使用核糖體蛋白提取物(rpe)的寄生蟲病如利什曼病的診斷的製作方法

2023-12-02 03:04:36

專利名稱：使用核糖體蛋白提取物(rpe)的寄生蟲病如利什曼病的診斷的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種使用核糖體蛋白提取物(RPE)的寄生蟲病如利什曼病 (Leishmaniasis)的診斷方法。
背景技術：
犬內臟利什曼病(Canine Visceral Leishmaniasis, CVL)是一種重要的在地中海盆地、中東和拉丁美洲國家00)出現的人畜共患病。這種嚴重疾病在地中海地區、中東和亞洲國家是由Leishmania infantum引起的，而在拉丁美洲是由L. chagasi引起的00， 21)。由於它們的基因型相關性，這兩個在不同的洲引起CVL的物種可以認為是相同的 (26)。感染後的犬可能發展為不同形式的疾病；無症狀(asymptomatic)，輕症狀 (oligosymptomatic)或有症狀(symptomatic) (4)。有症狀的感染導致死亡，它的臨床表現包括皮膚改變，如脫髮，皮炎，甲彎曲(onychogryphosis) (3，11)，以及具有腎，肝和腦改變的內臟表現(18二8)。一些受感染的犬保持無症狀或發展為輕微的溫和症狀而被劃分為多症狀(4)。由於感染的犬(即使是無症狀的)是人類感染的寄生蟲的主要的作為寵物飼養的攜帶者(1)，所以CVL不能被僅僅認為是一種獸醫病。因此，為了減少Leishmania從犬到人的傳播，有必要儘早對犬利什曼病進行診斷。在無症狀、輕症狀及有症狀的感染的犬0，9，34)中，抗Leishmania的特異性抗體的存在使包括免疫螢光抗體檢測(IFAT)、免疫印跡、免疫色譜檢測，和酶聯免疫吸附檢測 (ELISA)的血清學檢測得以發展(在中綜述)。使用基於天然的可溶性Leishmania 抗原(SLA)的ELISA分析對CVL的診斷具有較高的敏感性，但由於Leishmania和其它病原性原生動物(16)之間的抗原相關性，因而具有較低的特異性。作為發展用於CVL的特異性血清學檢測的策略，以重組蛋白的形式獲得了不同的寄生蟲抗原(5，10二4)。然而，由於觀測到單個的感染的犬對不同的寄生蟲抗原在體液免疫反應(19，31)中存在高可變性，因此基於重組蛋白的有效診斷可能需要一個重組蛋白的混合物或含有若干個非相關的寄生蟲抗原(6，31，36)的人工設計的蛋白(chimerical protein)。可以通過由免疫印記雜交分析的天然寄生蟲的碎片或從所述寄生蟲純化出的製品的使用來發展CVL的特異性診斷。例如，以及開發了基於可溶性Leishmania抗原(SLA)的ELISA檢測07，31)。但是，這種基於SLA的檢測對診斷無症狀利什曼病還不夠特異。此外，來自患有不同於利什曼病的其它寄生蟲病的受試者的血清，會在基於SLA的檢測中產生假陽性反應。因此，仍需要對寄生蟲病如利什曼病的不具有現有方法的缺陷的改進的診斷方法。

發明內容
本發明中，我們展示了 RPE，尤其是Leishmania的RPE (LRPE)，可以方便地用於寄生蟲病如利什曼病的診斷這種新的診斷方法比已知的診斷方法如示例中證明的基於SLA
3的方法更特異。這種新方法允許了利什曼病症狀前診斷，為了預防或減少利什曼原蟲從犬到人的傳播，這是至關重要的。本發明進一步說明如下。用途第一方面，提供了核糖體蛋白提取物(RPE)在診斷受試者中的寄生蟲病中的用途。根據本文所定義的，核糖體蛋白提取物是使用出現於受試者中時引起寄生蟲病的寄生蟲細胞，通過進行如下步驟得到的a.將寄生蟲細胞與裂解緩衝液混合， b.將所得混合物離心，得到細胞質提取物，c.從得到的細胞質提取物中製備核糖體蛋白提取物。在步驟a中，寄生蟲優選是指原生動物。優選的寄生蟲在本文中隨後有定義。更優選地，原生動物處於前鞭毛體階段(promastigote stage) 0技術人員公知用於製備所需數量的RPE大概需要的寄生蟲細胞的數量。典型地，為了製備500微克的RPE，要使用3X109 個寄生蟲細胞。裂解緩衝液是可以分解至少部分的寄生蟲細胞的緩衝液。至少部分優選是指至少50 %的細胞，或至少60 %，70 %，80 %，90 %或100 %。一種優選的裂解液含有非離子表面活性劑。用Nonidet P 40 (NP40)作為非離子表面活性劑可以得到好的效果。然而， 其他非離子表面活性劑也可以使用。一種優選使用的裂解液(緩衝液A)如下10mM Tris HCl，pH 8. 0,150mM NaCl, 1. 5mM MgCljP 0. 5% NP40 (Roche)，以及優選添加蛋白酶抑制劑， 如 PMSF ImM, Leupeptin 8 μ g/ml, Aprotinin 4 μ g/ml 禾口 Pentatin 8 μ g/ml)。典型地，用印pendorf移液器輕輕地將適量的寄生蟲細胞(IO9個細胞/ml緩衝液A)與該裂解緩輕輕混合ο在步驟b中，至少對步驟a得到的混合物施加一個步驟的離心。通常地，第一個離心步驟在3000g下進行2分鐘。優選將得到的上清液在4°C下再次進行13000g下15分鐘的離心1次或2次。在步驟c中，將得到的上清液用於製備如05)中所述的RPE。簡言之，將得到的上清液於在4°C下90000rpm下高速離心30分鐘。使用的轉子優選為Beckman TL100. 3轉子。 