番茄谷氧還蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途的製作方法

2023-12-05 15:38:41 5

專利名稱：番茄谷氧還蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學與基因工程領域，尤其涉及一種番茄谷氧還蛋白基因 SlGRXl及其克隆方法和用途。本發明涉及番茄SlGRXl的cDNA序列，該cDNA編碼的蛋白屬 於CFGS類谷氧還蛋白。
背景技術：
活性氧是植物生長發育過程中重要的信號傳導因子，對促進植物的生長發育和新 陳代謝，以及作物的高產、優質都起著重要的作用。然而，植物體內過多的活性氧積累會對 破壞其體內的生物大分子，幹擾植物正常的信號傳導進而對植物造成嚴重的傷害，容易造 成植物的萎蔫甚至死亡。植物生長的各種逆境環境如乾旱、鹽害、冷害、重金屬、紫外輻射、 臭氧、機械傷害、營養缺乏、病原體入侵、高光強等均導致光合電子傳遞鏈及呼吸鏈產生過 量活性氧，嚴重影響植物的生長發育，從而降低植物的產量與品質。為了抵抗環境的活性氧脅迫，植物在長期的進化的過程中形成了清除活性氧的復 雜基因調控網絡，包括mRNA的降解與選擇性剪切、蛋白質的磷酸化與去磷酸化、糖基化、泛 素化等。其中谷氧還蛋白基因在植物的抗氧化脅迫中起重要作用，該類蛋白其能夠還原生 物體內蛋白質間或者蛋白質內部的二硫鍵而形成巰基，維持蛋白的氧化還原狀態，從而調 控蛋白的活性。近年來，蛋白質的可逆氧化還原修飾日益受到重視，這種修飾可能是信號轉 導調控中的一種新的分子機制，成為除磷酸化修飾、糖基化修飾及泛素化修飾外的重要方 式。通過獲得新的谷氧還蛋白基因，研究其分子功能，對於研究植物抗逆的分子機理有重要 價值，也為植物的基因工程研究提供新的基因資源。

發明內容
本發明的目的是針對目前對植物抗逆反應分子機制、抗逆植物基因資源匱乏等問 題，提供一種番茄谷氧還蛋白基因SlGRXl及其克隆方法和用途。植物谷氧還蛋白基因SlGRXl是具有如SEQ ID NO 1所示1003個鹼基DNA序列， 編碼具有抗氧化、乾旱及鹽鹼能力的CGFS類的谷氧還蛋白。植物谷氧還蛋白基因SlGRXl的克隆方法包括下列步驟1)根據擬南芥和水稻的CGFS類谷氧還蛋白基因，對其進行多序列比對，根據保守 的同源序列設計了一對簡併引物，上遊引物Tl為5』-SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3』，下遊 引物T2為5，-ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3，，其中，W代表T或者A，S代表G或者C，M代 表A或者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者 C，R代表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T ；2)用上述引物經RT-PCR擴增基因片段，經測序後與NCBI等網上資料庫進行同源 性比對，證明得到的片段為為番茄的谷氧還蛋白基因的片段；3)以上述擴增的基因片段為種子序列，採用電子克隆的方法，在番茄 的EST資料庫中進行電子延伸拼接，根據延伸的序列設計引物，上遊引物YGS2為5，-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3，，下遊引物 YGAS 為 5，-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3，，禾Ij 用RT-PCR克隆獲得到1003bp的基因片段，將該片段克隆到PGEM-T easy載體上測序，得到 的基因命名為SlGRXl ；番茄CGFS類蛋白是具有權利要求1所述植物谷氧還蛋白基因SlGRXl編碼的如 SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列，或者與其胺基酸序列至少60%同源性。植物谷氧還蛋白基因SlGRXl用於經轉基因或雜交育種改良植物的抗氧化、乾旱 及鹽鹼的能力。本發明與現有技術相比具有的優點1)採用同源克隆及電子克隆的方法從番茄中克隆到一個新的谷氧還蛋白基因，克 隆方法簡單、高效。2)通過利用基因的下調和上調表達2種方法分析基因的功能，數據更為確鑿可 信，通過2種方法均證明該基因具有抗氧化、乾旱及鹽鹼的功能，具有很強的理論研究及應 用研究價值。可以通過外源基因導入技術過量表達SlGRXl基因來提高植物對氧化、乾旱及 鹽鹼的能力，從而增強作物對逆境的抗性，提高作物的產量與品質。


