一種BMP‑2/PPLA微球及其製備方法與流程

2023-12-05 10:32:56 1

本發明涉及骨修復材料的製備技術領域，具體涉及一種BMP-2/PPLA微球及其製備方法。

背景技術：

骨缺損指骨的結構完整性被破壞，是臨床常見病。創傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術清創、以及各種先天性疾病是導致骨缺損的主要原因。常規手術治療往往給患者帶來難忍的疼痛，治療效果也難以預測，常導致骨不連的發生。臨床上治療骨缺損的主要手段是自體骨移植或異體骨移植，需要骨生長因子來促進骨缺損部位的癒合。

骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是研究較早的骨生長因子，具有很強的誘導成骨的作用，可以誘導間充質細胞向骨細胞分化，促進成骨細胞分化成熟，參與骨和軟骨的生長發育及其重建過程，進而加速骨缺損的修復，是治療難治性骨折及修復骨缺損的重要物質。但是，BMP-2作為一種蛋白質類藥物，具有蛋白質類藥物共有的缺點：生物穩定性差，半衰期短，進入人體後很快就隨體液擴散或降解，不能在應用部位發揮長效作用，無法達到預期的治療效果。因此，將BMP-2與合適的載體相結合以製備BMP-2緩釋系統是研究的重要方向之一。

藥物緩釋系統是指將藥物與高分子材料以物理或者化學方法結合，使藥物能在體內通過滲透，擴散等方式以較低濃度持續釋放出來，以達到充分發揮藥物功效的目的。因此，近年來有研究者採用高分子材料作為緩釋載體對BMP-2包埋，製備成高分子材料/BMP-2緩釋系統來提高在臨床上的應用。

微球是藥物溶解或分散於高分子材料中形成的微小球狀實體，一般製備成混懸劑供注射用。製備藥物緩釋微球的方法有乳化溶劑揮發法、相分離法、乳化溶劑萃取法、噴霧乾燥法、熔融法等。其中，在溶劑揮發法中，超聲製得的微球粒徑分布經常比較寬，載藥量也比較低。超聲乳化產生局部過熱，使蛋白變性。例如中國專利申請「一種PELA/BMP-2微球的製備方法」(CN104511019A)，製備出了光滑度好流動性好的微球，但缺點在於使用超聲法會導致微球粒徑大小不一，使得製備出的微球不穩定，並且超聲乳化操作難以控制，容易導致微球破裂及蛋白質變性。

另外，臨床上的非注射型的固體支架，即通過手術植入的支架，預先或使用前整合了生長因子或化學藥物的多孔支架(或納米纖維狀支架)，其形狀多為薄膜狀、片狀、塊狀等，由於體積較大且有一定剛性，必須通過手術才能植入，操作複雜。

因此，有必要提供一種新的BMP-2緩釋載藥系統，以實現給藥途徑的多樣化。

技術實現要素：

針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種BMP-2/PPLA微球及其製備方法，以PPLA作為載體材料，採用復乳溶劑揮發法對BMP-2進行包載，製備得到微球；所得微球的表面光滑、大小均一、穩定性高，可局部注射給藥，使BMP-2長效穩定的作用於應用部位，促進骨生長。

為實現上述目的，本發明採用下述技術方案：

本發明的第一方面，提供一種BMP-2/PPLA微球的製備方法。該方法包括：將BMP-2溶解或者分散在溶解有PPLA的乳相中，製備得到初乳的階段；將初乳分散在PVA溶液中，製備得到復乳的階段；以及將復乳中的有機溶劑除去，製備得到包封有BMP-2的微球的階段。

上述方法中，所述溶解有PPLA的乳相中，PPLA的濃度為85-95mg/ml；優選為90mg/ml。

上述方法中，所述溶解有PPLA的乳相為二氯甲烷。

上述方法中，優選的，將BMP-2溶液分散在溶解有PPLA的乳相中；所述BMP-2溶液的濃度為0.5-0.6mg/ml，BMP-2溶液與溶解有PPLA的乳相加入的體積比為1：(4-6)。進一步優選的，所述BMP-2溶液的濃度為0.55mg/ml，BMP-2溶液與溶解有PPLA的乳相加入的體積比為1：5。

上述方法中，使用勻漿機在冰浴的環境下進行第一次乳化，剪切轉速為14000-16000rmp，時間為15-25s，製備得到初乳；優選的，剪切轉速為15000rmp，時間為20s。

