一種三維灌流式細胞培養器及其應用的製作方法

2023-12-09 04:24:51

一種三維灌流式細胞培養器及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種三維灌流式細胞培養裝置及其應用，包括盒體，蓋體及彈性卡夾，盒體的頂面設置有第一圓形凹槽，蓋體的底面設置有與第一圓形凹槽半徑大小相同的第二圓形凹槽；本發明在細胞培養裝置中的凹槽底面由聚酯纖維組成的脈管，細胞或組織外植體位於兩層脈管之間，形成「三明治」夾心培養，用聚酯纖維組成的脈管代替支架材料，最大程度減少了細胞培養的死角體積，更符合體內的生理微環境。在培養裝置盒體的側壁，分別設置了培養液進液通道和出液通道，培養液通過進液通道流入凹槽腔內，再從出液通道流走，從而實現灌流培養。本發明的裝置使新生腎皮質部位的胚胎幹細胞/祖先細胞成功分化為腎小管組織。
【專利說明】一種三維灌流式細胞培養器及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於細胞培養設備或裝置領域，具體涉及一種三維灌流式細胞培養器，同時還涉及一種三維灌流式細胞培養器的用途，在三維灌流培養條件下，使新生腎皮質部位的胚胎幹細胞/祖先細胞成功分化為腎小管組織的一種細胞培養器。
【背景技術】
[0002]自Willhelm Roux於1885年從雞胚中分離細胞首次建立體外細胞培養，單層細胞培養技術已有百餘年的歷史。一個多世紀以來，單層細胞培養有了蓬勃的發展。特別是在製藥或者疫苗合成等產業化領域，通過細胞的快速分裂，高效率地製造產品。但在生命科學基礎研究領域，對於細胞的體外培養，關注的不僅僅是它們的分裂生長，更為重要的是它們經過傳代後能否維持體內的性狀。在很多情況下，單層細胞培養技術所取得的研究結果和體內的情況不符合，因為細胞在體外改變的環境下增生，逐漸喪失了原有的性狀。動物實驗完全在體內進行，但由於體內的多種因素制約以及體內和外界環境相互影響而變得複雜化，難以研究單一過程。另外，我們在動物身上所觀察到的結果，往往是最終呈現的表現型，而非研究者最為關心的中間過程。顯然，如何填補單層細胞培養和動物實驗的鴻溝，一直是生命科學家思索的問題。尤其是在再生醫學領域，迫切需要建立一套細胞培養技術，既能生長傳代，還能最大程度地維持體內性狀，並使幹細胞分化產生新的組織結構，以便替代體內因疾病損壞的組織。隨著組織工程的新興發展，三維細胞培養技術應運而生。
[0003]體外細胞培養的一個重要原則是需模擬體內細胞生長環境，該模擬系統中最重要的核心因素是細胞與培養環境之間的相互作用。不同於傳統的單層細胞培養，三維細胞培養技術是指將具有三維結構不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養，使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長，構成三維的細胞-載體複合物。三維細胞培養中，細胞外基質蛋白充當生長支架，使得細胞能夠分化產生一定的三維組織結構，所創建的細胞生長環境，需要最大程度地模擬體內環境。近幾年三維細胞培養技術在組織形成、血管發育和器官再造等領域得到了廣泛的應用；同時在篩選新藥的療效分析和毒理實驗方面，利用三維培養獲得了和二維單層培養完全不同的結果，引起了藥物學家的極大興趣。