得到的沉澱為粗核糖體顆粒，將沉澱在合適的緩衝液如緩衝液B(20mM Tris-HCl, pH 7.4， 500mM AcNH4, IOOmM MgCl2, 5πιΜβ -巰基乙醇)中重懸浮，並且通過合適的緩衝液如緩衝液A 中不連續的蔗糖梯度00/40% )在4°C下90000rpm下離心。這裡同樣地，使用的轉子優選TL100.3轉子。獲得的沉澱含有核糖體。優選將這種沉澱溶解在PBS (磷酸鹽緩衝液) 中，超聲處理並在-70 0C下保存。核糖體蛋白是保守的細胞質蛋白。因此，根據本文所定義的RPE可以從任何真核生物中製備，所述真核生物可以為植物或動物，所述真核生物可以為哺乳動物、爬行動物、 魚類、昆蟲或任何其它攜帶染色體的生物，如原生動物。RPE優選從與疾病密切相關的生物中得到，優選從在進化樹中的引起寄生蟲病的生物中得到。因此，特別注意的是，用於寄生蟲病治療的RPE的來源為原生動物，如瘧原蟲，以及具體地為錐蟲科的成員，更具體地為錐蟲原生動物Leishmania或Trypanosoma中的不同的種。有20多個已知的Leishmania 中的種，包括Leishmania亞屬和Viania亞屬；Leishmania亞屬包括L. major複合組、
4L Donovani 複合組禾口 L. mexicana 複合組；L. major 複合組包括 L. major ；L Donovani 複合組包括 L. chagasi、L. donovani 禾口 L. infantum ；L. mexicana 複合組包括 L. amazonensis 禾口 L. mexicana ；Viania 亞屬包括 L. braziliensis 複合組禾口 L. guyanensis 複合組； L. braziliensis 複合組包括 L. braziliensis 禾口 L· peruviana ；L. guyanensis 複合組包括 L. guyanensis 禾口 L· panamensis0 Plasmodium 的種中特別注意的是Plasmodium falciparum 和Plasmodium vivax。在一種優選實施方式中，RPE是從Leishmania的種中得到的，優選是從Leishmania major和/或Leishmania infantum中得到的。在另種優選實施方式中， PRE是從Plasmodium的種中得到的。技術人員知曉，RPE也可以通過將來自本文所述的若干不同生物的RPE來得到。由於RPE含有大量的不同抗原，本發明的RPE診斷方法中的用途相比給定蛋白的用途是極有很吸引力的。這些蛋白中的每一種都能潛在地診斷出受試者中的免疫反應的存在。此外，也存在與抗原A有反應，但與抗原B沒反應的個體，反之亦然。 因此，由於既然包含了大量不同的抗原，本文中所用的RPE是用來在廣泛的受試者群體中使用的。在一種優選的實施方式中，RPE含有至少一種核糖體蛋白，和/或核糖體蛋白的至少一種抗原，和/或核糖體蛋白的至少一個蛋白片段。在一種更優選的實施方式中，RPE含有至少兩種核糖體蛋白，和/或核糖體蛋白的至少兩種抗原，和/或核糖體蛋白的至少兩個蛋白片段。本文中所定義的蛋白片段是指相應的核糖體蛋白的含有至少2、3、5、7、10、15、 20、25、30或更多個的連續的胺基酸的片段。在另一種實施方式中，本文中所定義的RPE不含有Leishmania infantum的酸性核糖體蛋白PO和/或來源於Leishmania braziliensis 的核糖體抗原LbeF4A，或不由Leishmania infantum的酸性核糖體蛋白PO和/或來源於 Leishmania braziliensis的核糖體抗原LbeF4A組成。在另一種實施方式中，本文中所定義的RPE不含有如EP 824699所公開的來源於Leishmaniasis chagasi的酸性核糖體蛋白抗原LcPo的抗原決定簇或不由如EP 824 699所公開的來源於Leishmaniasis chagasi的酸性核糖體蛋白抗原LcPo的抗原決定簇組成。更優選地，RPE不含有LcPo的C末端的17 個胺基酸或不由LcPo的C末端的17個胺基酸組成=LcPo的C末端的17個胺基酸為EP824 699的SEQ ID NO 2所示的LcPo的胺基酸306-322，LcPo的C末端的17個胺基酸也如序列表中的SEQ ID NO 1所確定。本發明的一個優點是它實現了對廣泛的寄生蟲病譜的特異性和早期的診斷。其中，寄生蟲病的一個實例為利什曼病。在一種優選的實施方式中，寄生蟲病為利什曼病或瘧疾。更優選地，寄生蟲病是由Leishmania的種或Plasmodium的種引起的。在進一步優選的實施方式中，引起寄生蟲病的種不同於RPE來源的種。詳細地，由Leishmania屬的一個種引起的利什曼病可以通過基於來源於另一個Leishmania的種的RPE的組合物的使用而得到診斷。在一種實施方式中，由L. major引起的利什曼病用含有來源於L. infantum的RPE 組合物得到了成功地診斷。備選地，其它寄生蟲病，如瘧疾，可以用基於其它種的RPE組合物得到成功地診斷，例如基於L. infantum的RPE。在本發明的文本中，受試者(subject)是指人或動物。本發明範圍內的動物包括哺乳動物，優選為人或犬。原則上，使用本發明可以診斷任意的受試者。診斷方法可在受試者中按需要經常地使用。優選地，受診斷的受試者為疑似有曾經感染引起所述寄生蟲病的所述寄生蟲的風險的受試者。疑似有曾經感染所述寄生蟲的風險的受試者可能生活在疫區或曾經到過疫區。