上述方法中，所述PVA溶液的質量分數為3-5％；優選為4％。

上述PVA溶液的製備方法為：將PVA溶於蒸餾水中，過夜溶脹攪拌溶解或加熱至80-90℃溶解，配製得到PVA溶液。

上述方法中，初乳與PVA溶液加入的體積比為1：(5-15)；優選為1：10。

上述方法中，使用勻漿機在冰浴的環境下進行第二次乳化，剪切轉速為4500-5500rmp，時間為50-70s，製備得到復乳；優選的，剪切轉速為5000rmp，時間為60s。

上述方法中，將復乳液置於磁力攪拌器上，300-500rmp攪拌3-5h，除去有機溶劑；優選的，400rmp攪拌4h，除去有機溶劑。

上述方法中，將復乳液中的有機溶劑除去後，再離心洗滌，進一步去除未揮發乾淨的有機溶劑，然後經冷凍乾燥，製備得到包封有BMP-2的微球。

上述方法中，所述PPLA的分子量為50000Da。

本發明的第二方面，提供由上述方法製備得到的BMP-2/PPLA微球，所述BMP-2/PPLA微球的粒徑為3.48±0.51μm。

術語說明：

PPLA：是聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物，PLA和PEG均具有良好的生物相容性，可生物降解性和無毒無免疫原性，已得到美國FDA批准應用於臨床。

PVA：聚乙烯醇，由環氧乙烷與水或乙二醇逐步加成聚合而成。系列產品無毒、無刺激性，具有良好的水溶性，並與許多有機物組份有良好的相溶性。

另外，為方便表述，本發明中將BMP-2/PPLA微球簡寫為BMP-2-PPLA-MS。

本發明的有益效果：

(1)緩釋載體的材料是緩釋系統的重要組成部分，理想的載體材料必須具備良好的生物相容性、生物可降解性、合理的緩釋時間及降解速度，以及對人體無毒副作用等基本性能。本發明以PPLA作為緩釋載體的材料，在體內無毒、穩定可降解；其是由PLA和PEG嵌段共聚而成，其中PEG可以提高PLA的親水性，同時可以賦予PLA一些新的特性和功能，它能降低生物體內蛋白質在材料表面的吸附和細胞的黏附，從而避免在體內被免疫系統識別；它還能保護被改性的PLA不受免疫系統的破壞，且形成的兩親性共聚物具有可修飾性，可引入端基活性基團。

本發明還對PPLA的分子量進行了考察，PPLA的分子量會影響製備的BMP-2/PPLA微球的粒徑、載藥量和包封率。首先，不同分子量的PPLA在二氯甲烷中的溶解度不同，所以不同分子量的PPLA固化的速度不同，從而製備得到的微球的粒徑不同；其次，本發明研究發現，由於BMP-2與不同分子量的PPLA的作用不同，因此隨PPLA分子量的增加，載藥量和藥品包封率並不完全呈上升趨勢，而是在PPLA的分子量為50000Da時獲得最大值。

(2)為避免超聲法導致的製備的微球粒徑大小不一的問題，本發明採用復乳溶劑揮發法進行製備，將聚乳酸類聚合物溶於揮發性有機溶劑中作為油相，一定濃度的主藥溶液作為內水相，油相與內水相經攪拌得到W/O型初乳，然後將初乳再次分散在含有乳化劑的外水相中，形成W/O/W型復乳後，在磁力攪拌器上不斷攪拌，使有機溶劑揮發，進而製備得到微球。

剪切轉速和時間會在很大程度上影響製備的微球的粒徑；本發明在製備初乳和復乳時分別採用了不同的剪切轉速和時間，其中，製備初乳時，採用較高的剪切轉速和較短的剪切時間，可以防止初乳的穩定性受到破壞，而初乳的穩定性會直接影響載藥量和藥品的包封率；在製備復乳時，採用較低的剪切轉速和較長的剪切時間，可以使初乳在PVA溶液中的分散更加均勻，乳滴聚集的現象減弱，製備的復乳更加穩定，進一步的，製備得到的微球的粒徑更加均一。

(3)本發明製備的微球表面光滑，大小均一，穩定性高，且操作簡便易控。微球的粒徑為3.48±0.51μm，可局部注射，從而降低手術等複雜操作，並使蛋白長效穩定地作用於應用部位，促進骨生長，使得給藥途徑多樣化。