圖1是SlGRXl基因的組織表達特異性；圖2是SlGRXl蛋白的亞細胞定位；圖3是SlGRXl基因沉默番茄與對照植株對氧化脅迫的反應。A =SlGRXl基因沉默 番茄與對照植株葉盤在H2O2脅迫下Od和5d時的症狀表現；B =SlGRXl基因沉默番茄與對照 植株葉盤的相對葉綠素含量隨時間變化；C =SlGRXl基因沉默番茄與對照植株中SlGRXl基 因的表達情況；圖4是SlGRXl基因沉默番茄與對照植株對乾旱的反應。A =SlGRXl基因沉默番茄 與對照植株在乾旱處理Od和6d時的表型；B =SlGRXl基因沉默番茄與對照植株葉片的相對 含水量；C =SlGRXl基因沉默番茄與對照植株中SlGRXl基因的表達情況；圖5是SlGRXl基因沉默番茄與對照植株對鹽鹼的反應。A =SlGRXl基因沉默番茄 與對照植株在NaCl處理Od和IOd時的表型；B =SlGRXl基因沉默番茄與對照植株葉盤的相 對葉綠素含量；C =SlGRXl基因沉默番茄與對照植株中SlGRXl基因的表達情況；圖6是轉SlGRXl基因擬南芥及對照對氧化、乾旱及鹽鹼的抗性。A 轉基因擬南 芥及對照對氧化、乾旱及鹽鹼脅迫的反應；B 轉基因擬南芥及對照在各種脅迫條件下的根 長。
具體實施例方式實施例1番茄谷氧還蛋白基因的克隆根據擬南芥和水稻的CGFS類谷氧還蛋白基因，根據保守的同源序列設計了 一對簡併引物，上遊引物Tl為5』 -SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3』，下遊引物T2為 5，-ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3，，其中，W 代表 T 或者 A，S 代表 G 或者 C，M 代表 A 或 者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者C， R代表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T。經RT-PCR擴增、測序，通過與NCBI等網上資料庫進行同源性比對證明得到的片段為為番茄的谷氧還蛋白基因。以該 片段為種子序列，採用電子克隆的方法，在番茄的EST資料庫中進行延伸拼接，根據延伸 的序列設計引物，上遊引物YGS2為5，-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3，，下遊引物YGAS為 5，-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3，。利用 RT-PCR 技術獲得到 1003bp 的片段，序列如 SEQ ID N0:1所示。序列分析表明該基因是一個新的谷氧還蛋白基因，具有完整的開放閱讀框， 編碼如SEQ ID NO :2所示292個胺基酸。該基因是第一個從番茄中克隆到的谷氧還蛋白基 因，將該基因命名為SlGRXl。將基因序列提交到Genbank進行BLAST比對表明SlGRXl是一 種新的谷氧還蛋白基因。由SlGRXl編碼的蛋白質的剩餘部分與任何已知序列無高度同源。實施例2S1GRX1基因的特性及功能分析和應用1. SlGRXl基因的組織表達特性分析