疫區包括從阿爾及利亞到沙烏地阿拉伯、肯亞、蘇丹、衣索比亞的北非國家。疫區還包括歐洲南部地中海沿岸國家、西班牙、法國、希臘等。還包括美洲中部(所有國家)和南部巴西、委內瑞拉、秘魯、玻利維亞、哥倫比亞、阿根廷北部、巴拉圭、烏拉圭； 亞洲中部到西南部印度、伊朗、伊拉克、蒙古、尼泊爾、孟加拉國。在本發明的文本中，在此所定義的用途優選是指體外或體內的用途。用途優選是指在來自所述受試者的樣品上進行的用途。優選的樣品包括血液，血清，血漿，唾液，腦脊液或尿。更優選地，所述樣品是從受試者中得到的血液或血清樣品。在一種優選的實施方式中，在所述寄生蟲病的症狀出現之前得到診斷結論，即所謂的症狀前診斷或無症狀受試者的診斷。在本文中，「症狀前」優選是指在首次症狀出現前的至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少 9天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天或更長時間。與寄生蟲病如利什曼病相關的首次症狀或首次臨床表徵可以選自下列發熱、脾腫大、肝腫大、淋巴結病變、結膜炎、皮炎、甲彎曲、角膜結膜炎、情感冷漠和精神萎頓。這些症狀大多數可以通過外部體檢得到初步檢查。結膜炎、皮炎、甲彎曲、角結膜炎各自為皮膚改變的表現形式。與利什曼病相關的首次症狀優選為淋巴結病變。它可以通過外部體檢如觸診得到檢查。在另一種優選的實施方式中，在所述寄生蟲病的症狀部分出現之前得到診斷結論，即所謂的輕症狀受試者的診斷。在本文中，「輕症狀」優選是指具有如上所定義的症狀中的至多3個的受試者。在另一種優選的實施方式中，在所述寄生蟲病的症狀全部出現之前得到診斷結論，即所謂的有症狀受試者的診斷。在本文中，「有症狀」優選是指具有如上所定義的症狀中的至少4個的受試者，如上所定義的症狀包括如上所定義的皮膚改變的表現形式。技術人員知曉，最重要的診斷類型是無症狀受試者的診斷，這是因為如果他們在這一階段得到診斷結論，將有助於防止疾病的進一步蔓延，無症狀的受試者也可以得到更有效地幫助和治療。方法在第二個方面，提供了一種用RPE診斷受試者中的寄生蟲病的方法，該方法包括測定在從受試者得到的樣品中是否存在識別RPE的抗體。本發明的優選方法是本發明優選在體外或體內進行的優選用途。在前文中已經給出了定義。在一種優選的方法中，RPE為組合物。RPE在前文中已有定義。在優選的實施方式中，在所述組合物出現其它化合物。備選地，在所述組合物不出現其它化合物。在一種優選的實施方式中，其它化合物與RPE—起依次或同時使用，以提高該方法的特異性。例如，可以方便地使用能夠區分無症狀、輕症狀或有症狀的受試者以及接種疫苗的受試者的其它化合物。更優選地，在單一的組合物中，這些化合物不會與RPE—起出現。例如，可以使用引起寄生蟲病如利什曼病的寄生蟲的其他的非相關抗原(31)。另一個例子是使用含有若干寄生蟲抗原(6，36)的多蛋白。優選的抗原包括組蛋白或它的片段或編碼所述組蛋白的核酸分子。更優選地，組蛋白為如EP 1 687 023中所確定的H2A，H2B， H3和H4。組蛋白H2A，H2B, H3和H4是高保守的核蛋白，其序列在本領域是公知的，例如參見Requena等，Trends in Parasito 1. QOOO) 16 :對6。優選地，所述組蛋白來自在進化樹中與致病生物較近的生物。因此，用於治療寄生蟲病如利什曼病的組蛋白的特別優選的來源為原生動物，特別是錐蟲科的成員，例如瘧原蟲，更具體地是錐蟲原生動物Leishmania的不同的種。在更優選的診斷方法中，當出現了可檢測到的量的識別RPE的抗體時和/或當出現了所述抗體的數量的升高時，診斷結論為寄生蟲病。在對照或健康的受試者中，所述抗體一般無法檢測到。檢測所述抗體存在時通過使用是本領域技術人員公知的的方法進行的，例如 ELISA。優選的檢測方法在標題為試驗的部分有描述。識別RPE的抗體是指存在至少一種抗體，該抗體至少能夠識別出一種在RPE中存在的化合物。所述化合物可以為核糖體蛋白或核糖體蛋白片段或核糖體蛋白的核糖體抗原。檢測法在第三個方面，提供了用於診斷受試者中的寄生蟲病的一種檢測裝置或一種檢測法，其中所述裝置或所述檢測法包括RPE。特異性地識別RPE的抗體可以通過本領域技術人員公知的任意的標準方法得到檢測(例如，參見，Harlow和Lane，Antibodies =A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988,通過弓|用併入至Ij本文)。合適的方法包括親和層析共電泳(ACE)檢測法和(酶聯免疫吸附檢測法)ELISA。優選地，所述檢測法包括ELISA。以下更展開地描述了若干中檢測法。在一種優選的實施方式中，檢測法包括用固定在固體支持物的RPE來結合或去除樣品中的抗體。然後可以通過使用與抗體/RPE複合體結合併含有檢測報告基團的檢測試劑來檢測該結合的抗體。合適的檢測試劑包括可以結合抗體/RPE複合體的抗體，和標記有報告基團的自由多肽(如在半競爭檢測法中)。備選地，可以使用競爭檢測法，在競爭檢測法中，同RPE結合的抗體用報告基團標記，並且在RPE與樣品孵育後可以同固定化的RPE結合。樣品成分對標記抗體同RPE結合的抑制程度指示了樣品與固定化RPE的反應。RPE可以附著在固體支持物上，所述固體支持物可以為本領域技術人員公知的任何材料。例如，支持物可以為微孔板中的檢測孔或硝酸纖維素膜或其它合適的膜。