[0004]在常規的三維細胞培養中，一般採用靜態培養的方法。仔細觀察靜態培養中的微環境，不難發現培養液的總體積數倍大於與所培植細胞真正接觸的培養液體積，這一過大的「死角體積」阻礙了細胞的分化。在靜態環境中，細胞產生的代謝廢物積累在培養腔室中，對分化有害。引入動態的灌流培養，保證持續新鮮的化學培養液以恆定的速率進入培養器內部，提供細胞分化所必須的營養和誘導因子，並及時移去代謝廢物。離開灌注培養器的培養液不再循環使用，而是通過乳膠導管被導入廢液瓶。這為分化奠定了前提。
[0005]運用脈管取代支架材料，填充在培養器內的凹槽腔中。實驗證實，和支架材料相比較，外觀海綿狀的脈管能更明顯地降低培養的「死角體積」。化學合成的脈管由約5 μ m截斷直徑的中空管狀纖維組成，管狀纖維的側面分布有大量nm級的孔洞。脈管鋪設在凹槽腔中後，細胞營養液先經過進流腔流入脈管的中空管內，再從側面孔洞中滲漏出來才接觸到細胞，從而真實模擬體內毛細血管供血的生理狀況，使體外再生組織成為可能。
[0006]即使按照以上工藝步驟，引入了灌流式營養液運輸及在細胞器中填充脈管降低死角體積，如果所選用的脈管材料不合適，仍不能使幹細胞分化成組織。脈管是一種具有網孔結構的高分子合成材料，它應該具備充分的可變形性，足夠的親水性表面以及最佳的生物適配性。在尋找適於作為脈管的材料方面，不能考慮剛性物質。通過對膠原纖維和羊毛等大量海綿類物質進行實驗篩選，我們最終發現，聚酯纖維是適合製造脈管的最佳材料。[0007]幹細胞是具有多向分化潛能的原始細胞，是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的原始細胞。在加入特定誘導因子的條件下，它可以分化成多種功能細胞或組織器官，醫學界稱其為「萬用細胞」。目前，幹細胞治療方興未艾，即把健康的幹細胞移植到病人體內，以達到修復病變細胞或重建功能正常的組織的目的。近年來，成人幹細胞移植在挽救白血病、淋巴癌和其它血液病人生命方面發揮了重要作用。但是，直接將幹細胞植入人體內，存在著發展成腫瘤的風險。毫無疑問，將幹細胞在體外預先定向分化成所需的組織，再移植到體內，代表了未來臨床治療的方向。
[0008]透析和器官移植是目前臨床上處理腎衰竭的二種常用治療方案。然而，高昂的醫療費用，短暫的透析壽命(一般僅能維持幾年)和匱乏的供體器官是造成急慢性腎衰竭死亡率高的成因。運用本發明三維灌流式細胞培養器，我們在世界上首次使新生腎皮質部位的胚胎幹細胞/祖先細胞成功分化為腎小管，為治療腎小管壞死造成的急慢性腎炎帶來新的希望。

【發明內容】

[0009]本發明的目的是在於提供了一種三維灌流式細胞培養裝置，本發明在細胞培養裝置中的凹槽底面設置由聚酯纖維組成的脈管，細胞或組織外植體位於兩層脈管之間，形成「三明治」夾心培養，用聚酯纖維組成的脈管代替支架材料，最大程度減少了細胞培養的死角體積，更符合體內的生理微環境。在培養裝置盒體的側壁，分別設置了培養液進液通道和出液通道，培養液通過進液通道流入凹槽腔內，再從出液通道流走，從而實現灌流培養。
[0010]本發明的另一個目的是在於提供了一種三維灌流式細胞培養器在細胞培養中的應用。本發明所述裝置可使新生腎皮質部位的胚胎幹細胞/祖先細胞成功分化為腎小管組織。
[0011]為了達到上述目的，本發明採取以下技術措施:
[0012]一種三維灌流式細胞培養裝置，包括盒體，蓋體及彈性卡夾，蓋體設置在盒體上方並通過連接件與盒體活動連接，盒體的頂面設置有第一圓形凹槽，盒體側壁上水平設置有與第一圓形凹槽連通的進液通道；盒體上與進液通道相對的另一側壁上水平設置有與第一圓形凹槽連通的出液通道；進液通道的軸線與出液通道的軸線錯開；蓋體的底面設置有與第一圓形凹槽半徑大小相同的第二圓形凹槽；第一圓形凹槽與第二圓形凹槽同軸，第一圓形凹槽的底面設置有第一纖維層，第二圓形凹槽的底面設置有第二纖維層；蓋體的底面開設的圓環形凹槽內設置有第一圓形彈性墊圈，第一圓形彈性墊圈凸出於蓋體的底面，第二圓形凹槽的槽口設置在第一圓形彈性墊圈內，裝置閉合時通過彈性卡夾將盒體和蓋體夾緊，第一圓形凹槽和第二圓形凹槽構成圓柱形內腔。
[0013]所述的第一圓形凹槽槽口處的槽壁開設的內凹環設置有第二圓形彈性墊圈，第二圓形凹槽的槽口處的槽壁開設的內凹環設置有第三圓形彈性墊圈；
[0014]所述的第二圓形彈性墊圈的頂面與盒體的頂面在同一平面上，第三圓形墊圈的底面與蓋體的底面在同一平面上；
[0015]所述的第一纖維層和第二纖維層的材質均為聚酯纖維；
[0016]所述的第一圓形凹槽的尺寸為半徑5mm,高度5mm,第二圓形凹槽的尺寸為半徑5mm,高度 5mm ；
[0017]所述的盒體尺寸為長度45mm,寬度40mm,高度36mm ；
[0018]所述的盒體為半透明的聚碳酸酯材料製成；
[0019]所述的彈性卡夾為不鏽鋼材質，與盒體通過不鏽鋼連接件活動連接。
[0020]一種三維灌流式細胞培養裝置在細胞培養中的應用，其具體步驟如下:
[0021](I)將培養裝置中的聚酯纖維(以下稱為脈管)用鑷子夾入到含培養液的平皿中，反覆浸泡，以除去其中的氣泡；
[0022](2)在雙目放大鏡下，用尖嘴鑷將胚胎膜放置在脈管上。鋪放平展後，再加上另一片圓形脈管，成為典型的「三 明治」組織外植體夾心培養；
[0023](3)乳膠導管一端放置在培養瓶中(含培養液)，通過一個高精度蠕動泵，與細胞培養裝置的進液通道連接；另一條乳膠導管則將細胞培養裝置的出液通道和廢液瓶相連通；將細胞培養裝置置於控溫板上；
[0024](4)將步驟(2)中獲得「三明治」組織外植體的置於第一圓形凹槽的底部，加少許培養液趕走氣泡；合上培養裝置蓋體，夾上彈性夾片，使培養器底部和頂部固定密合；第一圓形凹槽和第二圓形凹槽構成圓柱形內腔，該內腔處於與外界隔絕的無菌狀態；
[0025](5)將高精度蠕動泵設置成Iml/小時的流速，控溫板設置為37攝氏度，保證細胞的培養和分化儘可能模擬體內條件，檢測細胞培養情況。
[0026]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0027]1、連續灌注培養保證供應細胞持續新鮮的營養成分，有利於增殖和分化；
[0028]2、培養過程無需CO2培養箱，高精度蠕動泵形成連續負壓實現自動化培養，省去了常規單層細胞培養中易造成汙染的換液等步驟；
[0029]3、和常規單層細胞培養相比較，三維灌流式培養技術無需使用血清，血清價格昂貴,無血清培養極大地降低了培養成本；
[0030]4、細胞培養器由聚碳酸酯材料組成，能夠耐受多次反覆的高溫滅菌而不變形，使用壽命長。另外，聚碳酸酯的半透明特點，方便了實驗操作者在培養階段用顯微鏡動態觀察組織再生過程；
[0031]5、將新生兔腎皮質部位的胚胎幹細胞/祖先細胞鋪設在該系統中，培養液中加入誘導因子醛固酮後，能分化出具有典型結構的腎小管組織，有希望用於替代疾病損傷的組織。
[0032]6.本發明在細胞培養器中的兩個凹槽底部，均鋪設了由聚酯纖維組成的脈管，細胞或組織外植體位於二層 脈管之間，形成「三明治」夾心培養，用聚酯纖維組成的脈管代替支架材料，最大程度減少了細胞培養的死角體積，更符合體內的生理微環境。
【專利附圖】

