用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺的檢測試劑盒的製作方法

2023-12-09 01:51:36 2

專利名稱：用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺的檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒，具體地說，涉及一種用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺 的檢測試劑盒。
背景技術：
腫瘤標誌物(Tumor Markers)是指由腫瘤組織產生或機體對腫瘤組織的反應而產 生的異常表達的活性物質，包括激素、酶、特異性和非特異性的糖蛋白或糖脂等。它們或不 存在於正常成人組織而僅見於胚胎組織，或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織裡的 含量，它們的存在或量變可以提示腫瘤的性質，藉以了解腫瘤的組織發生、細胞分化、細胞 功能，以幫助腫瘤的診斷、分類、預後判斷以及治療指導。
多胺作為細胞的生長因子之一，其異常增加可誘發腫瘤，癌症患者尿液中多胺含 量明顯高於正常人。精脒/精胺-Ni-乙醯轉移酶(SSAT)可以降解多胺，其含量隨多胺的 增多而增多，以降解多胺，維持多胺在體內的平衡。
金剛烷胺是最早用於抑制流感病毒的抗病毒藥，美國於1966年批准其作為預防 藥。1998年被批准用於甲型流感病毒感染性疾病的治療，也一直作為帕金森病的治療藥。 正常人口服金剛烷胺後，在SSAT作用下可以轉化成乙醯金剛烷胺，因此檢測尿液中乙醯金 剛烷胺的濃度，可以反應體內SSAT的表達量，對惡性腫瘤的預測有重要意義。
然而，潛在腫瘤、體內炎症和心肌缺血等病症都能導致乙醯金剛烷胺濃度升高，為 此，本發明採用組合方法檢測尿液中的乙醯金剛烷胺，可以排除體內炎症和心肌缺血病症 的假陽性幹擾，使惡性腫瘤的預測準確性更高。
C-反應蛋白(C-Reactive Protein,簡稱CRP)是一種能與肺炎鏈球菌C多糖體反 應的急性時相反應蛋白，由肝細胞合成。廣泛分布於人體，如胸水、腹水、心包液、關節液、血 液等處。C反應蛋白是細菌感染和嚴重組織損傷的一項診斷指標。其升高可見於組織損 傷、感染、外科手術、腫瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如風溼性關節炎、全身性 血管炎、多肌痛風溼病等。可採用C-反應蛋白測定試劑盒(透射比濁法)檢測人血清中的 CRP0檢測原理人血清樣品中的CRP與適量的特異性抗體結合，形成不溶性免疫複合物，使 反應液吸光度改變，在抗體量一定的條件下，吸光度改變的大小與人血清樣品中的CRP含 量成正相關。
心肌肌鈣蛋白I (Cardiac Troponin I，簡稱cTnl)是肌鈣蛋白的三個亞單位之一。 心肌肌鈣蛋白I具有心肌特異性，僅存在於心肌收縮蛋白的細肌絲上，在心肌收縮及舒張 過程中起重要的調節作用。心肌肌鈣蛋白I的分子量為23，876Da。心肌損傷時cTnl極易 釋放於血液循環。急性心肌受損後，cTnl立即進入血液循環，這個過程一般持續7-10天。 在發生急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI) 4-6小時，應用靈敏的免疫學方 法，即可在血液中檢測到cTnl。cTnl在正常人血清中幾乎探測不到，AMI病人的血中cTnl 可高達lOOng/ml 300ng/ml。臨床上可採用心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒(膠體金法)定 性檢測人血清中cTnl的濃度，與其它診斷方法一起用於評估心肌梗死引起的心肌損傷。檢測原理心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒採用膠體金免疫層析技術。檢測過程包括在cTnl試 劑盒反應裝置的加樣孔中加入3-4滴約140 μ 1-180 μ 1血清，樣品擴散通過附著彩色顆粒 包被的抗體的濾膜，並與附著在抗體固化帶內的抗體接觸，如果血清cTnl濃度大於0. 3ng/ ml，在檢測區cTnl顆粒被抗-cTnl抗體捕獲，出現一條彩色區帶。cTnl濃度越高，檢測區出 現色帶的速度越快，色帶越深。
CN101581704中公開了一種採用高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜聯用技術來測 定樣品中乙醯化金剛烷胺濃度的方法。該方法操作繁瑣且需要昂貴儀器，不利於廣泛推廣 使用。另外，潛在腫瘤、體內炎症和心肌缺血等病症都能導致人體內乙醯金剛烷胺濃度的升 高，該方法無法分辨乙醯金剛烷胺的濃度升高是由哪種疾病導致，受試者如果有體內炎症 和心肌缺血等病症，也會被錯誤的判定為有腫瘤或潛在腫瘤。發明內容
