一種快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法

2023-11-07 22:27:57

專利名稱：一種快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，屬於生物學領域中分子生物學的檢測方法。
背景技術：
鹽分是限制植物生長和產量的主要環境因素之一，土壤鹽漬化是一個世界性問題。植物耐鹽新品種的選育，一直是國內外研究的重點。絨毛白蠟(Fraxinus Velutina Torr.)為木犀科(Oleaceae)白蠟屬(Fraxinus Linn.)落葉喬木，原產為美國，生長快，樹幹通直，紋理美觀，抗逆，是鹽鹼地造林、園林綠化和珍貴的用材樹種，是唯一的鹽鹼地造林的大喬木樹種。但是，大多數絨毛白蠟不能夠在含鹽量超過0.3%以上的鹽鹼地上正常生長和繁殖，其中山東省林業科學研究院劉德璽選育的魯蠟3號(Fraxinus Velutina Torr. Lula 3)品種，具有非常強的耐鹽能力，能夠在含鹽量0.5-0.6%條件下可以正常生長發育。該品種對沿海城市的綠化和美化、位於鹽鹼地的油田地區的綠化、鹽鹼地的土壤改良具有重要作用。
但從形態學鑑定耐鹽和鹽敏感植株非常困難，尤其是從耐鹽和鹽敏感植株雜交後代篩選出耐鹽個體，通常要進行生理測定和耐鹽試驗，耗時、費力且許多表型特徵的不穩定性，而且可能破壞植株，另外形態特徵測量和生理指標測定結果時常出現誤差。植物的耐鹽性狀是受多基因控制的，耐鹽植株和鹽敏感植株在基因組上存在一定的差異性。以PCR 為基礎的分子生物學技術是快速檢測生物基因組差異的重要方法之一，直接以DNA形式出現，在植物體的各個組織、各發育時期均可檢測到，不受季節、環境因素的影響，且取材少， 在苗期可以進行選擇，從而大大提高育種效率。然而，經檢索目前國內外尚無對絨毛白蠟植物耐鹽性狀分子快速檢測的相關報導。發明內容
本發明的目的是對已有耐鹽品種雜交後代耐鹽鑑定方法中存在的費時、費力、成本高、準確性低的缺點，提供一種具有快速、簡便、成本低、靈敏度高的鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法。
本發明所述的快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，步驟是
(1)應用SEQ ID NO. 1所示核酸序列為SCAR標記，以絨毛白蠟植物DNA為模板， 利用所述SCAR標記的兩條引物在M 56°C的退火溫度下，進行PCR擴增，其中所述SCAR 標記的兩條引物分別是
引物 1 :5，TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；
引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，；
(2)將上述PCR擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀測PCR結果；
(3)鑑定是否為耐鹽絨毛白蠟植株；如果PCR結果擴增出一條592bp的DNA條帶， 判定為耐鹽植株；如果PCR結果擴增不出592bp的DNA條帶，判定為鹽敏感植株。3
其中
步驟(1)所述的PCR反應總體積優選為25微升，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物 1(10μπιο1/υ μ 1，引物2(10μπιο1/υ μ l，20ng 基因組 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
步驟(1)所述的PCR反應參數優選為94°C預變性％iin，94°C變性30s，55°C退火 45s, 720C 1.5min，循環 30 次，72°C延伸 IOmin0