【附圖說明】[0033]圖1A為一種三維灌流式細胞培養裝置合蓋時的三維結構示意圖。
[0034]圖1B為一種三維灌流式細胞培養裝置開蓋時的三維結構示意圖。
[0035]圖2為一種三維灌流式細胞培養裝置的結構示意圖；
[0036]圖2A為一種三維灌流式細胞培養裝置合蓋時的剖面圖；
[0037]圖2B為一種三維灌流式細胞培養裝置蓋體的剖面圖；
[0038]圖2C為一種三維灌流式細胞培養裝置盒體的剖面圖；
[0039]圖2D為一種三維灌流式細胞培養裝置的外部結構示意圖；
[0040]其中，1-盒體，2-蓋體，3-彈性卡夾，4-連接件，5-1-第一圓形凹槽，5-2-第二圓形凹槽，6-1-進液通道,6-2-出液通道,7-第一圓形彈性墊圈，8-1-第二圓形彈性墊圈，8-2-第三圓形彈性墊圈，9-1-第一纖維層，9-2-第二纖維層。
[0041]圖3為細胞培養裝置內部培養情況示意圖；
[0042]其中A為結構示意圖，B為實物圖:凹槽腔內設置了由聚酯纖維組成的脈管，胚胎幹細胞位於二層脈管之間，形成「三明治」夾心培養。新生的腎小管組織能被染料著色，而脈管不被染色。
[0043]圖4為本發明實施例3中的細胞培養裝置的設置示意圖；
[0044]其中a_灌注培養瓶，b_乳膠導管，C-高精度蠕動泵，d-細胞培養器，e-恆溫熱板，f_廢液收集瓶。
[0045]圖5為新生腎小管的免疫組織化學分析圖。
【具體實施方式】
[0046]為了更好地解釋本發明，以下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但本發明的內容不僅僅局限於以下實施例。在下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。
[0047]實施例1:
[0048]一種三維灌流式細胞培養裝置，包括盒體1，蓋體2及彈性卡夾3，蓋體2設置在盒體I上方並通過連接件4與盒體1活動連接，盒體2的頂面設置有第一圓形凹槽5-1，盒體I側壁上水平設置有與第一圓形凹槽5-1連通的進液通道6-1 ;盒體I上與進液通道相對的另一側壁上水平設置有與第一圓形凹槽5-1連通的出液通道6-2 ;進液通道的軸線與出液通道的軸線錯開；蓋體2的底面設置有與第一圓形凹槽5-1半徑大小相同的第二圓形凹槽5-2 ;第一圓形凹槽5-1與第二圓形凹槽5-2同軸，第一圓形凹槽5-1的底面設置有第一纖維層9-1，第二圓形凹槽5-2的底面設置有第二纖維層9-2 ;蓋體2的底面開設的圓環形凹槽內設置有第一圓形彈性墊圈7，第一圓形彈性墊圈7凸出於蓋體2的底面；第二圓形凹槽5-2的槽口設置在第一圓形彈性墊圈7內，裝置閉合時通過彈性卡夾3將盒體I和蓋體2夾緊，第一圓形凹槽5-1和第二圓形凹槽5-2構成圓柱形內腔,第一圓形彈性墊圈7由於壓力縮回至圓環形凹槽，使得蓋體2和盒體I緊密閉合。第一圓形凹槽5-1槽口處的槽壁開設的內凹環設置有第二圓形彈性墊圈8-1，第二圓形凹槽5-2的槽口處的槽壁開設的內凹環設置有第三圓形彈性墊圈8-2。第二圓形彈性墊圈8-1的頂面與盒體I的頂面在同一平面上，第三圓形墊圈8-2的底面與蓋體的底面在同一平面上；第一纖維層9-1和第二纖維層9-2的材質均為聚酯纖維。第一圓形凹槽5-1的尺寸為半徑5mm,高度5mm,第二圓形凹槽5-2的尺寸為半徑5mm,高度5mm。盒體I尺寸為長度45mm,寬度40mm,高度36mm,為半透明的聚碳酸酯材料製成。彈性卡夾3為不鏽鋼材質，與盒體通過不鏽鋼連接件活動連接。(圖1A,圖1B,圖2)
[0049]實施例2:
[0050]分離細胞