備選地， 支持物可以為珠或盤，如玻璃、玻璃纖維、乳膠或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持物也可以為磁顆粒或光纖傳感器，例如那些已公開的支持物，例如，在美國專利號5，359,681 中公開的。RPE可以使用本領域技術人員公知的各種技術結合在固體支持物上。在本發明的文本中，術語「結合」既指非共價聯合，如吸附，又指共價結合(即，抗原和在支持物上的功能基團的直接結合，或通過交聯劑的方式的結合)。優選通過在微孔板中的孔的吸附或膜的吸附的結合。這種情況下，可以通過在合適的緩衝液中，使RPE與固體支持物接觸合適的固定時間來達到吸附。所述接觸時間隨溫度而變化，但典型地為1小時到1天。在一般情況下，將塑料微孔板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)中的孔與10納克到1克，優選100納克的 RPE接觸，就足夠結合合適數量的RPE。RPE—般可以通過與支持物和雙功能試劑的第一反應實現與固體支持物的共價結合，該雙功能試劑同支持物和功能基團都反應，功能基團如多肽上的羥基或氨基基團。例如，RPE可以通過苯醌的使用，或通過支持物上的醛基與多肽上的胺和活性氫的縮合來結合到具有合適的聚合物包被的支持物上(例如，參見Pierce Immunotechnology Catalog andHandbook (1991)，A12-A13)。在特定的實施方式中，檢測法為酶聯免疫吸附檢測法(ELISA)。該檢測法可以通過如下方式進行將固定在支持物上的RPE與樣品進行第一接觸，以使樣品中對RPE特異的抗體與固定化的RPE結合，支持物通常為微孔板。然後將未結合的樣品從固定的RPE中去除， 加入能夠與固定的抗體-RPE複合物結合的檢測試劑。然通過使用適用於特定檢測試劑方法，測定與固體支持物結合的檢測試劑的數量。一旦RPE被固定在支持物上，通常將支持物上剩餘的蛋白結合位點封閉。可以使用本領域技術人員公知的任何合適的封閉試劑，如牛血清白蛋白(BSA)或吐溫20(Sigma公司，聖路易斯，密蘇裡州)。然後將固定的RPE同樣品一起孵育，從而使得抗體(如果樣品中存在)同RPE相結合。在孵育前，可以用合適的稀釋劑如磷酸鹽緩衝液(PBQ來稀釋樣品。 在一般情況下，適當的接觸時間(即孵育時間)是足夠允許檢測樣品中抗體是否存在的時間。優選地，接觸時間足以達到結合和未結合之間至少有95%的平衡的結合的水平。本領域普通技術人員公知，達到平衡所需的時間，可通過檢測發生在一段時間內的結合的程度來容易地確定。室溫條件下，約30分鐘的孵化時間是足夠的。然後可以通過用合適的緩衝液清洗所述固體支持物來去除未結合的樣品，所述緩衝液例如含0. 吐溫20tom的PBS。然後可以將檢測試劑加到固體支持物上。合適的檢測試劑為能夠結合固定抗體-RPE複合體並能夠通過本領域公知的多種方法檢測出來的化合物。優選地，所述檢測試劑含有與報告基團連接的結合劑(如，例如，Protein A.Protein G、免疫球蛋白、凝集素或自由抗原)。優選的報告基團包括酶(如辣根過氧化物酶)、底物、 輔因子、抑制劑、染料、放射性核素、發光基團、螢光基團和生物素。結合劑與報告基團的連接可以通過使用本領域普通技術人員公知的標準方法來實現。常規的連接多種報告基團的結合劑可以從多種渠道購買得到(例如，Zymed實驗室，San Francisco, CA和Pierce， Rockford, IL)。然後將所述檢測試劑同固定的抗體RPE複合物孵育足夠的時間，以檢測固定的抗體。合適的檢測時間通常可由製造商的使用說明得到，或由通過分析一段時間內發生的結合的水平來測定。然後去除未結合的檢測試劑，結合的檢測試劑通過報告基團得到檢測。檢測報告基團的方法依賴於報告基團的屬性。對於放射性基團，一般適用的是閃爍計數或放射自顯影方法。光譜方法可以用於檢測染料、發光基團和螢光基團。生物素可以通過耦合了不同的報告基團(通常是一個放射性的螢光基團或是酶)的親和素的使用得到檢測。這些被。酶報告基團可以通過底物的添加(通常維持一段特定的時間)，和隨後的光譜或對反應產物的其它分析得到檢測。為了確定樣品中寄生蟲病如利什曼病的特異性的抗體是否存在，將從仍然結合在固體支持物上的報告基團檢測而來的信號，與對應於預先確定的截點值進行比較。在一種優選的實施方式中，所述截點值優選為當固定化的RPE與來自未感染的受試者的樣品孵育時得到的平均信號。一般地，認為產生比預先確定的截點值高出標準偏差的三倍的信號的樣品是陽性的(即，與RPE反應)。在另一種備選的優選實施方式中，根據Mckett等人 Clinical Epidemiology :A Basic Science for Clinical Medicine, p. 106-7(Little Brown and Co. , 1985)中的方法,所述截點值通過使用Receiver Operator Curve法來確定。簡要地說，在這種實施方式中，截點值可以通過配對應於每個可能的用於診斷檢測結果的截點值的真陽性率(即，敏感性)和假陽性率(100% -特異性)的作圖來確定。圖上的最接近左上角的截點值(即，包括了最大區域的值)的截點值是最精確的截點值，當樣品產生高於通過這種方法確定的截點值的信號時，可以認為該樣品為陽性。備選地，截點值可以沿著圖移動到左邊，以減小假陽性率，或是移動到右邊，以減小假陰性率。在一種相關的實施方式中，檢測法以流體或條帶檢測方式來進行，其中，RPE固定在膜例如硝酸纖維素膜上。