本發明採用RAPD技術，尋找與耐鹽鹼性狀相關聯的RAPD分子標記，進一步轉化為穩定性、重複性強的SCAR標記，該SCAR標記是全長592bp的特異片段S20-592，其核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。應用所述SCAR標記，以絨毛白蠟植物DNA為模板，採用簡單易操作的 PCR擴增，即可利用分子標記快速檢測絨毛白蠟雜交後代的耐鹽植株與鹽敏感植株，為利用分子標記輔助選育和基因工程等手段改良絨毛白蠟耐鹽新品種提供了基礎，加速了絨毛白蠟耐鹽育種進程。為我國耐鹽鹼林木種質的選育研究提供理論基礎和技術體系；豐富耐鹽鹼綠化樹種的遺傳多樣性，扼制土地鹽漬化，提高土地生產力；增加生態、社會和經濟效益都具有現實而深遠的意義。
本發明提供的快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，具有靈敏度高，所需DNA 用量少的特點，與常規形態學檢測、耐鹽試驗、生理指標測定相比，本發明的有益效果是
1、簡便易行在實驗室採用常規PCR技術對絨毛白蠟植株進行檢測，通過一次PCR 擴增就可以判斷絨毛白蠟是否為耐鹽單株或耐鹽品種，在植株生長的任何時期都可以檢測。
2、檢測時間短該檢測方法從取樣到檢測PCR擴增結果，大約6時間，常規的形態學檢測、耐鹽試驗至少需要3-4個月的時間。
3、準確性高，重複性好以基因組DNA為材料，不易受外界因素的影響，以592bp的 PCR擴增條帶為檢測標準，減少人為判斷誤差，大大提高了檢測的準確度。
4、縮短育種周期在絨毛白蠟的發芽期即可對其耐鹽性進行早期檢測，大大縮短了絨毛白蠟耐鹽育種周期。


圖1 :SCAR標記在Fl代絨毛白蠟單株中的PCR電泳譜帶圖。
其中M-DL2000Mark ；1-12-分別為耐鹽絨毛白蠟；13_23 鹽敏感絨毛白蠟。
具體實施方式
實施例1
1、挑選飽滿無病蟲害魯蠟3號品種(山東省林業科學研究院劉德璽選育的絨毛白蠟耐鹽新品種)F1代種子300粒，採自山東壽光試驗站。分別放於1. 5ml離心管中，自來水衝洗乾淨後浸泡lOmin，用70%乙醇滅菌30秒，再用0. 1 %氯化汞滅菌8分鐘，然後用無菌水洗滌5次，在無菌條件下接種到MS+5g/L瓊脂+30g/L蔗糖的萌發培養基中(pH值 5. 8)，每瓶培養基中10粒種子，共30瓶，培養條件為晝溫度25°C，夜溫度18°C，光照強度 40 μ mol · m_2 · s—1，光照時間14h · cf1 (培養條件下同)，獲得3葉1心種子苗。
其中MS 培養基組分為KN03 1900mg ·廠1，NH4NO3 1650mg ·廠1，MgSO4 · 7H20370mg · I/1，KH2PO4 170mg · I/1，CaCl2 · 2H20 440mg · I/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg · ΙΛ ZnSO4 · 7H20 8. 6mg ·廠1，H3BO3 6. 2mg · Λ KI 0. 83mg ·廠1，NaMoO4 · 2H20 0. 25mg · ΙΛ CuSO4 · 5H20 0. 025mg · Λ CoCl2 · 6H20 0. 025mg · Λ Na2-EDTA 37. 3mg · Λ FeSO4 · 7H2027. 8mg · L—1，鹽酸硫胺素 0. Img · L—1，鹽酸比哆醇 0. 5mg · L-1，煙酸 0. 5mg · L-1， 肌醇 IOOmg · L—1，甘氨酸 2. Omg · L-1。
2、挑選生長一致的3葉1心種子苗連同根一起轉接MS+5g/L瓊脂+30g/L蔗糖 +200mMNaCl養基中(pH值5. 8)，每瓶培養基中6株種子苗，共30瓶，培養40d (培養條件同上)。篩選12株葉片全綠、生長良好的為耐鹽株系，11株發育遲緩、葉片發黃為鹽敏感植株， 用CTAB法提取葉片基因組DNA。
CTAB提取方法為
1)取0. 05 0. Ig絨毛白蠟葉片，於液氮中研磨。加入800 μ 1 DNA提取緩衝液 含有 2 % (w/v)CTAB,20mmo 1 /LEDTA(pH = 8· 0)、100mmol/LTris-HCl (pH = 8.0)、1.4mol/ LNaCl和2% β -巰基乙醇，輕輕顛倒混勻；
2)於65°C水浴中溫育30min，每IOmin顛倒輕輕混勻，12000rpm，離心IOmin ；3)取上清700 μ 1，加入等體積氯仿/異戊醇04 1，V V)，輕輕顛倒混勻，4°C，12000rpm,離心 IOmin ；
4)取上清600 μ 1，加入等體積氯仿/異戊醇04 1，ν ν)，輕輕顛倒混勻，4°C， 12000rpm，離心 IOmin ；
