病毒性出血敗血症病毒的rt-lamp檢測引物組、試劑盒及檢測方法

2023-12-09 03:26:46

專利名稱：病毒性出血敗血症病毒的rt-lamp檢測引物組、試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學技術領域，涉及海洋水產養殖業的檢測方法，具體涉及一種病毒性出血敗血症病毒(VHSV)的RT-LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
病毒性出血性敗血症(VHS)是一種能感染各種年齡的鮭鱒魚和各種能自由生活的海魚(如鱈、鯡、鰨、鮰、白斑狗魚和大菱鮃、牙鮃等)的致死性的、全身性傳染病。通常在冬末春初和水溫8 10°C時流行，水溫上升到15°C以上，發病率降低。該病流行於整個歐洲大陸、北美和日本，傳染性極強，發病漁場的每升水中有1000個病毒。病毒性出血性敗血症的主要特徵是出血，自然條件下本病潛伏期為7-25天。因症狀緩急及表現差異，分急性型、慢性型和神經型三種類型。病毒性出血敗血症病毒可以通過病魚或帶毒魚的排洩物、卵子、精液等排出病毒，在水體中擴散傳播，病毒經魚鰓侵入魚體而感染。病魚表現為無目的地漂遊，身體發黑，皮膚和鰓滲血潰瘍；眼球突出，肛門紅腫，腹部腫大。剖檢可見大量溶血腹水；腸、心、腎、鰾有時連同肌肉也出血，內臟水腫。VHS的病原是病毒性出血性敗血症病毒(VHSV),屬於彈狀病毒科Novirhabdovirus屬。病毒基因組為一段單鏈負鏈RNA，其線性基因組編碼5個蛋白包括:核衣殼蛋白(N蛋白)，兩個結構蛋白(Ml和M2蛋白)，糖蛋白(G蛋白)和RNA聚合酶(L蛋白)。VHSV粒子長約180nm，寬約70nm。其基因組長度約12k個鹼基。培養分離病毒性出血敗血症病毒一般需要15天以上才能得出結果，檢測周期太長，不適應口岸快速檢測和大通關的時代要求。因此，建立一種快速、準確、高通量且對儀器要求不高的的檢測試劑盒及檢測方法成為目前急需解決的問題。

基於一種新的恆溫核酸擴增法(loop-mediatedisothermal amplification ofDNA,簡稱LAMP)技術的基因檢測正是很好的解決了目前基因檢測的弊端。LAMP技術利用Bst DNA聚合酶和根據不同靶序列設計的兩對特殊的內、外引物，特異性識別靶序列上的六個獨立區域，啟動循環鏈置換反應。在LAMP反應中，內引物雜交在目標DNA區,啟動互補鏈合成，導致啞鈴狀DNA產生。這種結構很快以自身為模板，進行DNA合成延伸，形成莖-環DNA結構，這個莖-環結構DNA作為LAMP循環的起始結構。由於內引物雜交在莖_環的環上，引物鏈置換合成的DNA產生一個有缺口的莖-環DNA中間媒介，在莖上附有目標序列。再通過外引物，在莖的末端形成環狀結構，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物。RT-LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴增法。而且不需要特殊的試劑和儀器設備，因此絕對可以建立起總成本低廉的檢測體系。該方法適用於現場檢測和大量樣品高通量檢測，在臨床疾病診斷，基因晶片開發及食品衛生質量檢驗等領域具有廣闊的應用前景。通過將恆溫基因擴增技術與PCR技術(包括螢光實時定量PCR技術)進行比較，可以發現該技術在靈敏度、特異性和檢測範圍等方法學指標上相當於或優於PCR技術，且不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，而且檢測成本遠低於螢光定量PCR技術。