在流體檢測方式中，隨著樣品經過膜，樣品內的抗體與固定的RPE結合。然後在含有所述檢測試劑的溶液流過膜的時候，檢測試劑(例如，Protein Α-colloidal gold)與抗體-RPE複合體結合。然後可以按照如上所述進行結合的檢測試劑的檢測。在條帶檢測方式中，膜的結合RPE的一端浸入到含有樣品的溶液中。樣品沿膜穿過含有檢測試劑的區域並向固定多肽的區域移動。RPE的檢測試劑的濃度指示了抗體的存在，該抗體對樣品中可以引起寄生蟲病如利什曼病的寄生蟲抗原有特異性。典型地，檢測試劑的濃度在那個位置中可以產生圖案，比如線形，並且是肉眼可讀的。這種圖案的缺失指示陰性結果。一般地，如上所述，選擇固定在膜上的RPE的量，以使得當樣品含有足夠在ELISA 中產生陽性信號的水平的抗體時，能產生肉眼可見的圖案。優選地，在膜上固定的RPE的量為25ng到500ng。這種檢測可以典型地使用極小量的受試者的血清或血液來進行。任何受試者或醫生都能在辦公室/家庭使用這種裝置，並可以按需要經常地重複使用這種裝置和測試法。通常地，在測試法中使用另外的分子作為陽性或陰性對照。一種典型的陽性對照可以為識別已知在待檢測樣品中存在的分子的抗體。典型的陰性對照可以為識別已知在待檢測樣品中不存在的分子的抗體。在本文件和它的權利要求書中，動詞「含有」和它的變化形式以它的非限制性含義使用，意思是下面是文字是被包括的，但並不排除沒有具體提到的項目。此外，動詞「組成」 可以被「基本上組成「取代，意思是本文中定義的產品、檢測裝置、方法或用途可能分別包括額外的組件、額外的步驟、額外的成分、這些不改變本發明的獨有特性。此外，不定冠詞「一個」並不排除超過一個或多個元素的可能性，除非文意需要有一個並只有一個元素。因而不定冠詞「一個」通常意味著「至少有一個」。在本說明書中所引用的所有的專利和文獻參考均以它們整體引用的方式併入本文。本發明通過下列實施例進一步說明，這些實施例並不構成對本發明的範圍的限制。


圖1、(A)L. infantum核糖體蛋白在線性10-14%梯度SDS-PAGE凝膠中電泳，轉移到硝酸纖維素膜上然後和健康犬的血清(條帶1-3)、自然感染L. infantum並有症狀CVL犬的血清(條帶4-13)雜交。血清各自1 200稀釋稀釋後使用。(B)L. infantum核糖體蛋白的2D-PAGE。左圖的為代表性的銀染色凝膠。將相似的凝膠轉移至硝酸纖維素膜上，並與 (A)中使用的CVL血清(1 200)的混合物進行雜交。圖2、LRP和SLA診斷的敏感性比較。(A)有症狀CVL犬的血清和對照血清對LRP
9和SLA的ELISA反應性。(B)輕症狀CVL犬的血清和無症狀CVL犬的血清對LRP和SLA的 ELISA反應性。展示了 CVL血清的平均值。虛線表示截點值，該截點值定義為平均光密度值加上健康對照血清的標準誤差值的三倍值。圖3、LRP和SLA診斷的特異性比較。(A)感染T. gondii或者T. cruzi的犬的血清對LRP和SLA的ELISA反應性。(B)注射了 Leishmune疫苗@或Leishtec 疫苗後犬的血清對LRP和SLA的ELISA反應性。展示了 CVL血清的平均值。虛線表示截點值，該截點值定義為平均光密度值加上健康對照血清的標準誤差值的三倍值。
具體實施例方式實施例材料和方法寄生蟲 Leishmania chagasi (M0M/BR/1970/BH46)和 L. infantum(MCAN/ES/1996/ BCN/150，MON-1)在和pH值為7. 4的條件下在添加了 20%熱滅活胎牛血清(Sigma公司，聖路易斯，密蘇裡州，美國)，20mM的L-穀氨醯胺，200U/mL的青黴素，100g/mL的鏈黴素和50克/毫升的慶大黴素的khneider』 s培養基(Sigma公司，聖路易斯，密蘇裡州，美國)
中培養。抗原的製備如已經描述過的(12)，SLA是從在液體培養基中傳代若干次後的 L. chagasi和L. infantum的穩定期前鞭毛體中製備的。簡單地說，將5毫升的2 X IO8個/每毫升的前鞭毛體用冷的無菌磷酸鹽緩衝液(PBQ洗3次。經過重複6個循環的凍融後38MHz 下超聲(超聲波處理器，GE)(600)處理5個循環，每個循環30秒，懸浮液在4°C和8，OOOg下離心30分鐘，收集含有SLA的上清。用Bradford法(7)測定蛋白濃度，並將500 μ L的分裝在-70°C下存儲。LRP是從前文所述的L. infantum的對數期前鞭毛體中製備的。簡單地說，收穫 IXlO9的前鞭毛體，用預冷的PBS洗兩次，重懸於1毫升NP40裂解液(IOmM Tris HCl，pH 8. 0，150mM NaCl，1. 5mM MgCl2JPO. 5%NP40)用移液器上下吹打10次。裂解後，樣品在4°C 和3000 Xg條件下離心2分鐘，沉澱細胞核。上清在4°C和13000 Xg條件下離心15分鐘共兩次。經過純化細胞質上清液通過貝克曼TL100. 3轉子在4°C和90，OOOrpm條件下高速離心 30 分鐘。粗核糖體沉澱在緩衝液 AQOmM Tris-HCl,pH 7. 4,500mM AcNH4, IOOmM MgCl2, 5mM β-巰基乙醇)中重懸浮，並通過TL100. 3轉子在4°C和90000rpm條件下離心通過緩衝液A中的不連續蔗糖梯度00/40% )。血清樣品血清樣品是在西班牙和巴西收集的。來自西班牙的CVL血清樣品採集於埃斯特雷馬杜拉地區的觀只臨床上有症狀的犬。