5)取上清500 μ 1，加入2倍體積的冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，_20°C靜置30min ； 6) 40C，12000rpm,離心 IOmin ；
7)去上清，用預冷的75%乙醇洗滌沉澱2次，4°C，lOOOOrpm，離心5min ；
8)在超淨工作檯乾燥沉澱30min，力卩30 μ 1的滅菌ddH20溶解沉澱，待濃度和純度檢測後，置_20°C或_70°C冰箱保存備用。
3、以上述基因組DNA為模板，利用SCAR標記的兩條引物(引物1 5'TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)進行 PCR 擴增，反應總體積為25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ 1，20ng 基因組 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
4、在55°C的退火溫度下，進行PCR擴增，反應參數為94°C預變性％iin，94°C變性 30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循環30次，72°C延伸IOmin0 PCR擴增產物在1. 0 %瓊月旨糖凝膠電泳上分離，GeneGenius全自動凝膠成像分析系統觀察結果並照相。電泳Marker DL2000和試劑為TAKARA公司。
5、利用該SCAR標記對絨毛白蠟耐鹽品種魯蠟3號Fl代植株進行了 PCR檢測，結果發現(見圖1)，12株耐鹽植株中，10株擴增出一條592bp的DNA條帶，說明能擴增出DNA 條帶的材料為耐鹽材料；11株鹽敏感植株都沒有擴增出592bp的DNA條帶，說明該材料為鹽敏感材料。
實施例2
1、挑選飽滿無病蟲害魯蠟3號(山東省林業科學研究院劉德璽選育的絨毛白蠟耐鹽新品種)F1代種子400粒，採自山東壽光試驗站。浸泡於溫度為45°C的水中，每天換水 1次，4周種子露白後播種在草炭、珍珠巖、蛙石(體積比1 1 1)基質中，溫度為25 530°C，相對溼度50 70%的溫室中，待幼苗長到4片真葉時，將幼苗根部的草炭、珍珠巖和蛙石清洗乾淨，然後移栽到盛有1/2濃度的Hoagland營養液。每個塑料容器10株，25個塑料容器共移栽250株，並每隔兩天將蒸發掉的水分用無離子水補充到原體積。
其中Hoagland』 s (霍格蘭氏)營養液配方為硝酸鈣945mg · Γ1 ；硝酸鉀 607mg .L—1 ；磷酸銨 115mg .L—1 ；硫酸鎂 493mg-r1 ；鐵鹽溶液 2. 5ml .L—1 ；微量元素 5ml .L—1 ； PH = 6. 0。鐵鹽溶液七水硫酸亞鐵2. 78g ；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA. Na) 3. 73g ；蒸餾水 500ml ；pH = 5. 5。微量元素液碘化鉀 0. 83mg · L-1 ；硼酸 6. 2mg · L-1 ；硫酸錳 22. 3mg · L-1 ； 硫酸鋅 8. 6mg · L-1 ；鉬酸鈉 0. 25mg · L-1 ；硫酸銅 0. 025mg · L-1 ；氯化鈷 0. 025 · L-1。
2、挑選生長一致的，15個塑料容器的植株，共150株，一周後開始加鹽。每天按 50mM NaCI增加鹽濃度，直至終鹽濃度達到150mM NaCI。培養於溫度25_30°C，相對溼度 50-70%的溫室20d，篩選10株葉片全綠、生長良好的為耐鹽株系，10株發育遲緩、葉片發黃為鹽敏感植株，用CTAB法提取葉片基因組DNA。
3、以上述基因組DNA為模板，利用SCAR標記的兩條引物(引物1 5'TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5，CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，)進行 PCR 擴增，反應總體積為25微升，2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ 1 (天根生化科技有限公司)，引物1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ 1，20ng 基因組 DNA2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