[0051]從新生兔中分離腎臟:
[0052]1、準備工作:手術剪刀、鑷子等預先滅菌，100ml小燒杯中盛有不含酚紅的MDM培養液，該培養液購自Gibco公司，貨號21056# ;使用前加4-羥乙基哌嗪乙磺酸(英文縮寫為HEPES )至終濃度5% ；
[0053]2、從動物房取新生2天內的兔娃。在通風櫥內，將乙醚潤溼一張厚棉墊，放置在I個圓玻璃皿中，將新生兔娃放置到含乙醚的園玻璃皿中1-2分鐘，使麻醉；
[0054]3、將已麻醉的兔娃放置在一張厚白色棉墊上，頸部剪除動脈，使死亡；
[0055]4、用70%乙醇在兔腹部衝洗；
[0056]5、剪開兔娃下腹，小心地取出黃豆大小的2個小腎，置於MDM培養液中，立即用於
三維培養實驗。
[0057]分離腎胚胎區用於三維培養:
[0058]1、取出新鮮分離的2個小腎，置入MDM培養液中浸泡；
[0059]2、在超淨工作檯內，用滅菌的不含酚紅的MDM培養液反覆清洗，使新鮮分離的腎保持無圃狀態；
[0060]3、將小腎周邊黃色脂肪組織去掉，將乾淨的小腎置入另一含培養液的平皿中；
[0061]4、用鑷子穿刺腎臟，用剪刀剪掉腎臟二端使成平塊，將新的剪成平快的腎臟置入新的含培養液的平皿中；
[0062]5、分離腎胚胎區:用鑷子小心掀下腎塊外膜，又稱胚胎區膜，其表面含大量的胚胎幹細胞或稱祖先細胞；將獲得的胚胎區膜置入一含IMDM培養液的滅菌平皿中。
[0063]實施例3:
[0064]一種三維灌流式細胞培養裝置在細胞培養中的應用，其具體步驟如下:
[0065]本實施例所用器皿及工具都已經過滅菌步驟。
[0066](I)將培養裝置中的聚酯纖維(以下稱為脈管)用鑷子夾入到含IMDM培養液的平皿中，反覆浸泡，以除去其中的氣泡；
[0067](2)在雙目放大鏡下，用尖嘴鑷將平皿中的胚胎膜展開，放置在一圓形的脈管上。鋪放平展後，再加上另一片圓形脈管，成為典型的「三明治」組織外植體夾心培養，圖3 ；
[0068](3)乳膠導管一端放置在培養瓶中(含500mlIHA工作培養液)，通過一個高精度蠕動泵，與細胞培養裝置的進液通道連接；另一條乳膠導管則將細胞培養裝置的出液通道和廢液瓶相連通；將細胞培養裝置置於控溫板上；
[0069]所述的IHA工作培養液的配製:使用500ml含酚紅的MDM培養液，購自Gibco公司，貨號21980#，已含穀氨醯胺(Glutamine)和25mM HEPES ;先移去30ml該培養液，再分別加入 25ml HEPES(購自 Gibco 公司，貨號 15630#，lM，100ml/瓶)、5ml Mix(購自 Gibco 公司，貨號 15240#,含 IOOx Ant1-Anti, antibiotica-antimycotic)、500 μ I 預先過濾滅菌的1χ10_4Μ醛固酮母液，使得其在IHA工作培養液的終濃度為1χ10_7Μ ；[0070](4)將步驟(2)中獲得「三明治」組織外植體的置於第一圓形凹槽的底部，加少許MDM培養液趕走氣泡；合上培養裝置蓋體，夾上彈性夾片，使培養器底部和頂部固定密合；第一圓形凹槽和第二圓形凹槽構成圓柱形內腔，該內腔處於與外界隔絕的無菌狀態；
[0071](5)將高精度蠕動泵設置成Iml/小時的流速，控溫板設置為37攝氏度，保證細胞的培養和分化儘可能模擬體內條件；
[0072]整個三維灌流式細胞培養系統各組件的相互連接和配合關係見圖4。
[0073]實施例4:
[0074]用免疫組化方法分析再生腎小管組織的形態結構:
[0075]實施例3中的胚胎區膜經過2周的灌注培養後，能分化出大量的腎小管。