發明內容
本發明的一個目的在於提供一種病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測引物組。本發明的另一個目的在於提供一種病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒。本發明的另一個目的在於提供病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測方法。本發明所採用的技術方案如下:一種病毒性出血敗血症病毒(VHSV)的RT-LAMP檢測引物組，包括一對外引物VHSV-F3 和 VHSV-B3、一對內引物 VHSV-FIP 和 VHSV-BIP、一對環引物 VHSV-LF 和 VHSV-LB，其核苷酸序列分別如下所示:VHSV-F3: TTATCTCAACCATCTCATCACC (SEQ ID NO:1);VHSV-B3:TGATGCTGACTACTGCCT (SEQ ID NO:2);VHSV-FIP:GGATATTTTCCCAGAAGCGGTGCATGGCTCAAAGAACCG (SEQ ID NO:3);VHSV-BIP:TCTCAAAGTTTCGTCCCAGCCCAGTCACCTCGCATGATT (SEQ ID N0:4)；VHSV-LF:CACTATGGGCA TCTAGGCAC (SEQ ID NO:5);VHSV-LB:CACACTATCTTCTCAACGGTCA (SEQ ID NO:6)。一種病毒性出血敗血症病毒(VHSV)的RT-LAMP檢測試劑盒,其包括權利要求1所述的RT-LAMP檢測引物組。一種病毒性出血敗血症病毒(VHSV)的RT-LAMP檢測試劑盒，包括以下成分:所述的RT-LAMP檢測引物組、逆轉錄酶、DNA聚合酶、RT-LAMP反應液、陽性對照和陰性對照。較佳地，所述檢測試劑盒中，所述引物組中外引物、內引物、環引物的摩爾比為1:8:4。較佳地,所述檢測試劑盒中，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶；所述逆轉錄酶為AMV逆轉錄酶。較佳地，所述檢測試劑盒中，所述RT-LAMP反應液含有:10mM dNTP、IOXThermoPol反應緩衝液、150mM MgSOyjC溶液，三者的體積比是8: 5: 2。較佳地，所述檢測試劑盒中，所述陽性對照為含有病毒性出血敗血症病毒(VHSV)囊膜糖蛋白基因片段的T載體克隆，陰性對照為DEPC水。本發明的檢測試劑盒中還可以含有顯色劑，所述顯色劑為螢光染料SYBR Green
1利用上述的試劑盒檢測病毒性出血敗血症病毒(VHSV)的方法，包括如下步驟(I )、待檢樣品RNA的提取:採用病毒RNA提取試劑盒提取樣品RNA ；(2)、恆溫基因擴增反應:25μ I反應體系含有:VHSV-F30.2 μ M，VHSV-B30.2 μ Μ，VHSV-FIP1.6 μ Μ, VHSV-BIP1.6 μ Μ, VHSV-LF0.8 μ Μ, VHSV-LB0.8 μ Μ, RT-LAMP 反應液12.5 μ 1，逆轉錄酶1U，DNA聚合酶8U，待檢RNAl lOOng，用DEPC水補齊到25 μ I ;設置陽性對照和陰性對照；將配製好的PCR管混勻後離心，並於63 65°C反應60 90min，並在80°C 持續 2min ；
(3)、結果判斷:通過觀察反應管內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果。在試劑盒中含有顯色劑的情況下，往反應管中加入10XSYBR Green 10.5μ1，然後將反應管中置於ESE-Quant Tube Scanner中，根據儀器所實時讀取的螢光信號來判斷擴
增結果。本發明根據病毒性出血敗血症病毒(VHSV)的囊膜糖蛋白基因(gly G基因，GenBank登錄號為DQ401190.1)設計了六條特異性引物，應用上述六條引物，擴增靶序列的6個區域，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高，且非常穩定，形成引物二聚體概率低，保證了反應的順利進行；使得本發明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑑定簡便、適合現場檢測等有益效果:(I)、快速高效:整個擴增只用60 90min即可完成，擴增產量可達IO9 101°個拷貝；(2)、操作簡便:不需要複雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恆定溫度儀就能反應和檢測，條件比較溫和；(3)、高特異性:對常見的幾種魚類病毒鯉春病毒血症病毒(SVCV)、傳染性造血器官壞死病毒(IHNV),以及牙鮃彈狀病毒(HRV)、狗魚幼魚彈狀病毒(PFRV)、傳染性胰壞死病毒(IPNV) RNA無交叉反應。 (4)、聞靈敏度:最低檢測極限可達到4.5pg/反應；(5)、鑑定簡便:可通過觀察加入SYBR Green I顏色變化或者是否存在焦磷酸鎂沉澱來判斷擴增與否，無需電泳等其他任何分析步驟，適合現場檢測。


