4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物轉化及分離純化方法

2023-11-07 15:19:12

專利名稱：4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物轉化及分離純化方法
技術領域：
本發明涉及一種鬼臼類化合物的製備方法，尤其涉及4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的生物轉化方法，本發明還涉及該4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的分離純化方法以及含量檢測方法，屬於鬼臼類化合物的生物轉化領域。
背景技術：
4-(2，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素是一種鬼臼類化合物(又名 4-(2, 3, 5,6-tetramethylpyrazine-l) ~4' -demethylepipodophyllotoxine)，其結構式
為圖(I)所示。
權利要求
1.一種將鬼臼毒素生物轉化為4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的方法，包括(1)、將鬼白毒素加入到液體發酵培養基中，然後接種腐殖性土壤菌二級液體種子進行生物轉化，得到含有4'-去甲基表鬼白毒素的生物轉化產物；( 、將步驟(1)所得到生物轉化產物經分離純化後加入到液體發酵培養基中，然後接種鬼白類植物內生菌二級液體種子進行生物轉化，將4'-去甲基表鬼白毒素轉化為4'-去甲基表鬼白毒酮；隨後在液體發酵培養基中添加川芎嗪繼續進行生物轉化，得到含有4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的發酵液或菌絲體。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的腐殖性土壤菌從湖北恩施或神農架等地的土壤中分離得到；優選的，所述的腐殖性土壤菌是藤倉赤黴(GilAerella fujikuroi)SH-fl3，其微生物保藏號是 CCTCC NO :M2010038 ；所述的鬼臼類植物內生菌從八角蓮屬(Dysosma)、桃兒七屬(podophyllum)、山荷葉 (Diphylleia)或沙地柏(Sabina vulgaris Ant)中分離得到；優選的，所述的鬼臼類植物內生菌是細交鏈格孢(Alternaria alternata) S_f6，其微生物保藏號是CCTCC NO =M 2010037。
3.按照權利要求1所述生物的方法，其特徵在於所述的生物轉化包括搖瓶級或生物反應器規模的生物轉化；其中，步驟(1)或步驟O)中所述的生物轉化溫度為15-40°C，優選為30°C ；當採用搖瓶進行發酵時，所述的搖床轉速為50-300轉/分鐘，優選的，所述的搖床轉速為150轉/分鐘。
4.按照權利要求1所述生物的方法，其特徵在於步驟(1)中將鬼臼毒素作為底物加入到發酵培養基時，所加入用量為至終濃度0. 01-5克/升，優選為0. 2克/升；步驟(2)中在發酵培養基中添加川芎嗪至其終濃度為0. 01-5克/升，優選為0. 1克/升。
5.按照權利要求1所述生物的方法，其特徵在於步驟(1)中或步驟( 中所述的液體發酵培養基組成是酵母膏1-100克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸氫二鉀1-40克/升、 硫酸亞鐵0. 01-10克/升、氯化鉀0. 5-40克/升、pH值2-9 ；優選的，所述的液體發酵培養基的組成是酵母膏3克/升，硫酸鎂0. 5克/升、磷酸氫二鉀1克/升、pH值為7 ；所述的腐殖性土壤菌二級液體種子或鬼白類植物內生菌二級液體種子的製備包括以下步驟(1)培養斜面菌種；( 培養一級液體種子；( 培養二級液體種子；其中，培養斜面菌種中所用到的培養基和培養條件為培養基葡萄糖10-500克/升、硫酸鎂0. 5-40克/升、磷酸二氫鉀1-40克/升、鹽酸硫胺0. 05-10克/升、瓊脂20克/升、馬鈴薯提取液1. 