L. infantum感染的動物在西班牙卡塞雷斯地埃斯特雷馬杜拉大學獸醫學院寄生蟲學系進行臨床和分析評估。當出現三種或多種以下症狀時，認為動物是有症狀的體重減輕、脫毛、淋巴結腫大、甲彎曲、肝腫大、結膜炎以及鼻子、尾巴和耳朵邊緣的剝脫性皮炎。當用間接免疫螢光法進行測試時，所有血清都呈陽性，通過在腿彎部和肩胛骨前的淋巴節點直接觀察證實了寄生蟲的無鞭毛體形式的存在。 對照血清取自埃斯特雷馬杜拉大學寄生蟲學系的8隻健康動物。使用的血清標本取自巴西米納斯吉拉斯貝洛奧裡區的58隻L. chagasi感染的犬 (44隻臨床上有症狀的，7隻輕症狀的和7隻無症狀的)的。如上所述，當出現三種或更多種的臨床症狀時，認為動物是有症狀的；當出現一種或兩種症狀時，為輕症狀；當不出現症狀時，為無症狀。如上所述，當骨髓抽出物的Giemsa染色塗片中觀察到無鞭毛體時，或者當在外周血或骨髓抽出物的培養物中辨認出有前鞭毛體時，VL的診斷得到確認。來自巴西犬的血清由Evaldo Nascimento和Maria Norma Melo (寄生蟲學系，米納斯吉拉斯州聯邦大學，貝洛奧裡藏特，米納斯吉拉斯，巴西)提供。取自生活在VL疫區，但沒有犬利什曼病的臨床症狀或疑似，且寄生蟲學和血清學檢測後呈陰性的47隻犬的血清組成了對照組。將具有其它寄生蟲感染的犬的14個血清樣品用於分析交叉反應，所述其它寄生蟲感染如下 Toxoplasma gondii (η = 5)禾口 Trypanosoma cruzi(n = 9)。在實驗中使用了血清標本禾口接種Leishmune (η = 18)或Leishtec (η = 23)疫苗的健康犬的血清標本。ELISA法在100 μ L的包被緩衝液和pH為9.6且4°C下，將微孔免疫檢測板用 L. infantum 或 Lchagasi 的 SLA，或 L. infantum 的 LRP (每一個 0. 5 微克 / 孔)包被 18 個小時。通過滴定曲線以確定要使用的最優的蛋白濃度和抗體稀釋度。空白結合位點通過 PBS-0. 05%的吐溫20 (PBST)和3%的酪蛋白溶液在37°C下封閉2小時。經過PBST洗滌三次後，酶標免疫檢測板在37°C下用100 μ L的犬血清孵育1小時。血清標本在PBST和 0.3%的酪蛋白中1 200稀釋。酶標免疫檢測板洗七次後用1 10，000的連接辣根過氧化物酶的抗犬IgG抗體(Sigma公司，美國聖路易斯)孵育。反應是通過pH值為5. 0的過氧化氫，orto-苯二胺和檸檬酸-磷酸緩衝液在黑暗中孵化30分鐘，通過添加20 μ L過氧化氫2Ν終止反應來曝光的。光密度通過ELISA微孔板分光光度計(Molecular Devices, Spectra Max Plus. Concord, ON, Canada) ^t 492nmWestern blot 在 SDS-PAGE 中，將 L. infantum 的 LRPs (15 μ g)在 Laemmli，s 的緩衝液中重懸浮，並使用BioRad公司的蛋白電泳minigel系統(Hercules，CA，USA)在帶有製備梳的10-14%的梯度的SDS-PAGE凝膠中解析。在2D-PAGE中，L. infantum的LRPs溶解於 200 μ 1 的裂解液(0. 5% Nonidet Ρ40, ImM EDTA，ρΗ8· 0，0. ImM PMSF, IOmM Tris HCl,pH 7. 4，和ImM DTT)並通過同等體積的苯酚萃取。存在於有機相中的蛋白用5倍體積的醋酸銨緩衝液(溶解於甲醇中的0. IM醋酸銨)沉澱，並用80%丙酮洗滌三次。乾燥的沉澱重新懸浮於水化緩衝液中(7Μ 尿素，2Μ 硫脲，0. 5% IPG buffer (3-10)，4% CHAPS，40mM 的 Tris HCl，pH 8. 8，0.002%溴酚藍)，離心除去不溶性物質。蛋白吸附到Immobiline DryStrip, pH3-10，ll釐米(GE醫療集團，瑞典烏普薩拉)上。水化和等電聚焦(IEF)使用IPGphor系統(GE公司)根據製造商的說明進行。IEF後，IPG膠條在添加了 20毫克/毫升DTT的平衡緩衝液(6M 尿素，2% SDS，0. 375M Tris HCl，，pH 8. 8，20%甘油，0. 002%溴酚藍)中 15 分鐘，然後用添加了 25毫克/毫升碘乙醯胺平衡緩衝液再平衡15分鐘。將平衡後的IPG 膠條放置在12%的SDS-PAGE凝膠上(BioRad公司)。2D-PAGE凝膠用銀染色試劑盒(GE Healthcare公司)進行硝酸銀染色。在這兩種情況下，電泳後凝膠轉移到硝酸纖維素膜(通用電氣醫療集團)上。 雜交使用的探針為單個的(SDS-PAGE)或合併的(2D-PAGE)L. infantum感染的犬血清 (1 200)。，從北歐的免疫學實驗室(蒂爾堡，荷蘭)購買連接辣根過氧化物酶的抗犬IgG 的抗體(1 2000)作為二抗使用。統計分析通過使用非配對Mudent』 s t_檢驗，對所有數據的比較進行顯著性檢測，P值< 0. 05被認為是統計學上顯著的。
11