本發明旨在將檢測乙醯金剛烷胺的免疫學方法和檢測CRP、肌鈣蛋白的生物化學 方法聯合應用，以排除體內炎症和心肌缺血病症對腫瘤預測的假陽性幹擾，使通過檢測乙 醯金剛烷胺早期預測癌症的方法特異性更強。
為了實現本發明目的，本發明的一種用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺的檢測試劑 盒，所述試劑盒包括包被有抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A的載體和帶有標記物的抗乙 醯金剛烷胺的單克隆抗體B;
其中，所述抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A和單克隆抗體B是以乙醯金剛烷胺為 抗原，免疫兔子得到，所述抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A和單克隆抗體B分別結合乙醯金 剛烷胺的不同位點上，所述載體為微孔板或磁珠；單克隆抗體A和B的包被量為5μ g/ml， 50 μ Io
前述的檢測試劑盒，所述標記物為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶。
前述的檢測試劑盒，還包括顯色液，成分為魯米諾10g/l，對碘苯酚300g/l，PBS 0. 01mol/l，以水配製。
前述的檢測試劑盒，還包括檢測CRP的試劑。其中，檢測CRP的試劑包括三羥甲基 氨基甲烷和羊抗人C-反應蛋白抗體。
前述的檢測試劑盒，還包括檢測cTnl的試劑。其中，檢測cTnl的試劑包括心肌肌 鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠多克隆抗體。
本發明還提供一種用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺的免疫學檢測方法，其是通過向 人體給藥金剛烷胺，從人體中獲取液體樣品，採用雙抗體夾心法來測定樣品中乙醯金剛烷胺。
前述的檢測方法，還包括檢測樣品中的CRP濃度。
前述的檢測方法，還包括樣品中的cTnl濃度。
前述的檢測方法，所述雙抗體夾心法具體包括使從人體中獲取的液體樣品與包 被有抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A的載體反應，然後加入帶有標記物的抗乙醯金剛烷胺 的單克隆抗體B，通過標記物的顯色檢測樣品中的乙醯金剛烷胺濃度。其中，所述抗乙醯金 剛烷胺的單克隆抗體A和單克隆抗體B是以乙醯金剛烷胺為抗原，免疫兔子得到，所述抗乙 醯金剛烷胺的單克隆抗體A和單克隆抗體B分別結合乙醯金剛烷胺的不同位點上，所述載體為微孔板或磁珠；單克隆抗體A和B的包被量為5 μ g/ml，50 μ 1。
前述的檢測方法，所述標記物為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶。
前述的檢測方法，可以採用C-反應蛋白測定試劑盒(透射比濁法)檢測樣品中的 CRP濃度。
前述的檢測方法，可以採用心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒(膠體金法)檢測樣品中 的cTnI濃度。
乙醯金剛烷胺的免疫學檢測結果呈陰性，表明受試者體內沒有癌症發生的跡象。
乙醯金剛烷胺的免疫學檢測結果呈陽性，表明受試者可能具有以下的3種病情之
(1)有癌症發生的跡象；
(2)體內有炎症反應，如腸炎、咽炎等；
(3)有心肌缺血方面的疾病。
需要進一步檢測CRP和肌鈣蛋白，通過CRP檢測可確定是否有體內炎症反應，通過 肌鈣蛋白檢測可確定是否有心肌缺血方面的疾病。
如果受試者乙醯金剛烷胺的免疫學檢測結果呈陽性，又排除了體內炎症反應和心 肌缺血方面的疾病，則表明受試者體內有癌症發生的跡象，需要進一步全面的身體檢查，以 確定癌症發生的部位及病情進展情況。
此外，本發明還可以採用其它免疫學檢測方法如競爭法等檢測乙醯金剛烷胺。因 此，所有用抗體來檢測乙醯金剛烷胺的免疫學檢測方法都屬於本發明的範圍。
藉由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果
(1)使用本發明試劑盒檢測用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺，具有簡便、快速、靈敏、 成本低的優點，易於大規模推廣使用。
(2)通過檢測乙醯金剛烷胺來預測癌症時，可以有效排除體內炎症和心肌缺血給 檢測結果帶來的假陽性判斷，提高了檢測結果的特異性。
(3)乙醯金剛烷胺的免疫學檢測方法具有簡便、快速、靈敏、成本低的優點，比高效 液相色譜-電噴霧離子阱質譜聯用技術更易於大規模推廣使用。


圖1為本發明採用雙抗體夾心法測定樣品中乙醯金剛烷胺的反應原理示意圖。
