一種檢測副豬嗜血桿菌的lamp方法
2023-12-08 20:17:11 1
專利名稱：一種檢測副豬嗜血桿菌的lamp方法
技術領域：
本發明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、實時定量檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法。
背景技術：
副豬嗜血桿菌(HPS)是一種不運動性、小型、NAD依賴、多形態的革蘭氏陰性桿菌，是豬上呼吸道的一種常在菌。衛生狀況良好和較為健康的豬群，當遭遇應激因素易暴發該菌引起的病，常引起豬的多發性漿膜炎、關節炎以及腦膜炎，影響2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前後和保育階段，5周齡I周齡的豬發病率達40%，嚴重時死亡率達50%。目前國內對副豬嗜血桿菌的診斷主要有傳統的病原分離、血清學以及基於PCR的檢測方法。病原學方法是對細菌的分離和鑑定，副豬嗜血桿菌對營養要求較高，且菌株比較脆弱，從病科中分離率較低。副豬嗜血桿菌各血清型之間存在交叉反應，血清學診斷結果不一致且不準確。常規PCR檢測方法是選擇副豬嗜血桿菌的16S rRNA的基因序列在保守區域內設計引物，16S rRNA可以作為種屬的劃分依據但卻不能區分巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌，且在檢驗中容易誤檢造成假陽性。
本發明以副豬嗜血桿菌的infB基因作為檢測目標，16SrRNA中的基因序列設計合成引物。infB是副豬嗜血桿菌的轉錄起始因子(Translation initiation factor 2)基因序列，在種屬間的變異率低且兼顧不同血清型之間的保守序列，因而可以作為通用性基因來監測副豬嗜血桿菌。血清學診斷存在特異性不高，敏感性低的特點，而傳統PCR檢測需要經過變性一退火一延伸，加上DNA提取整個過程大概需要2 4小時才能得出結果。以往技術中所用到的LAMP方法檢測也需要I小時後加入染料才能判斷結果，反應中加入的螢光染料syber-green,需採用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像,存在開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠汙染，缺乏對反應的實時監控很難排除這些幹擾因素，不能對檢測結果做出準確的判定。
發明內容
本發明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測副豬嗜血桿菌的方法，公開一種快速、實時定量的檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法。本發明提供的檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，該檢測方法包括材料的準備、LAMP引物的設計與合成、細菌的前處理、LAMP反應體系建立以及LAMP檢測方法，以上所述的LAMP檢測方法是採用特異性檢測、敏感性檢測和螢光可視化檢測的方法，反應溫度為63°C，反應在20-35min間出現擴增，引物包括外引物和內引物；
所述的外引物是F3和B3 ；
所述的內引物是FIP和BIP ；
其中引物的序列分別為:
F3 CGAAAGCAACGGATATCGT B3 CACCACCGAATTTCTCAGAAFIP CTGCTTTCGCGTGTTGGATTGCTCTTGTAGTAGCAGCTGACGBIP GCCGATCGTGGTTGCGGTAAACTCTTGTTCTACACGCTCT。以上所述的細菌的前處理是將細菌直接加入PBS煮沸。以上所述的LAMP反應體系建立中LAMP反應體系以25 μ I計:
2X反應緩衝液12.5μ1
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
LB20pmol
模板2 μ I
超純水補足25 μ I
以上所述的LAMP檢測方法包括實時濁度儀。以上所述的LAMP檢測方法採用實時、定量的檢測方式。
以上所述的LAMP檢測方法採用密閉全程監控。以上所述的LAMP檢測方法中螢光可視化檢測採用鈣黃綠素螢光染料，螢光染料在反應前加入。以上所述的LAMP檢測方法檢測樣品溶液採用煮沸的PBS稀釋細菌液體。本發明的實質性特點和進步是:
I)特異性強
所檢測的陰性對照株均無陽性結果出來，與PCR檢測結果一致。2)靈敏度高
普通的PCR檢測方法的靈敏度為102cfu/ml數量級，而是用本發明檢測方法，檢測限約為5.2cfu/ml，是普通PCR的100倍左右。3)迅速出結果
普通的PCR整個過程在2 4小時左右才能得出結果，一般的LAMP方法也要在I小時左右得出結果，本發明提供的檢測方法反應在2(T35min間出現擴增。4)不造成汙染
以往的LAMP檢測中加入的突光染料syber-green,需採用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，存在開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠汙染。本發明用於觀察的螢光染料為反應前加入，加入染料為鈣黃綠素，檢測過程不需要開蓋。5)可實時、定量檢測產物
本研究利用Tubidimeter real-time LA-320池度儀來實時分析LAMP反應的結果,不同的標準樣品的濃度對應的濁度值對時間繪製成的標準曲線，代人標準曲線方程，即可求出各時間的副豬嗜血桿菌拷貝數，達到定量檢測產物的目的。
圖1是本發明LAMP檢測方法的特異性檢測結果；4型副豬嗜血桿菌、5型副豬嗜血桿菌反應管出現濁度的上升曲線，5株陰性對照菌反應管無擴增情況。圖2是本發明LAMP檢測方法的敏感性檢測結果；原始菌液濃度為5.2X IO6Cfu/ml, 10倍倍比稀釋菌液進行檢測，結果顯示，LAMP法細菌純培養物檢測限為5.2cfu/mL.