圖1為本發明中引物VHSV-2對SVCV、IHNV的特異性，其中，1、2=DEPC 處理水對照；3、6:IHNV RNA ;4、7:SVCV RNA ;5、8:VHSV RNA ；圖2為本發明中引物VHSV-2對HRV、PFRV的特異性，其中，1、2=DEPC 處理水對照;3、4:HRV RNA ;5、6:PFRV RNA ;7、8:VHSV RNA ；圖3為本發明中引物VHSV-2對IPNV的特異性，其中，1、2=DEPC 處理水對照;3、4:VHSV RNA ;5、6:IPNV RNA ； 圖4為本發明中RT-LAMP弓丨物VHSV-2的靈敏度。其中，1: 10°倍稀釋；2:101倍稀釋；3:1O2倍稀釋；4:1O3倍稀釋；5:1O4倍稀釋；6:IO5倍稀釋；7:106倍稀釋；8 =DEPC水對照。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。實施例1病毒性出血敗血症病毒RT-LAMP檢測試劑盒的建立病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，包括RT-LAMP引物組、RT-LAMP反應液、Bst DNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、陽性對照和陰性對照。(I), RT-LAMP引物設計:以病毒性出血敗血症病毒(VHSV)的囊膜糖蛋白基因(glyG基因，GenBank登錄號為DQ401190.1)為靶基因，利用在線設計軟體Primer Explorerversion4(http://primerexplorer.jp/e)進行 LAMP 引物的設計。引物序列見表 I。表I引物序列表
權利要求
1.一種病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測引物組，包括一對外引物VHSV-F3和VHSV-B3、一對內引物VHSV-FIP和VHSV-BIP、一對環引物VHSV-LF和VHSV-LB，其核苷酸序列分別如下所示:VHSV-F3: TTATCTCAACCATCTCATCACC ；VHSV-B3:TGATGCTGACTACTGCCT ；VHSV-FIP:GGATATTTTCCCAGAAGCGGTGCATGGCTCAAAGAACCG ；VHSV-BIP:TCTCAAAGTTTCGTCCCAGCCCAGTCACCTCGCATGATT ；VHSV-LF: CACTATGGGCATCTAGGCAC ；VHSV-LB:CACACTATCTTCTCAACGGTCA。
2.一種病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特徵在於，檢測試劑盒包括權利要求1所述的RT-LAMP檢測引物組 。
3.根據權利要求2所述的病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特徵在於，包括以下成分:所述的RT-LAMP檢測引物組、逆轉錄酶、DNA聚合酶、RT-LAMP反應液、陽性對照和陰性對照。
4.根據權利要求1所述的病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特徵在於:所述外引物、內引物、環引物之間的摩爾比為1: 8: 4。
5.根據權利要求3所述的病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特徵在於:所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，所述逆轉錄酶為AMV逆轉錄酶。
6.根據權利要求3所述的病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特徵在於:所述RT-LAMP反應液含有:10mM dNTP、10XThermoPol反應緩衝液、150mM MgSOjK溶液，三者的體積比是8: 5: 2。
7.根據權利要求3所述的病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特徵在於:陽性對照為含有病毒性出血敗血症病毒囊膜糖蛋白基因片段的T載體克隆，陰性對照為DEPC水。
8.根據權利要求3所述的病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，其特徵在於:還含有顯色劑SYBR Green I。
9.利用權利要求2 8任一項所述的試劑盒檢測病毒性出血敗血症病毒的方法，包括如下步驟: (1)、待檢樣品RNA的提取:採用病毒RNA提取試劑盒提取樣品RNA； (2)、恆溫基因擴增反應:25μ I反應體系含有:VHSV-F30.2 μ M，VHSV-B30.2 μ Μ,VHSV-FIP1.6 μ Μ, VHSV-BIP1.6 μ Μ, VHSV-LF0.8 μ Μ, VHSV-LB0.8 μ Μ, LAMP 反應液 12.5 μ 1，逆轉錄酶1U，DNA聚合酶8U，待檢RNAl lOOng，用DEPC水補齊到25 μ I ;設置陽性對照和陰性對照；將配製好的PCR管混勻後離心，並於63 65°C反應60 90min，並在80°C持續2min ； (3)、結果判斷:通過觀察反應管內沉澱的濁度變化來判斷擴增結果。
10.利用權利要求2 8任一項所述的試劑盒檢測病毒性出血敗血症病毒的方法，包括如下步驟: (1)、待檢樣品RNA的提取:採用病毒RNA提取試劑盒提取純化樣品RNA； (2)、恆溫基因擴增反應:25μ I反應體系含有:VHSV-F30.2 μ M，VHSV-B30.2 μ Μ,VHSV-FIP1.6 μ M, VHSV-BIP1.6 μ Μ, VHSV-LF0.8 μ Μ, VHSV-LB0.8 μ Μ, RT-LAMP 反應液12.5μ 1，逆轉錄酶 1U，DNA 聚合酶 8U，10XSYBR Green Ι(λ 5 μ 1，待檢RNAl lOOng，用 DEPC水補齊到25 μ I ;設置陽性對照和陰性對照；將配製好的PCR管混勻後離心，並於63 65°C反應60 90min，並在80°C持續2min ； (3)、結果判斷:將上述反應管中置於ESE-Quant Tube Scanner中，根據儀器實時讀取的螢光信號 來 判斷擴增結果。
全文摘要
本發明屬於分子生物學技術領域，涉及海洋水產養殖業的檢測方法，具體涉及一種病毒性出血敗血症病毒的RT-LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。檢測引物組包括外引物、內引物和環引物；檢測試劑盒主要包括引物液、反應液、DNA聚合酶、逆轉錄酶和對照；其檢測方法是通過提取待檢病毒RNA，利用逆轉錄酶的逆轉錄活性，採用六條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，對樣品RNA模板進行擴增，可檢測到純病毒RNA的pg級，其鑑定採用加入SYBR Green I ESE-Quant-tube Scanner儀器檢測或者利用濁度儀，確定待檢樣品是否含有病毒性出血敗血症病毒RNA。本發明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑑定簡便、適合現場檢測等優點，適於推廣應用。
文檔編號C12R1/93GK103205508SQ201310105578
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月28日 優先權日2013年3月28日
發明者陳進會, 黃偉, 邱楊, 劉建麗, 趙麗, 王學松 申請人:東莞出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心