結果在犬感染中L. infantum的LRP的抗原性為了分析在犬感染中LRP的抗原性，將來自自然感染L. infantum的10隻犬的血清與帶有從該寄生蟲中提取的LRP的硝酸纖維素膜共同孵育。所有受感染的動物血清中都能識別出這種寄生蟲純化的蛋白組分(圖1A，泳道 4-13)。健康犬的血清呈陰性或微弱地在粗的核糖體準備物中具有一些多肽的染色(圖1A， 泳道1- 。雖然不同的個體犬血清之間識別模式的複雜性和強度不同，但是大部分的CVL 血清都識別出了高數量的蛋白條帶。儘管觀察的不確定性，但是仍然在雜交中發現了兩個免疫優勢區域分別為45-36kDa和25_22kDa的多肽。為了在更高的細節上分析蛋白識別的模式，通過高解析度的2D-PAGE分離LRP的提取物。如圖IB右圖所示，以製備蛋白上樣量(20 μ g)製備的凝膠表現出良好的解析度， 大部分鹼性蛋白僅具有最小的條紋(圖1，左圖)。當2D-PAGE凝膠和上述相同的合併的血清孵育時，檢測到了 20個抗原點(圖1B，右圖)。CVL的血清學診斷的SLA和LRP的比較為了確定LRP提取物是否可作為CVL的血清學診斷的一種有價值的工具，我們分析了 127犬血清樣品對LRP和SLA的反應性。第一血清組由來自感染L. infantum (η = 28)或L chagasi (η = 44)的有症狀的犬的72個血清樣品組成。第二組由來自陽只健康犬的血清組成。圖2A顯示有症狀的CVL和對照血清的吸光度值。對於這兩種蛋白製劑，CVL和對照血清之間的差異都是統計學上顯著的(P < 0. 001)。LRP和SLA的吸光度值的譜圖是不同的，CVL血清對SLA的反應性(平均值= 1. 79 士 0. 64)要比對LRP的反應性(平均值=0. 90 士 0. 63)更高。如標準差(SD)所指示的， 儘管SLA作為抗原時SD較高，仍觀察到了兩種抗原製劑在單個血清樣品吸光度值中的高可變性。健康血清對SLA的反應性(平均值=0. 38士0. 13)也高於對LRP的反應性(平均值 =0. 0卯4士0. 047)。在材料和方法中所述的ELISA條件中，兩種抗原的截點值(定義為健康血清的平均反應性值從加3倍SD值)中，LRP為0. 237，而SLA為0. 774。這些截點值使我們能夠識別陽性和陰性的血清，因此能測算ELISA的表現參數(見表1)。由於LRP在ELISA 檢測法中表現出與SLA類似的表現(高靈敏度和特異性值)，可以得出結論，Leishmania的核糖體蛋白是合適的用於診斷有症狀的CVL的抗原。接下來，對從輕症狀(n = 7)和無症狀(n = 7)的犬取得的血清進行了檢測(圖 2Β)。所述兩組和健康對照的血清對LRP和SLA的反應性具有顯著性差異(P < 0. 001)。雖然使用了有限的血清，但獲得的數據表明，來自輕症狀的犬的血清能夠識別LRP和SLA製劑 (敏感性為100% )，來自30%無症狀的犬(3/7)的血清表現出比截點值(圖2Β)更高的針對SLA的吸光度值。另一方面，檢測的所有無症狀的犬血清表現出高於截點值的對LRP的吸光度值。因此，我們的結果表明，使用LRP可以作為一種優秀的CVL血清學診斷工具。LRP和SLA交叉反應由於LRP是由進化保守的蛋白組成的，我們分析了 LRP的提取物與其它單細胞原生動物(Toxoplasma gondii (η = 5)和Trypanosoma cruzi(n = 9))感染的犬血清的潛在的交叉反應。圖3所示的是各組中各個血清對LRP的反應性。 T. gondii (平均值=0. 1012士0056)或T. cruzi(平均值=0. 101 士0.06)感染的犬血清沒有表現出超過健康血清(見上文)給出的截點值的反應性。作為對照，檢測了同一血清針對SLA的反應性。這些血清對SLA的平均反應性(T. gondii感染的犬為0. 6 士0. 21，而 T. cruzi感染的犬為0. 99士0. 29)高於觀測到的對LRP的反應性。他們中的一些的反應性高於截點值(T. gondii感染的犬為1/5，而T. cruzi感染的犬為7/9)。檢測了從接種兩個在巴西獲準生產的Leishmania預防疫苗Leishmune (29)和 Leishtec (15)的犬的血清針對LRP和SLA的提取物的反應性。我們發現，在將LRP的提取物用於ELISA檢測時，22. 2% (4/18)的接種Leishmune 疫苗的健康犬的血清的光密度值 (0D值)超過了截點值(圖3B)。當相同的血清基於ELISA檢測對SLA進行分析時，16. 6% (3/18)的血清也超過截點值(圖:3B)。接種Leishtec 疫苗的犬的23個血清沒有表現出對SLA的反應性。這些血清中只有一個顯示出對LRP的反應性，它的OD值接近在圖2A中分析的陰性健康對照血清給出的截點值。討論已將許多細胞內的細胞質的或核的Leishmania蛋白，如組蛋白，半胱氨酸蛋白酶或驅動蛋白確定為在人或犬內臟利什曼病(VL)中是抗原性的0，13，14，30，32，3幻。在這項工作中表明，寄生蟲的核糖體蛋白在CVL疾病中也是抗原性的。雖然犬個體之間有一些個體差異，所有的有症狀的犬的血清都表明對一些寄生蟲核糖體組分有反應性。由於寄生蟲的核糖體蛋白的抗原性在兩種不同的皮膚利什曼病的小鼠模型中已經得到證實(22)，我們的結果表明，在Leishmania的自然和實驗感染中，寄生蟲核糖體與脊椎動物宿主免疫系統存在相互作用。由於伴隨著與內臟Leishmania的種的感染的強烈的體液免疫反應，基於血清學技術的檢測是診斷犬和人的內臟利什曼病(VL)最常見的方法。偶然觀察到感染了 CVL的犬的血清對寄生蟲核糖體蛋白提取物的高反應性，我們分析了 LRP的提取物的診斷學屬性。將寄生蟲核糖體蛋白作為ELISA檢測的抗原的來源，這是因為對於用於VL疾病的診斷 (16,33)的大量樣品的篩選，這種技術被認為是精確且敏感的技術。