圖3是本發明LAMP檢測方法的螢光可視化檢測結果，加入螢光染料後肉眼觀察結果；左管為以副豬嗜血桿菌為模板的反應情況，右管為陰性對照。圖4是本發明副豬嗜血桿菌定量標準曲線；利用不同的標準樣品的濃度對應的濁度值對時間繪製成的標準曲線，代人標準曲線方程，即可求出各時間的副豬嗜血桿菌拷貝數。
具體實施例方式1、材料的準備
4型副豬嗜血桿菌、5型副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、布魯氏菌均為廣西獸醫研究所分離保存。LAMP法DNA擴增試劑盒購自北京藍譜生物科技有限公司。2、LAMP引物的設計與合成
根據GenBank中的副豬嗜血桿菌inf B基因序列，利用LAMP法引物輔助設計軟體PrimerExplorer V4軟體設計一套LAMP引物，其中F3/B3為外引物，FIP/BIP為內引物；B4/B5為副豬嗜血桿菌LAMP檢測引物F3 CGAAAGCAACGGATATCGTB3 CACCACCGAATTTCTCAGAA
FIPCTGCTTTCGCGTGTTGGATTGCTCTTGTAGTAGCAGCTGACG
BIP GCCGATCGTGGTTGCGGTAAACTCTTGTTCTACACGCTCT
3、細菌的前處理
由於LAMP法具有敏感度高，其敏感性通常比PCR高出1(Γ1000倍，所以只需要對菌株從平板中刮取一小接種環於裝有500微升PBS的EP管進行煮沸處理即可。4、LAMP反應體系建立
按照試劑盒說明書，按25 μ I體系配置:
2X反應緩衝液12.5μ1
FIP40pmol
BIP40pmol
F35pmol
B35pmol
LF20pmol
LB20pmol
模板2 μ I
超純水補足25 μ I
LAMP反應在實時濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)進行密閉全程監控的形式監測本方法的檢出情況，濁度儀時間監測擴增情況，可繪製標準曲線，通過獲得未知樣品達到0.1時的時間值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。反應溫度以試劑盒推薦的63 °C做為反應溫度。
5、LAMP檢測方法
I)特異性檢測
分別提取4型副豬嗜血桿菌、5型副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌和布魯氏菌菌株7種菌株純培養後，分別刮取一小接種環於裝有500微升PBS的EP管進行煮沸處理作為模板，進行LAMP擴增，檢驗LAMP方法的特異性，實時監測試驗進程進行結果判定。2)敏感性檢測
將過夜培養的副豬嗜血桿菌菌液10倍倍比稀釋至KT1 10_8 8個稀釋度菌液，取各稀釋度菌液100 μ I平板計數。取各稀釋度菌液1ml，用煮沸法提取DNA，取2μ I上清液作為模板進行LAMP擴增。實時監測試驗進程進行結果判定。3)螢光可視化檢測
根據濁度儀監控優化的條件，加入螢光染料，螢光染料在反應前加入，加入的染料為鈣黃綠素商用染料，63°C下反應25分鐘後，在紫外燈下觀察，不採用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像，避免開蓋跑電泳觀察造成的氣溶膠汙染。實施例1 LAMP檢測方法的特異性結果
對4型副豬嗜血桿菌、5型副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、豬鏈球菌、巴氏桿菌、布魯氏菌進行LAMP擴增，結果如圖1所示，4型副豬嗜血桿菌和5型副豬嗜血桿菌反應管在25分鐘左右出現濁度的上 升曲線，為陽性結果，5株陰性對照菌反應管曲線均無擴增情況出現，LAMP呈陰性結果。實施例2 LAMP檢測方法的敏感性結果
細菌純培養物檢測敏感性經平板計數，原始菌液濃度為5.2 X 106cfu/ml。10倍倍比稀釋菌液進行檢測，結果如圖2所示，從圖中看出，LAMP法細菌純培養物檢測限為5.2cfu/ml,而PCR法細菌純培養物檢測限一般為102cfu/ml數量級。實施例3LAMP檢測方法的螢光可視化檢測結果
根據濁度儀監控優化的條件，加入螢光染料，63°C反應30分鐘後，在紫外燈下觀察，圖3為實驗結果，左管為以副豬嗜血桿菌為模板的反應情況，右管為陰性對照，建立的方法方便基層使用，只需使用試劑盒配合本方法設計的LAMP引物，加入樣品後，用低廉的水浴鍋來保持63°C 30分鐘，即可快速觀察結果。且無需開蓋，避免了汙染。實施例4副豬嗜血桿菌定量標準曲線的繪製
