一種通用可靠的土壤總dna的提取方法及其應用的製作方法

2023-12-04 19:16:56 3

專利名稱：：一種通用可靠的土壤總dna的提取方法及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種土壤總DNA提取方法，尤其涉及一種通用可靠的土壤總DNA提取方法及其在各類土壤樣品中的應用。
背景技術：
：土壤中含有非常豐富的微生物資源，但由於受到研究方法和研究手段的限制，土壤中絕大多數微生物還不為人所知。分子微生物生態學研究表明，利用傳統的純培養技術，僅有1%的微生物可被培養，而未能培養的微生物才是土壤微生物多樣性的主體(AmannRI.etal，1995)，這給微生物的多樣性資源開發和利用帶來很大的局限。在分子水平上研究土壤中未可培養微生物的技術關鍵之一是從各種土壤樣品中獲得可進行分子操作的宏基因組DNA。獲得高純度、大片段、完整性好的土壤微生物總DNA是土壤微生物分子生態學研究和宏基因組文庫構建的基礎。由於土壤樣品種類繁多、成分複雜、物化性質多變，含有大量的無機及有機化合物，存在著對某些酶反應的抑制劑，如腐植酸、腐植酸類似物、重金屬離子等都會干擾提取反應的進行。加之，微生物細胞通常緊密吸附於土壤顆粒表面。因此，從土壤樣品中提取出高質量的、具有代表性的微生物總基因組DNA具有相當難度。因此，建立土壤樣品DNA的提取純化方法對於在分子水平上研究未培養微生物具有重要意義。雖然目前對土壤DNA提取方法的研究報導已有很多，但沒有一種方法能適用於所有的土壤樣品，而且大部分方法都需要再純化過程，也沒有一種方法能滿足不同的實驗條件和實驗目的。
發明內容為了解決上述現有技術中存在的不足，本發明首要目的在於提供一種能夠提取各種類型土壤總DNA的方法。本發明所涉及的土壤樣品類型包括大田作物土壤、保護地土壤、淺海汙泥、深海汙泥、用於汙水處理的活性汙泥、高鹽鹼土壤、酸性土壤等類型。本發明的目的通過下述方案實現—種通用可靠的土壤總DNA的提取方法，其特徵是包括以下步驟[ooog](1)土壤樣品預處理用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩衝液洗滌土壤樣品5g，8000r/min離心10min，沉澱再洗滌一次；(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉澱中加入5mL溶液I，37t:水浴10min，然後加入5mL溶液I1，65。C水浴lh，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉澱；上清中加入2.7mL5mo1/LNaCl，混勻，在65t:水浴中放置5min;[OO13](3)除去蛋白並沉澱DNA:3用氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次，8000r/min離心；得到的上層水相與等體積的溶液III(13%聚乙二醇8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上靜置20min;離心10min(10000r/min)棄上清，沉澱用70%乙醇洗滌一遍，室溫乾燥；(4)除去腐殖酸等雜質乾燥後溶於3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中；力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉澱；上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻後靜置10min;沉澱用70%乙醇洗滌後乾燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉澱；上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉澱，於70%乙醇洗滌沉澱後乾燥，TE溶解；所述的溶液I各成分含量為0.15mol/LNaCl，O.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0;所述的溶液II各成分含量為0.lmol/LNaCl，O.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0。取利用本發明方法分別以白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海汙泥、深海汙泥樣品提取的土壤總DNA，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳後用0.5%EB染色結果。結果顯示各種樣品中的DNA條帶清晰且單一，無拖尾，無雜帶，與A-HindIIIMaker對比均能保證在23kb以上，說明具有較好的完整性。詳見實施例1-實施例12;以利用本發明方法分別以白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海汙泥、深海汙泥樣品提取的土壤總DNA為模板，PCR擴增16SrDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。結果顯示各種樣品中的總DNA都能有效擴增出目標基因，不受腐植酸等其他PCR抑制劑的影響，說明採用本發明方法提取的各種樣品中的總DNA其濃度和質量可以保證後續試驗的進行。詳見實施例1-實施例12。經步驟(4)得到的白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海汙泥、深海汙泥樣品DNA溶液分別在230nm、260nm、280nm紫外測定腐植酸含量、核酸含量和蛋白質含量。通過測定0D260/0D230和0D260/0D280比值檢測提取的DNA純度，二者比值在1.8-2.2之間為最佳。本方法測定的0D260/0D230和0D260/0D280比值比文獻中報導的其他方法提取的土壤中總DNA的純度要高，文獻中報導的其他方法提取的土壤中總DNA樣品，其0D260/0D230比值均小於1，0D260/0D280比值也明顯低於本方法，且其他方法提取DNA後還需要繁雜的純化過程，本方法提取的DNA樣品中A260/A230及A260/A280比值結果見表1。表1本發明方法提取不同樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值tableseeoriginaldocumentpage4綜上所述，本發明的有益效果包括本發明所提供的土壤樣品總DNA提取方法綜合使用適當濃度的醋酸鉀和氯化鎂溶液去除樣品中的各類腐植酸等雜質和PCR擴增抑制因子，並能得到較高濃度的大片段DNA，且適合於PCR擴增試驗，能夠保證後續試驗的順利進行。能滿足不同的實驗條件和實驗目的。