0升；培養條件培養溫度為15-40°C ；培養一級液體種子所用到的培養基和培養條件為培養基葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸鈉1-50克/升、硫酸鎂 0. 5-40克/升、磷酸氫二鉀1-40克/升、硫酸亞鐵0. 01-10克/升、氯化鉀0. 5-40克/升； PH 值 2-9 ；培養條件培養溫度15-40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘；培養二級液體種子所用到的培養基和培養條件為培養基葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸鈉1-50克/升、硫酸鎂·0. 5-40克/升、磷酸氫二鉀1-40克/升、硫酸亞鐵0. 01-10克/升、氯化鉀0. 5-40克/升； PH 值 2-9 ；培養條件培養溫度15-40°C，搖床轉速為50-300轉/分鐘。
6.按照權利要求5所述的方法，其特徵在於培養斜面菌種中所用到的培養基和培養條件為培養基葡萄糖30克/升、硫酸鎂0. 5克/升、磷酸二氫鉀1. 5克/升、鹽酸硫胺0. 1 克/升、瓊脂20克/升、馬鈴薯提取液1. 0升；培養條件培養溫度為30°C ；培養一級液體種子所用到的培養基和培養條件為培養基葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸鈉2克/升、硫酸鎂0. 5克/升、磷酸氫二鉀1克/升、硫酸亞鐵0. 01克/升、氯化鉀0. 5克/升，pH值7 ；培養條件培養溫度30°C，搖床轉速為150轉/分鐘；培養二級液體種子所用到的培養基和培養條件為培養基葡萄糖30克/升、酵母膏3克/升、硝酸鈉2克/升、硫酸鎂0. 5克/升、磷酸氫二鉀1克/升、硫酸亞鐵0. 01克/升、氯化鉀0. 5克/升，pH值7 ；培養條件培養溫度30°C，搖床轉速為150轉/分鐘。
7.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟O)中所述的分離純化包括(1)將生物轉化基質離心，分別收集發酵上清液和菌絲體沉澱；菌絲體真空乾燥；備用；( 分別製備發酵上清液待分離純化樣品或菌絲體待分離純化樣品；C3)依次使用矽膠柱層析和凝膠柱層析進行分離純化，即得。
8.按照權利要求7所述的方法，其特徵在於步驟( 所述發酵上清液待分離純化樣品的製備方法，包括將發酵上清液通過液液萃取，收集有機層，濃縮揮幹，得到發酵上清液待分離純化樣品；所述菌絲體待分離純化樣品的製備方法，包括將菌絲體蒸餾回流提取，用有機溶劑富集蒸餾液中的非極性成分，得菌絲體待分離純化樣品；步驟(3)中所述矽膠柱層析為正相矽膠柱層析或反相矽膠柱層析；正相矽膠以低極性有機溶劑拌勻後裝柱，以洗脫液平衡；反相矽膠以甲醇拌勻後裝柱，以洗脫液平衡；優選的，步驟(3)中將待分離純化的樣品以洗脫液溶解，採用矽膠柱層析吸附，然後用洗脫液洗脫，收集洗脫液，將樣品揮幹並重結晶；其中，以體積比為20 1的氯仿丙酮作為洗脫液； 將凝膠以甲醇浸泡，將處理好的凝膠裝柱，以甲醇平衡；將經矽膠柱層析初步分離後的樣品溶於甲醇中，進行上樣吸附，然後用甲醇洗脫，收集洗脫液，將樣品中溶劑揮幹並重結晶，即得。
9.由權利要求1-8任何一項方法所得到的生物轉化產物。
10.從權利要求9所述的產物中分離純化4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼白毒素的方法，其特徵在於，包括(1)將生物轉化產物離心，分別收集發酵上清液和菌絲體沉澱；菌絲體真空乾燥；備用；( 分別製備發酵上清液待分離純化樣品或菌絲體待分離純化樣品；C3)使用矽膠柱層析和凝膠柱層析進行分離純化，即得。