設置對照:濃度為 5.2X105cfu/ml、5.2X 104cfu/ml、5.2X 10cfu/ml3、5.2XlO2Cfu/
ml、5.2 X IO1Cfu/ml、5.2 X 10°cfu/ml的標準樣品各一個，因為濃度的對數值與濁度值為
0.1的時間值成線性關係，所以可以將濁度儀捕捉到的值與時間做成標準曲線，獲得標準曲
線方程，如圖4所示。從此次獲得的標準曲線方程來看相關係數R2為0.9629，呈良好的線
性關係。以時間為X值，可求出Y值即濃度的次方數。如某試驗樣品達到濁度值為0.1的時
間為30分鐘時，帶入所建立的標準曲線方程y = -0.3288x + 11.383，求出Y等於1.519，
則濃度為101519，再乘以基數5.2，即為樣品的濃度，從而達到定量的效果。
權利要求
1.一種檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特徵是:該檢測方法包括材料的準備、LAMP引物的設計與合成、細菌的前處理、LAMP反應體系建立以及採用LAMP檢測方法，所述的LAMP檢測方法是採用特異性檢測、敏感性檢測和螢光可視化檢測的方法，反應溫度為63 °C、反應在20-35min間出現擴增，弓丨物包括外弓丨物和內引物， 所述的外引物是F3和B3 ； 所述的內引物是FIP和BIP ； 其中引物的序列分別為: F3 CGAAAGCAACGGATATCGT B3 CACCACCGAATTTCTCAGAAFIP CTGCTTTCGCGTGTTGGATTGCTCTTGTAGTAGCAGCTGACGBIP GCCGATCGTGGTTGCGGTAAACTCTTGTTCTACACGCTCT。
2.根據權利要求1所述的檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特徵是:所述的細菌的前處理是將細菌直接加入PBS煮沸。
3.根據權利要求1所述的檢 測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特徵是:所述的LAMP反應體系建立中LAMP反應體系以25 μ I計: 2X反應緩衝液12.5μ1FIP40pmolBIP40pmolF35pmolB35pmolLF20pmolLB20pmol模板2 μ I超純水補足25 μ I。
4.根據權利要求1所述的檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特徵是:所述的LAMP檢測方法採用實時、定量的檢測方式。
5.根據權利要求1所述的檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特徵是:所述的LAMP檢測方法包括實時濁度儀。
6.根據權利要求1所述的檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特徵是:所述的LAMP檢測方法採用密閉全程監控。
7.根據權利要求1所述的檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特徵是:所述的LAMP檢測方法中螢光可視化檢測採用鈣黃綠素螢光染料，螢光染料在反應前加入。
8.根據權利要求1所述的檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，其特徵是:所述的LAMP檢測方法檢測樣品溶液採用煮沸的PBS稀釋細菌液體。
全文摘要
本發明公開一種檢測副豬嗜血桿菌的LAMP方法，該檢測方法包括材料的準備、LAMP引物的設計與合成、細菌的前處理、LAMP反應體系建立以及採用LAMP檢測方法，LAMP檢測方法是採用特異性檢測、敏感性檢測和螢光可視化檢測的方法，其中引物包括外引物和內引物。特異性檢測和敏感性檢測證實，本發明提供的LAMP檢測方法只需按建立的體系加樣即可實時檢測反應並且定量檢測出副豬嗜血桿菌的拷貝數，快速準確的獲得檢測結果，為簡便、快速地檢測副豬嗜血桿菌帶來便利。
文檔編號C12Q1/68GK103205494SQ20131010785
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月29日 優先權日2013年3月29日
發明者陳澤祥, 李軍, 彭昊, 楊威, 許力幹, 謝宇舟, 禤雄標, 胡帥, 馬春霞, 謝永平, 潘豔 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所