對前鞭毛體裂解物所得的LRP提取物與總總寄生蟲蛋白進行比較分析，這是因為基於粗SLA的ELISA檢測法的使用通常表現出VL診斷的高靈敏度(5，25，33)。當分析有症狀和輕症狀的血清時，LRP的提取物的敏感性和特異性值和SLA的情況相似。SLA與LRP相比具有略高的敏感性(分別為 100%和96% )，且只有來自健康犬的血清對LRP的吸光度值高於作為對照血清的反應性的截點值。因此，可以得出結論，基於LRP的ELISA檢測的診斷表現與SLA製劑在診斷有症狀的或輕症狀的CVL的情況相似。然而，無症狀的犬中的疾病的檢測在流行病學研究中對控制犬之間，犬和人(3，20)之間傳播的疾病起到關鍵作用。由於基於ELISA的SLA未能檢測出較高百分比的無症狀的CVL病例⑵』 31)，我們分析了 LRP提取物在無症狀的CVL的診斷中的敏感性。相比LRP的抗原混合物檢測到了所有無症狀的病例(100%)，使用SLA僅檢測到約30%的病例。雖然對LRP的反應進一步確認需要使用數量較多的多症狀和無症狀樣品，我們的數據表明，在所有形式的CVL疾病的診斷中，LRP可以作為比SLA更為敏感的抗原。使用的SLA的ELISA測試特異性很大程度上取決於抗原的製備與假陽性結果，假陽性結果是從患有地方病，如南美錐蟲病、瘧疾、麻風病或弓形蟲病的患者或犬的血清中產生的(16，23，31)。出於這個原因，已將若干個寄生蟲重組蛋白單獨用做ELISA檢測中的抗原，用於更特異的診斷測試的開發04)。在診斷內臟人類05)或犬利什曼病(31)中，當使用單獨的重組抗原代替SLA時，比較ELISA檢測法一般顯示了較高的特異性，但敏感性較低。較低的敏感性值可能與每個受試者或受感染的的犬中觀察到的寄生蟲蛋白引起的異質體液免疫反應的差異有關。非相關抗原(31)或含多種寄生蟲抗原(6，36)聚蛋白的產品的結合，可以進一步提高ELISA檢測的表現。備選地，可以採用含有不同的寄生蟲抗原的純化的寄生蟲碎片。我們的結果表明，T. cruzi或T. gondii感染的犬的血清並不識別LRP的提取物，而這些血清顯示對SLA的高反應性。當血清來自接種疫苗的犬時，也保持了檢測的診斷特異性。由於許可的商業疫苗 (15,29)的存在，需要區別於感染的犬和接種疫苗的動物。我們的結果表明，雖然一些接種 Leishmune 疫苗的動物的確顯示了針對LRP的一定的反應性，但接種Leishtec 疫苗的動物沒有顯示了針對LRP的反應性。綜合在此展示的結果，證明了 LRP提取物可作為一種用於CVL的ELISA診斷和疫區中無症狀的動物的流行病學研究的，有意義的備用選擇。表1.使用LRP和SLA的ELISA檢測法用於血清學診斷有症狀的CLV的敏感性和特異性
權利要求
1.核糖體蛋白提取物在診斷受試者中的寄生蟲病中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中，所述核糖體蛋白提取物含有至少兩種核糖體蛋白和/或核糖體蛋白的至少兩種抗原和/或核糖體蛋白的至少兩個蛋白片段。
3.根據權利要求2所述的用途，其中，所述蛋白片段為相應的核糖體蛋白的含有至少 2、3、5、7、10、15、20、25、30個或更多個的連續的胺基酸的片段。
4.根據權利要求1至3中任意一項所述的用途，其中，所述核糖體蛋白提取物不含有如EP 824 699所公開的來源於Leishmaniasis chagasi的酸性核糖體蛋白抗原LcPo的抗原決定簇或不由如EP 824 699所公開的來源於Leishmaniasis chagasi的酸性核糖體蛋白抗原LcPo的抗原決定簇組成，更優選地，所述核糖體蛋白提取物不含有LcPo的C末端的 17個胺基酸或不由LcPo的C末端的17個胺基酸組成=LcPo的C末端的17個胺基酸為SEQ ID NO 1所示的LcPo的胺基酸306-322。
5.根據權利要求1至4中任意一項所述的用途，其中，所述核糖體蛋白提取物是使用出現於受試者中時引起寄生蟲病的寄生蟲細胞，通過進行如下步驟得到的a.將寄生蟲細胞與裂解緩衝液混合，b.將所得的混合物離心，得到細胞質提取物，c.從得到的細胞質提取物中製備核糖體蛋白提取物。
6.根據權利要求1至5中任意一項所述的用途，其中，所述核糖體蛋白提取物是從 Leishmania的種中得到的，優選是從Leishmania major中得到的。
7.根據權利要求1至6中任意一項所述的用途，其中，所述寄生蟲病為利什曼病或瘧疾。
8.根據權利要求1至7中任意一項所述的用途，其中，所述寄生蟲病是由Leishmania 的種或Plasmodium的種引起的。
9.根據權利要求1至8中任意一項所述的用途，其中，引起寄生蟲病的種不同於核糖體蛋白提取物來源的種。
10.一種使用權利要求1至9中任意一項中所定義的核糖體蛋白提取物來診斷受試者中的寄生蟲病的方法，該方法包括測定在從受試者得到的樣品中是否存在識別核糖體蛋白提取物的抗體。
11.一種診斷受試者中的寄生蟲病的檢測法，其中，所述檢測法包括核糖體蛋白提取物。
12.根據權利要求11所述的檢測法，其中，所述檢測法為ELISA。
全文摘要
本發明涉及一種使用RPE的利什曼病的診斷方法。
文檔編號G01N33/569GK102483413SQ201080031595
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月13日 優先權日2009年7月13日
發明者C·A·貝達特, E·A·F·科爾賀, L·拉米雷斯加西亞, M·S-阿爾瓦雷斯 申請人:熱體實驗室有限公司