11.按照權利要求10所述的方法，其特徵在於步驟( 所述發酵上清液待分離純化樣品的製備方法，包括將發酵上清液通過液液萃取，收集有機層，濃縮揮幹，得到發酵上清液待分離純化樣品；所述菌絲體待分離純化樣品的製備方法，包括將菌絲體蒸餾回流提取，用有機溶劑富集蒸餾液中的非極性成分，得菌絲體待分離純化樣品；步驟(3)中所述矽膠柱層析為正相矽膠柱層析或反相矽膠柱層析；正相矽膠以低極性有機溶劑拌勻後裝柱，以洗脫液平衡；反相矽膠以甲醇拌勻後裝柱，以洗脫液平衡；優選的，步驟(3)中將待分離純化的樣品以洗脫液溶解，採用矽膠柱層析吸附，然後用洗脫液洗脫，收集洗脫液，將樣品揮幹並重結晶；以體積比為40 1的氯仿丙酮系統作為洗脫液；將凝膠以甲醇浸泡，將處理好的凝膠裝柱，以甲醇平衡；將經矽膠柱層析初步分離後的樣品溶於甲醇中，進行上樣吸附，然後用甲醇洗脫，收集洗脫液，將樣品中溶劑揮幹並重結晶，艮口得。
12.從權利要求9所述的生物轉化產物中檢測4-(2，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素含量的方法，包括(1)收集樣品將生物轉化產物離心，分別收集上清液和菌絲體沉澱；(2)發酵液或菌絲體待分離純化樣品的製備(A)發酵液待測樣品的製備將發酵上清液與有機溶劑進行混合過濾或將發酵上清液通過液液萃取，收集有機層，濃縮揮幹後以流動相復溶，得發酵液待測樣品；(B)菌絲體待測樣品的製備將菌絲體蒸餾回流提取，用有機溶劑富集蒸餾液中的非極性成分，得菌絲體待測樣品；(3)檢測待測樣品使用液相色譜-紫外檢測器、二極體陣列檢測器、螢光檢測器、電化學檢測器、蒸發光檢測器、示差折光檢測器或質譜檢測器檢測，色譜柱為高效反相液相色譜住、高效正相液相色譜柱或^novation高效液相色譜柱；通過對比相同色譜條件下4- ， 3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素對照品出峰時間和離子碎片信息對樣品中4- ，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素進行定性，通過內標法或外標法對待測樣品中4- ，3，5，6_四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素的含量進行定量。
13.按照權利要求12的方法，其特徵在於步驟(1)中將發酵產物在8000-15000轉/分鐘的轉速下離心；步驟O)中所述的發酵液待測樣品按照以下步驟製備將發酵上清液與乙腈以1 2 進行混合後，在8000-15000轉/分鐘的轉速下離心，取上清液；或以二氯甲烷對發酵液中進行萃取，收集有機層，濃縮揮幹後以流動相復溶，作為發酵液待測樣品；步驟O)中所述的菌絲體待測樣品按照以下步驟製備將菌絲體進行蒸餾回流提取，控制溫度在30-150攝氏度；用氯仿富集蒸餾液中的非極性成分，得菌絲體待測樣品；步驟(3)中所述的檢測按照以下條件進行色譜柱溫度為0-80°C ；進樣方式為分流或不分流方式，體積1-20微升，流速0. 2-2毫升/分鐘；紫外檢測器的檢測波長為200-660nm ； 質譜所採用的電離方式為ESI電離，掃描離子質荷比範圍為50-650，4- 0，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4'-去甲表鬼臼毒素特徵碎片離子質荷比為519。核磁共振譜用核磁共振儀測定，TMS為內標，氘代甲醇和氘代氯仿為溶劑，質譜數據以離子阱質譜儀測定。
全文摘要
本發明公開了一種將鬼臼毒素生物轉化為4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，包括(1)、將鬼臼毒素加入到液體發酵培養基中，然後接種腐殖性土壤菌二級液體種子進行生物轉化；(2)、將步驟(1)產物經分離純化後加入到液體發酵培養基中，接種鬼臼類植物內生菌二級液體種子進行生物轉化；隨後添加川芎嗪繼續生物轉化，收集轉化產物，即得。本發明還公開了從上述產物中分離純化4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素及其含量檢測的方法。本發明通過生物轉化方法對鬼臼毒素分子結構進行修飾，具有反應條件溫和、E-factor低、質量可控、分離過程簡單等優點。
文檔編號G01N30/02GK102234669SQ20101015975
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月29日 優先權日2010年4月29日
發明者湯亞傑, 趙巍 申請人:湖北工業大學