附圖說明

圖1：本發明製備的BMP-2/PPLA微球的超景深顯微鏡圖；

圖2：用雷射粒度分析儀測得的BMP-2/PPLA粒徑分布圖；

圖3：BMP-2含量測定標準曲線。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發明，並不對其內容進行限定。

實施例1：BMP-2-PPLA-MS的製備

(1)稱取一定質量的PPLA溶於二氯甲烷中，使用渦旋機振蕩溶解，配製得到PPLA濃度為90mg/ml的溶液。取一定體積的PPLA(分子量為50000Da)溶液置於EP管中，加入BMP-2蛋白儲備液(濃度為0.55mg/ml)，控制BMP-2蛋白儲備液與PPLA溶液加入的體積比為1：5；使用勻漿機在冰浴的環境下進行第一次乳化，剪切轉速為15000rpm，時間為20s，得到初乳。

(2)稱取一定質量的PVA溶於一定體積的蒸餾水中，過夜溶脹攪拌溶解或加熱至80至90℃溶解，配置為PVA質量分數為4％的溶液，溶解完全之後冷卻至室溫，在上一步得到的初乳中加入一定體積的PVA溶液，控制PPLA與PVA的體積比為1:10，同樣使用勻漿機在冰浴的環境下進行第二次乳化，剪切轉速為5000rpm，時間為60s，得到復乳。

(3)在EP管中放入一顆大小適中的攪拌子，將復乳放置於磁力攪拌器上攪拌4h，去除有機溶劑，轉速為400rpm。

(4)最後將復乳離心水洗3次，去除未揮發乾淨的有機溶劑，離心轉為5000rpm時間為6min。在-60℃，10Pa的條件下冷凍乾燥得到由PPLA包載BMP-2蛋白的微球。

將本實施例製備的BMP-2/PPLA微球置於光學顯微鏡下觀察，本實施例的微球呈球形，外觀完整，流動性很好。本實施例製備的BMP-2/PPLA微球的超景深顯微鏡圖如圖1所示，用雷射粒度分析儀測得的BMP-2/PPLA粒徑分布圖如圖2所示。由圖1和圖2可以看出，本實施例製備的BMP-2/PPLA微球表面光滑，大小均一，穩定性高。

BMP-2的含量測定採用考馬斯亮藍法。精密吸取BMP-2蛋白儲備液加水稀釋，製備8～10個濃度平均分布在5.0～55μg/ml的系列標準溶液。以水為空白溶液，取每個標準濃度溶液1ml分別加入5ml考馬斯亮藍G250染液，於579nm波長處測定吸光度(A)，以吸光度A為縱坐標，BMP-2濃度c(μg/ml)為橫坐標，繪製標準曲線。根據含量測定方法學的要求，配製5.5、27.5、49.5μg/ml3個濃度的BMP-2溶液進行回收率和精密度的測定。

如下配置系列標準溶液(5.5、11、16.5、22、27.5、33、38.5、44、49.5μg/ml)

繪製BMP-2含量測定標準曲線，結果如圖3所示。

包封率EE(％)與載藥量DL(％)的計算：

根據含量測定方法學的要求，配製5.5、27.5、49.5μg/ml3個濃度的BMP-2溶液進行回收率和精密度的測定。

取步驟(3)操作後經溶劑揮發後得到的乳液，在離心機上以5000rpm的速度離心6min，精密量取1ml上清液置於10ml具塞試管中，根據考馬斯亮藍法用TU-1810紫外可見分光光度計測定其吸光度，按圖3的回歸方程得出上清液中BMP-2含量。

BMP-2-PLGA-MS的包封率(％)＝[(投入的總藥量-上清液中游離藥量)/投入的總藥量]×100％＝(79.80±0.06)％。

BMP-2-PLGA-MS的載藥量(％)＝(微球中的藥物量/微球總重量)×100％＝(0.18±0.03)％。

實施例2：BMP-2-PPLA-MS的製備

(1)稱取一定質量的PPLA溶於二氯甲烷中，使用渦旋機振蕩溶解，配製得到PPLA濃度為95mg/ml的溶液。取一定體積的PPLA(分子量為50000Da)溶液置於EP管中，加入BMP-2蛋白儲備液(濃度為0.55mg/ml)，控制BMP-2蛋白儲備液與PPLA溶液加入的體積比為1：5；使用勻漿機在冰浴的環境下進行第一次乳化，剪切轉速為16000rpm，時間為15s，得到初乳。