圖2為本發明較佳實施例採用心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒(膠體金法)檢測樣品 中cTnl的結果示意圖，a表示結果呈陽性，b表示表示結果呈陰性。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
實施例1抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A和單克隆抗體B的製備
抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A和單克隆抗體B的製備過程如下
1.免疫以乙醯金剛烷胺為抗原，免疫兔子。
2.融合取出被免疫兔子的脾臟，研碎，將脾細胞與骨髓瘤細胞融合，融合後的雜 交瘤細胞具有脾細胞分泌抗體的能力和骨髓瘤細胞無限增值的能力。
3.篩選及克隆將融合的雜交瘤細胞分到6個96孔板中培養，取細胞培養上清 液，ELISA方法檢測是否含有抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體。取含有抗乙醯金剛烷胺單克 隆抗體的細胞培養孔進行有限稀釋法克隆雜交瘤細胞，獲得能分泌抗乙醯金剛烷胺單克隆 抗體的雜交瘤細胞株。本發明共獲得8種抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體，分別命名為al a80
4.篩選抗不同位點的單抗對將其中一種單克隆抗體al標記親和素，分別與其他 7株單抗組成抗體對，篩選能用於夾心ELISA檢測乙醯金剛烷胺的抗體對。
篩選流程如下
乙醯金剛烷胺包被酶標板一分別加7種單抗一標記生物素的單抗一辣根過氧化 物酶標記的親和素一酶標儀讀數
結果判斷
(1)如果單克隆抗體al與其他單抗結合位點不同，則ELISA結果為陽性。
(2)如果單克隆抗體al與其他單抗結合位點相同，則ELISA結果為陰性。
5.篩選結果單克隆抗體al與另7種單抗中的a5和a8能夠組合，ELISA結果為 陽性。將a5標記親和素與另7種組合，結果表明除a8外其它均能組合。將al作為本發明 的單克隆抗體A，a5作為本發明的單克隆抗體B，因此，單克隆抗體A與單克隆抗體B可以 組合成一對用於夾心ELISA檢測乙醯金剛烷胺的抗體對。
實施例2用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺的檢測試劑盒
試劑盒的製備方法
1.包被在微孔板內注入100 μ 1包被液(5 μ g/ml碳酸鹽緩衝液)，4°C，過夜。單 克隆抗體A的用量為5 μ g/ml，50 μ 1/孔。
2.封閉將已包被好的微孔板取出放置室溫平衡30分鐘。用洗板機洗板1次，拍 幹剩餘的水分，在微孔板內注入150 μ 1封閉液(2g/ml的胎牛血清)，於4°C過夜。
3.乾燥將已封閉好的微孔板取出放置室溫平衡30分鐘。棄去封閉液後，拍幹剩 餘的水分，於乾燥間內乾燥至孔內殘餘液體揮發乾淨。然後放入鋁箔袋內，用真空封口機封 口，貼上標籤，置於4°C中冷藏保存。
樣品檢測過程
1.受試者口服200mg鹽酸金剛烷胺片。服藥兩小時後取中段尿樣，用試劑盒對尿 樣進行乙醯金剛烷胺的含量測定。
2.對照孔加陰性對照(0. Olmol/1磷酸鹽緩衝液)、陽性對照(0. lng/ml乙醯金剛 烷胺溶液)各100 μ 1，樣品孔加100 μ 1尿樣，並反覆吸打，振蕩20秒鐘後，於37°C水浴或 恆溫培養箱中溫育30分鐘。
3.倒掉孔內液體，拍幹。每孔加0. Olmol/1磷酸鹽緩衝液300 μ 1，浸泡20秒以上，拍幹。重複洗板5次。
4.除空白孔，每孔加酶標抗體B 100 μ 1 ；振蕩20秒鐘後，於37°C水浴或恆溫培養 箱中溫育20分鐘。
酶標抗體B的製備方法為單克隆抗體B通過離心、透析和層析柱的方法標記了辣 根過氧化物酶或鹼性磷酸酶。
5. 二次清洗同步驟3。
6.每孔加發光底物液100μ1(成分為魯米諾10g/l，對碘苯酚300g/l，PBS 0. Olmol/1)，振蕩混勻，室溫避光放置5 10分鐘。
7.用化學發光分析儀測量每孔的RLU值。結果分析如表1所示
表1乙醯金剛烷胺的檢測結果(RLU值)
人數乙醯金剛烷胺最 高濃度乙醯金剛烷胺最 低濃度乙醯金剛烷胺平 均濃度正常人24人0.9 ng/ml0 ng/ml0.1 ng/ml確診的肺癌患者6人43.4 ng/ml2.3 ng/ml6.9ng/ml
結果表明正常人的尿液中乙醯金剛烷胺最高濃度上線為0. 9ng/ml，而確診的癌 症患者尿液中乙醯金剛烷胺的最低濃度為2. 3ng/ml。正常人和癌症患者之間有明顯的濃度 界限，因此，本品是理想的癌症早期預測試劑盒。
實施例3 檢測乙醯金剛烷胺的免疫學方法和檢測CRP、肌鈣蛋白的生物化學方 法聯合應用
1.乙醯金剛烷胺的免疫學檢測方法雙抗體夾心法。
具體方法如下