提取過程無需再純化，縮減了提取步驟，降低了提取成本。本發明能適用於所有的土壤樣品，具有通用可靠、提取成本低廉的突出優點。圖1為利用本發明方法分別提取白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海汙泥、深海汙泥樣品的總DNA經1.0%瓊脂糖凝膠電泳後用0.5%EB染色結果。在圖中，1-白菜地，2-玉米地，3-蔥地，4-森林地，5-保護地，6_松樹，7_槐樹地，8-柞樹地，9-柏樹，10-溫室沙地，11-近海汙泥，12-深海汙泥.M-HindIIImarker(Taka:ra)。圖2為以本發明方法提取的白菜地、玉米地、蔥地、森林地、保護地、松樹、槐樹地、柞樹地、柏樹、溫室沙地、近海汙泥、深海汙泥樣品的總DNA為模板，PCR擴增16SrDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。在圖中，1-白菜地，2-玉米地，3-蔥地，4-森林地，5-保護地，6_松樹，7_槐樹地，8-柞樹地，9-柏樹，10-溫室沙地，11-近海汙泥，12-深海汙泥.M-DL2000(Takara)。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。實施例1利用本發明所述方法提取大連董家溝保護地土壤總DNA:(1)土壤採集及預處理大連董家溝黃瓜保護地採用五點法採樣，去除表面土，取10-20cm的土樣，裝入滅菌紙袋帶回實驗室，研缽研細土樣，過200目標準篩。用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩衝液洗滌土壤樣品5g，8000r/min離心10min，沉澱再洗滌一次。(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉澱中加入5mL溶液1(0.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然後加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉澱。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混勻，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白並沉澱DNA:用氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次，8000r/min離心。得到的上層水相與等體積的溶液III(13%PEG8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上靜置20min。離心10min(10000r/min)棄上清，沉澱用70%乙醇洗滌一遍，室溫乾燥。(4)除去腐殖酸等雜質乾燥後溶於3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心10min(8000r/min)，5棄沉澱。上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻後靜置10min。沉澱用70%乙醇洗滌後乾燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉澱。上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉澱，於70%乙醇洗滌沉澱後乾燥，TE溶解，電泳結果如圖1-5，PCR擴增電泳結果如圖2-5;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例2利用本發明所述方法提取大連開發區童牛嶺森林土壤總DNA:(1)土壤採集及預處理大連開發區童牛嶺森林中去除表層落葉及腐殖質層，取10-20cm的土樣，裝入滅菌紙袋帶回實驗室，除去較大石塊，研缽研細土樣，過200目標準篩。用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩衝液洗滌土壤樣品5g，8000r/min離心10min，沉澱再洗滌一次。(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉澱中加入5mL溶液I(O.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然後加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉澱。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混勻，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白並沉澱DNA:用氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次，8000r/min離心。得到的上層水相與等體積的溶液111(13%聚乙二醇8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上靜置20min。離心10min(10000r/min)棄上清，沉澱用70%乙醇洗滌一遍，室溫乾燥。(4)除去腐殖酸等雜質乾燥後溶於3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉澱。上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻後靜置10min。沉澱用70%乙醇洗滌後乾燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉澱。上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉澱，於70%乙醇洗滌沉澱後乾燥，TE溶解，電泳結果如圖1-4，PCR擴增電泳結果如圖2-4;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例3利用本發明所述方法提取大連近海汙泥土壤總DNA:(1)汙泥採集及預處理大連開發區泊石灣乘船入近海，收集10m左右海泥裝入無菌塑膠袋帶回實驗室，除去較大沙粒，用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩衝液洗滌汙泥樣品5g，8000r/min離心10min，沉澱再洗滌一次。(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉澱中加入5mL溶液1(0.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然後加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉澱。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混勻，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白並沉澱DNA:用氯仿異戊醇(24:1)抽提兩次，8000r/min離心。得到的上層水相與等體積的溶液III(13%PEG8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上靜置20min。離心lOmin(lOOOOr/min)棄上清，沉澱用70%乙醇洗滌一遍，室溫乾燥。(4)除去腐殖酸等雜質乾燥後溶於3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心lOmin(8000r/min)，棄沉澱。上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻後靜置10min。沉澱用70%乙醇洗滌後乾燥，用90ITE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心lOmin(8000r/min)，棄沉澱。上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉澱，於70%乙醇洗滌沉澱後乾燥，TE溶解，電泳結果如圖l-ll，PCR擴增電泳結果如圖2-11;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例4土壤採集地為白菜地，其它同實施例1。電泳結果如圖1-1，PCR擴增電泳結果如圖2-1;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例5土壤採集地為玉米地，其它同實施例1。電泳結果如圖1-2，PCR擴增電泳結果如圖2-2;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例6土壤採集地為蔥地，其它同實施例1。電泳結果如圖1-3，PCR擴增電泳結果如圖2-3;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例7土壤採集地為松樹地，其它同實施例2。電泳結果如圖1-6，PCR擴增電泳結果如圖2-6;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例8土壤採集地為槐樹地，其它同實施例2。電泳結果如圖1-7，PCR擴增電泳結果如圖2-7;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例9土壤採集地為柞樹地，其它同實施例2。電泳結果如圖1-8，PCR擴增電泳結果如圖2-8;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例10土壤採集地為柏樹地，其它同實施例2。電泳結果如圖1-9，PCR擴增電泳結果如圖2-9;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例11土壤採集地為溫室沙地，其它同實施例3。電泳結果如圖l-10，PCR擴增電泳結果如圖2-10;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。實施例12土壤採集地為深海汙泥，其它同實施例3。電泳結果如圖l-12，PCR擴增電泳結果如圖2-12;樣品DNA中A260/A230及A260/A280比值見表1。權利要求一種通用可靠的土壤總DNA的提取方法，其特徵是包括以下步驟(1)土壤樣品預處理用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸鈉緩衝液洗滌土壤樣品5g，8000r/min離心10min，沉澱再洗滌一次；(2)裂解細胞將步驟(1)中的沉澱中加入5mL溶液I，37℃水浴10min，然後加入5mL溶液II，65℃水浴1h，每隔15分鐘搖晃，離心10min(6000r/min)棄沉澱；上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混勻，在65℃水浴中放置5min；(3)除去蛋白並沉澱DNA用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提兩次，8000r/min離心；得到的上層水相與等體積的溶液III(13％聚乙二醇8,000，1.6mol/LNaCl)；混合，冰上靜置20min；離心10min(10000r/min)棄上清，沉澱用70％乙醇洗滌一遍，室溫乾燥；(4)除去腐殖酸等雜質乾燥後溶於3mlTE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)中；加入707μl(7.5mol/L)醋酸鉀溶液，混合物在室溫條件下放置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉澱；上清中加入0.6倍體積的冰異丙醇，混勻後靜置10min；沉澱用70％乙醇洗滌後乾燥，用90μlTE溶解DNA，加入等體積2mol/L氯化鎂溶液，混勻，室溫靜置30min，離心10min(8000r/min)，棄沉澱；上清中加入0.6倍體積的異丙醇沉澱，於70％乙醇洗滌沉澱後乾燥，TE溶解；所述的溶液I各成分含量為0.15mol/LNaCl，0.1mol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0；所述的溶液II各成分含量為0.1mol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10％SDS，pH8.0。2.如權利要求1所述的通用可靠的土壤總DNA的提取方法在各種類型土壤總DNA的製備中的應用。全文摘要本發明涉及一種通用可靠的土壤總DNA的提取方法及其應用，屬於分子生物學領域。土壤中含有非常豐富的微生物資源，但利用傳統的純培養技術，僅有1％的微生物可被培養，而未能培養的微生物才是土壤微生物多樣性的主體，這給微生物的多樣性資源開發和利用帶來很大的局限。本研究所提供的提取方法使用溶液I、溶液II、醋酸鉀和氯化鎂移除腐植酸等雜質，能滿足不同類型土壤樣品的需要，且能得到高質量、大片段並且適合後續克隆實驗的DNA，為研究各種環境中土壤(汙泥)樣品微生物多樣性奠定了基礎。提取過程無需再純化，縮減了提取步驟，降低了提取成本。文檔編號C12N15/10GK101775388SQ20101010329公開日2010年7月14日申請日期2010年1月29日優先權日2010年1月29日發明者於基成,劉秋,胡英暢,閆建芳申請人:大連民族學院