(2)稱取一定質量的PVA溶於一定體積的蒸餾水中，過夜溶脹攪拌溶解或加熱至80至90℃溶解，配置為PVA質量分數為4％的溶液，溶解完全之後冷卻至室溫，在上一步得到的初乳中加入一定體積的PVA溶液，控制PPLA與PVA的體積比為1:10，同樣使用勻漿機在冰浴的環境下進行第二次乳化，剪切轉速為5500rpm，時間為50s，得到復乳。

(3)在EP管中放入一顆大小適中的攪拌子，將復乳放置於磁力攪拌器上攪拌4h，去除有機溶劑，轉速為400rpm。

(4)最後將復乳離心水洗3次，去除未揮發乾淨的有機溶劑，離心轉為5000rpm時間為6min。在-60℃，10Pa的條件下冷凍乾燥得到由PPLA包載BMP-2蛋白的微球。

按實施例1的方法對包封率和載藥量進行檢測，結果為：本實施例的BMP-2-PPLA-MS的包封率為(77.42±0.14)％；載藥量為0.16±0.02％。

實施例3：BMP-2-PPLA-MS的製備

(1)稱取一定質量的PPLA溶於二氯甲烷中，使用渦旋機振蕩溶解，配製得到PPLA濃度為85mg/ml的溶液。取一定體積的PPLA(分子量為50000Da)溶液置於EP管中，加入BMP-2蛋白儲備液(濃度為0.55mg/ml)，控制BMP-2蛋白儲備液與PPLA溶液加入的體積比為1：5；使用勻漿機在冰浴的環境下進行第一次乳化，剪切轉速為14000rpm，時間為25s，得到初乳。

(2)稱取一定質量的PVA溶於一定體積的蒸餾水中，過夜溶脹攪拌溶解或加熱至80至90℃溶解，配置為PVA質量分數為4％的溶液，溶解完全之後冷卻至室溫，在上一步得到的初乳中加入一定體積的PVA溶液，控制PPLA與PVA的體積比為1:10，同樣使用勻漿機在冰浴的環境下進行第二次乳化，剪切轉速為4500rpm，時間為70s，得到復乳。

(3)在EP管中放入一顆大小適中的攪拌子，將復乳放置於磁力攪拌器上攪拌4h，去除有機溶劑，轉速為400rpm。

(4)最後將復乳離心水洗3次，去除未揮發乾淨的有機溶劑，離心轉為5000rpm時間為6min。在-60℃，10Pa的條件下冷凍乾燥得到由PPLA包載BMP-2蛋白的微球。

按實施例1的方法對包封率和載藥量進行檢測，結果為：本實施例的BMP-2-PPLA-MS的包封率為(78.56±0.20)％；載藥量為0.19±0.03％。

對比例1：

將實施例1中加入的PPLA的分子量調整為40000Da，其他同實施例1，製備得到BMP-2-PPLA-MS。

按實施例1的方法對包封率和載藥量進行檢測，結果為：本對比例的BMP-2-PPLA-MS的包封率為(64.72±0.24)％；載藥量為0.12±0.04％。

對比例2：

將實施例1中加入的PPLA的分子量調整為60000Da，其他同實施例1，製備得到BMP-2-PPLA-MS。

按實施例1的方法對包封率和載藥量進行檢測，結果為：本對比例的BMP-2-PPLA-MS的包封率為(63.26±0.18)％；載藥量為0.13±0.02％。

對比例3：

將實施例1的步驟(1)中，第一次乳化的剪切轉速調整為14000rpm，時間為30s；步驟(2)中，第二次乳化的剪切轉速調整為6000rpm，時間為50s。其他同實施例1，製備得到BMP-2-PPLA-MS。

結果發現，該對比例製備的BMP-2-PPLA-MS的粒徑大小不一，彼此之間會有粘連。

按實施例1的方法對包封率和載藥量進行檢測，結果為：本對比例的BMP-2-PPLA-MS的包封率為(65.34±0.15)％；載藥量為0.14±0.02％。

以上所述僅為本申請的優選實施例而已，並不用於限制本申請，對於本領域的技術人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本申請的保護範圍之內。