[0076]免疫組織化學分析顯示，腎小管在長達2到5周的培養時間內維持完整結構而不崩解。圖5是培養2周後，不同視野下的層粘蛋白Yl (a-f)和閉合素(a』 -f』)免疫組織化學結果。標記層粘蛋白Y I的腎小管邊緣結構清晰而連續(b、d中的星號*);多數視野下，閉合素結構清晰可見(a』 -d』中用白色箭頭表示)。[0077]以上通過具體的實施例對本發明進行了說明，但本發明並不限於這些具體的實施例。本領域技術人員應當理解，還可以對本發明做各種修改、等同替換、變化等等。但是，這些變換隻要未偏離本發明的精神，都應在本發明的保護範圍之內。另外，本申請說明書和權利要求書所使用的一些術語並不是限制性的，僅僅是為了便於描述。
【權利要求】
1.一種三維灌流式細胞培養裝置，包括盒體(1)，蓋體(2)及彈性卡夾(3)，其特徵在於:蓋體(2)設置在盒體(1)上方並通過連接件(4)與盒體(1)活動連接，盒體(1)的頂面設置有第一圓形凹槽(5-1 )，盒體(1)側壁上水平設置有與第一圓形凹槽(5-1)連通的進液通道(6-1);盒體(1)上與進液通道相對的另一側壁上水平設置有與第一圓形凹槽連通的出液通道(6-2);進液通道的軸線與出液通道的軸線錯開；蓋體(1)的底面設置有與第一圓形凹槽半徑大小相同的第二圓形凹槽(5-2);第一圓形凹槽(5-1)與第二圓形凹槽(5-2)同軸，第一圓形凹槽(5-1)的底面設置有第一纖維層(9-1)，第二圓形凹槽(5-2)的底面設置有第二纖維層(9-2);蓋體(1)的底面開設的圓環形凹槽內設置有第一圓形彈性墊圈(7)，第一圓形彈性墊圈(7)凸出於蓋體(2)的底面；第二圓形凹槽(5-2)的槽口設置在第一圓形彈性墊圈(7)內，裝置閉合時通過彈性卡夾(3)將盒體(1)和蓋體(2)夾緊，第一圓形凹槽(5-1)和第二圓形凹槽(5-2)構成圓柱形內腔。
2.根據權利要求1所述的一種三維灌流式細胞培養裝置，所述的第一圓形凹槽(5-1)槽口處的槽壁開設的內凹環設置有第二圓形彈性墊圈(8-1)，第二圓形凹槽(5-2)的槽口處的槽壁開設的內凹環設置有第三圓形彈性墊圈(8-2)。
3.根據權 利要求2所述的一種三維灌流式細胞培養裝置，所述的第二圓形彈性墊圈(8-1)的頂面與盒體的頂面在同一平面上，第三圓形墊圈(8-2)的底面與蓋體的底面在同一平面上。
4.根據權利要求1所述的一種三維灌流式細胞培養裝置，所述的第一纖維層(9-1)和第二纖維層(9-2)的材質均為聚酯纖維。
5.根據權利要求1所述的一種三維灌流式細胞培養裝置，所述的第一圓形凹槽(5-1)的尺寸為半徑5mm,高度5mm,第二圓形凹槽(5-2)的尺寸為半徑5mm,高度5mm。
6.根據權利要求1所述的一種三維灌流式細胞培養裝置，所述的盒體(1)尺寸為長度45mm,寬度 40mm,高度 36mm。
7.根據權利要求1所述的一種三維灌流式細胞培養裝置，所述的盒體(1)為半透明的聚碳酸酯材料製成。
8.根據權利要求1所述的一種三維灌流式細胞培養裝置，所述的彈性卡夾(3)為不鏽鋼材質，與盒體(1)通過不鏽鋼連接件活動連接。
9.權利要求1所述的一種三維灌流式細胞培養裝置在細胞培養中的應用。
【文檔編號】C12M3/00GK103740591SQ201410024728
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月17日 優先權日:2014年1月17日
【發明者】胡康洪 申請人:康珞生物科技（武漢）有限公司