(1)將抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A固定在載體上。其中，所述抗乙醯金剛烷胺 的單克隆抗體A，所述載體為微孔板或磁珠。
(2)加入待測樣品(受試者尿液50 μ 1)，使乙醯金剛烷胺與固定在載體上的單克 隆抗體A結合。
(3)磷酸鹽緩衝液洗滌上述載體，洗三次，每次300 μ 1。
(4)向洗滌後的載體中加入標記了辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶的抗乙醯金剛烷 胺的單克隆抗體B 50μ 1，其中，所述抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體B，使單克隆抗體B結合 於乙醯金剛烷胺分子上。(由於單克隆抗體A和單克隆抗體B能分別結合在乙醯金剛烷胺 分子的不同部位上，因此雙抗體的結合不會互相干擾)
(5)向上述反應體系中加入顯色液50μ 1(成分為魯米諾10g/l，對碘苯酚300g/l， PBS 0. 01mol/l,以水配製)，與標記在單克隆抗體B上的辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶發 生反應，將單克隆抗體B的信號放大，以利於判斷檢測結果。用化學發光儀檢測發色信號， 依據陰性對照(0. Olmol/1磷酸鹽緩衝液)和陽性對照(乙醯金剛烷胺溶液)的結果判斷 待測樣品。雙抗體夾心法的反應原理如圖1所示。
2. CRP檢測方法採用C-反應蛋白測定試劑盒(透射比濁法)檢測血清樣品中CRP 的濃度。C-反應蛋白測定試劑盒購自中生北控生物股份有限公司。檢測方法如表2所示
表2 CRP 檢測
權利要求
1.用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺的檢測試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括包被 有抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A的載體和帶有標記物的抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體 B ；其中，所述抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A和單克隆抗體B是以乙醯金剛烷胺為抗原， 免疫兔子得到，所述抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A和單克隆抗體B分別結合乙醯金剛烷 胺的不同位點上，所述載體為微孔板或磁珠。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒，其特徵在於，所述標記物為辣根過氧化物酶或 鹼性磷酸酶。
3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特徵在於，單克隆抗體A和B的包被量各為 5 μ g/ml, 50 μ 1。
4.根據權利要求3所述的檢測試劑盒，其特徵在於，還包括顯色液，成分為魯米諾IOg/ 1，對碘苯酚300g/l, PBS 0. 01mol/l,以水配製。
5.根據權利要求1-4任一項所述的檢測試劑盒，其特徵在於，還包括檢測CRP的試劑。
6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其特徵在於，檢測CRP的試劑包括三羥甲基氨基 甲烷和羊抗人C-反應蛋白抗體。
7.根據權利要求1-4任一項所述的檢測試劑盒，其特徵在於，還包括檢測cTnl的試劑。
8.根據權利要求7所述的檢測試劑盒，其特徵在於，檢測cTnl的試劑包括心肌肌鈣蛋 白I單克隆抗體和羊抗鼠多克隆抗體。
全文摘要
本發明提供了一種用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺的檢測試劑盒，試劑盒中包括包被有抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體A的載體和帶有標記物的抗乙醯金剛烷胺的單克隆抗體B，其是基於免疫學原理來測定樣品中的乙醯金剛烷胺。使用本發明試劑盒檢測用於預測腫瘤的乙醯金剛烷胺，具有簡便、快速、靈敏、成本低的優點，易於大規模推廣使用。此外，本發明將檢測乙醯金剛烷胺的免疫學方法和檢測CRP、肌鈣蛋白的生物化學方法聯合應用，以排除體內炎症和心肌缺血病症對腫瘤預測的假陽性幹擾，使通過檢測乙醯金剛烷胺早期預測癌症的方法特異性更強。
文檔編號G01N33/577GK102043058SQ201010562240
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者吳樂斌, 張志棟 申請人:中生北控生物科技股份有限公司