4、在55°C的退火溫度下，進行PCR擴增，反應參數為94°C預變性％iin，94°C變性 30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循環30次，72°C延伸IOmin0 PCR擴增產物在1. 0 %瓊月旨糖凝膠電泳上分離，GeneGenius全自動凝膠成像分析系統觀察結果並照相。電泳Marker DL2000和試劑為TAKARA公司。
5、利用該SCAR標記對絨毛白蠟耐鹽品種魯蠟3號Fl代植株進行了 PCR檢測，結果發現，10株耐鹽植株中，10株都擴增出一條592bp的DNA條帶，說明能擴增出DNA條帶的材料為耐鹽材料；10株鹽敏感植株都沒有擴增出592bp的DNA條帶，說明該材料為鹽敏感材料。
本發明所建立的檢測方法能準確、快速的鑑定出耐鹽絨毛白蠟品種，為科學研究和生產實踐提供了一種簡便、快速、成本低廉的檢測絨毛白蠟抗性的技術。
權利要求
1.一種快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，步驟是(1)應用SEQID NO. 1所示核酸序列為SCAR標記，以絨毛白蠟植物DNA為模板，利用所述SCAR標記的兩條引物在M 56°C的退火溫度下，進行PCR擴增，其中所述SCAR標記的兩條引物分別是引物 1 :5』 TGCTTGGTTTGTTCGTGG 3，；引物 2 :5』 CGTGCAACCTAAAGTTGAG 3，；(2)將上述PCR擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀測PCR結果；(3)鑑定是否為耐鹽絨毛白蠟植株；如果PCR結果擴增出一條592bp的DNA條帶，判定為耐鹽植株；如果PCR結果擴增不出592bp的DNA條帶，判定為鹽敏感植株。
2.根據權利要求1所述快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，其特徵在於步驟 (1)所述的 PCR 反應總體積為 25 微升，2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ 1，引物 1 (10 μ mol/ L) 1 μ 1，引物 2(10ymol/L) 1 μ l，20ng 基因組 DNA 2 μ 1，ddH20 8. 5 μ 1。
3.根據權利要求1所述快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，其特徵在於步驟(1) 所述的PCR反應參數為94°C預變性％iin，94°C變性30s，55°C退火45s，72°C 1. 5min，循環 30 次，72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本發明公開了一種快速鑑定耐鹽絨毛白蠟的分子檢測方法，是應用SEQ ID NO.1所示核酸序列為SCAR標記，以絨毛白蠟植物DNA為模板，利用所述SCAR標記的兩條引物在54～56℃的退火溫度下，進行PCR擴增，擴增產物在1.0％瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀測PCR結果，進行是否是耐鹽絨毛白蠟植株的鑑定；如果擴增出一條592bp的DNA條帶為耐鹽植株；如果擴增不出592bp的DNA條帶為鹽敏感植株。本發明可對絨毛白蠟植株在任何時期進行耐鹽性檢測且不影響其正常生長；可對絨毛白蠟植物分別歸於耐鹽和鹽敏感材料進行快速分子檢測和判別；檢測迅速，費用低。
文檔編號C12Q1/68GK102517398SQ20121000628
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月10日 優先權日2012年1月10日
發明者劉翠蘭, 夏陽, 李雙雲, 束靖, 燕麗萍 申請人:山東省林業科學研究院