒麥和披鹼草專用引物:Elymus-F (5' -3/ ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC ；
Elymus-R (5' -3/ ):TGAAATGGCTATCGCTTGACCG。
2.一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的試劑盒，其特徵包括有: 第一組:老芒麥PCR檢測體系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix,引物Elymus-F (5 ' -3 ' ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC,引物 Elymus-R (5 'TGAAATGGCTATCGCTTGACCG 和 ddH20 ； 第二組:披鹼草PCR檢測體系，其中包括2XEcoTaq PCR SuperMix,引物Elymus-F (5 ' -3 ' ):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC,引物 Elymus-R (5 'TGAAATGGCTATCGCTTGACCG 和 ddH20。
3.一種鑑定老芒麥種子真偽的特異分子標記的方法，其特徵是包括如下步驟: A.收集種子，採用雙層濾紙萌發法，20-300C，萌發5-10天至露白，提取萌發種子基因組DNA備用； B.利用老芒麥和披鹼草專用引物，對老芒麥種子基因組DNA進行PCR檢測；PCR檢測體系的總體積為 20μ 1，其中包括 2XEcoTaq PCR SuperMixlO μ 1，引物 Elymus-F(5' -3'):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGCI μ 1，引物 Elymus-1KS' -3/ ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ 1，ddH206 y I 和老芒麥DNA模板，50ng/y 1，2μ I ;擴增條件為:(1)94°C預變性 3min ; (2)94°C變性 30s ；(3) 60°C 退火 30s ；(4) 72°C 延伸 30s ；(5) 2-4 步驟循環 38 次；(6) 72°C 延伸7min ； C.利用老芒麥和披鹼草專用引物，對披鹼草種子基因組DNA進行PCR檢測；PCR檢測體系的總體積為 20μ 1，其中包括 2XEcoTaq PCR SuperMixlO μ 1，引物 Elymus-F(5' -3'):AGTACATTCTCTCCCTTTATGGC I μ 1，引物 Elymus-1KS' -3/ ): TGAAATGGCTATCGCTTGACCG I μ 1，ddH206 μ I和披鹼草DNA模板，50ng/y 1，2μ I ;擴增條件為:(I) 94 °C預變性3min ; (2)94°C 變性 30s ；(3) 60°C 退火 30s ； (4) 72°C 延伸 30s ；(5) 2-4 步驟循環 38 次；(6) 72。。延伸 7min。 D.將老芒麥和披鹼草PCR產物在同一張8%非變性丙烯醯胺膠片中電泳，電泳電壓為180V，跑膠2.5h ；EB燃料染色5min，紫外燈下照相； E.其電泳擴增條帶大小都在200bp-300bp之間，擴增條帶268bp為老芒麥；擴增條帶255bp為披鹼草。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789423SQ201410022961
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】劉志鵬, 羅棟, 馬利超, 王彥榮, 王宇 申請人:蘭州大學