為了分析該基因在番茄體內的表達情況，分別用TRIzoI試劑提取番茄的葉片、 根、莖及花瓣中的總RNA，反轉錄成cDNA，利用quantitative real time RT-PCR分析 SlGRXl在番茄體內不同組織的表達情況，引物5，-ATGCGAGCATCGTTGTTGC-3，/5，-TCTATCTG GCTCCTCAACCACAC-3，用來擴增目標 SlGRXl 基因；引物 5，-CACGAGGTATAATCTAGGGTTTG-3，/ 5，-ATTTTGTCAGGGTTGTATCCTAC-3，用來擴增番茄的內參基因EF-1-α。分析結果表明，在檢 測的組織中，均檢測到了該基因的表達，其中葉片中的表達量最高，根中的表達量最低(見 圖1).2. SlGRXl蛋白的亞細胞定位將SlGRXl基因構建到植物表達載體PCHF3並融合到GFP的C端，將該質粒轉化到 農桿菌菌株EHA105中。用PCR技術篩選陽性克隆，將陽性的農桿菌活化至0D_為0. 2-0. 8， 浸潤4葉期的本氏菸葉片，48小時後在共聚焦顯微鏡下觀察GFP的表達情況。結果表明，空 載體中的GFP蛋白多在細胞質和細胞核的周圍，並沒有進到細胞核內，而GFP:S1GRX1的融 合蛋白則分布在細胞質和細胞核中，因此可以斷定SlGRXl蛋白能定位在植物的細胞核和 細胞質中(見圖2)。3. SlGRXl基因的功能分析及應用利用中國番茄黃花曲葉病毒即TYLCCNV的衛星DNAmii沉默載體及其輔助病毒 TYLCCNV在番茄中沉默了 SlGRXl基因，在番茄中沉默了 SlGRXl基因，用接種空載體的番茄 作為對照，對沉默的植株及對照進行抗逆性分析，包括其對氧化、乾旱及鹽鹼的抗性測定。 採用葉盤法檢測番茄沉默SlGRXl基因後對氧化脅迫的抗性，將SlGRXl基因沉默的植株及 對照的葉盤剪下，放在添加20mM的H2O2的MS培養基中，5天後觀察SlGRXl基因沉默的植 株與對照的差異，檢測結果表明=SlGRXl基因沉默的番茄葉綠素降解的更快，葉盤很快由 綠色變成黃色，而對照葉盤表現出更強的保持葉綠素的能力(見圖3A)，相對葉綠素含量測 定表明，SlGRXl基因沉默的植株的葉綠素明顯低於對照處理(見圖3B)，表明SlGRXl基因 對於植物抗氧化脅迫是必須的。乾旱處理將SlGRXl基因沉默的植株及對照植株澆透水後停止澆水進行乾旱處 理，乾旱6天後SlGRXl基因沉默的植株葉片表現出萎蔫症狀，而對照植株仍然正常生長 (見圖4A)，植物相對含水量(RWC)測定表明SlGRXl基因沉默的植株明顯低於對照植株(見 圖4B)。這些分析表明SlGRXl基因對植物的抗旱反應有重要的調控作用。高鹽脅迫是在番茄SlGRXl基因沉默後，用400mM的NaCl澆灌SlGRXl基因沉默的番茄及對照植株，每3天一次，在脅迫處理的第10天，SlGRXl基因沉默的植株葉片開始萎 蔫變黃，植株停止生長，表現出典型的鹽脅迫症狀，對照植株在10天後依然正常生長，葉片 表現為綠色(見圖5A)。鹽脅迫改變了植物葉片的葉綠素含量，經鹽處理後SlGRXl基因沉 默的植株葉片的葉綠素含量明顯低於對照(見圖5B)。這些結果表明，SlGRXl基因對於植 物的抗鹽脅迫是必須的，在抗鹽過程中起重要的調控作用。為了進一步分析SlGRXl基因的功能以及在植物基因工程中的應用，我們將該基 因轉化到擬南芥中，分析異源表達該基因是否能提高其他植物的抗氧化、乾旱及鹽鹼的能 力。轉基因的和對照擬南芥種子用雙蒸水浸泡30分鐘後用95%乙醇浸泡5分鐘，再用20% 次氯酸鈉漂白7分鐘，最後用雙蒸水洗滌5次。種子於4°C春化處理48小時後放到25度培 養箱中發芽培養。培養7天等擬南芥全部發芽後將發芽的苗轉移到帶有抗性的培養基中進 行根的生長脅迫實驗，結果見圖6，在正常的情況下，轉基因的擬南芥和對照的根長的並無 明顯差異，在脅迫條件下，轉基因擬南芥的根長明顯高於對照擬南芥，說明外源SlGRXl基 因的表達能夠增強擬南芥對氧化、乾旱及鹽鹼的抗性。

由這些結果表明，我們克隆的番茄SlGRXl基因具有很高的應用價值。我們可以通 過利用該基因對其他作物如擬南芥進行轉基因改造，如通過外源導入過表達SlGRXl基因 來提高植物對氧化、乾旱及鹽鹼的能力，從而增強作物對逆境的抗性，提高作物的產量與品 質。
權利要求
一種植物谷氧還蛋白基因SlGRX1，其特徵在於具有如SEQ ID NO1所示1003個鹼基DNA序列，編碼具有抗氧化、乾旱及鹽鹼能力的CGFS類的谷氧還蛋白。
2.一種如權利要求1所述植物谷氧還蛋白基因S1GRX1的克隆方法，其特徵在於包括下 列步驟1)根據擬南芥和水稻的CGFS類谷氧還蛋白基因，對其進行多序列比對，根據保守的同 源序列設計了 一對簡併引物，上遊引物T1為5 』 -SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3 』，下遊弓|物 T2 為 5 』 -ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3 』，其中，W 代表 T 或者 A，S 代表 G 或者 C，M 代表 A 或 者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者C，R代 表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T ；2)用上述引物經RT-PCR擴增基因片段，經測序後與NCBI等網上資料庫進行同源性比 對，證明得到的片段為為番茄的谷氧還蛋白基因的片段；3)以上述擴增的基因片段為種子序列，採用電子克隆的方法，在番茄的 EST資料庫中進行電子延伸拼接，根據延伸的序列設計引物，上遊引物YGS2為 5，-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3，，下遊引物 YGAS 為 5，-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3，，利 用RT-PCR克隆獲得到1003bp的基因片段，將該片段克隆到PGEM-T easy載體上測序，得到 的基因命名為S1GRX1。
3.一種番茄CGFS類蛋白，其特徵在於，具有權利要求1所述植物谷氧還蛋白基因 S1GRX1編碼的如SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列，或者與其胺基酸序列至少60%同源性。
4.一種如權利要求1所述植物谷氧還蛋白基因S1GRX1的用途，其特徵在於用於經轉基 因或雜交育種改良植物的抗氧化、乾旱及鹽鹼的能力。
全文摘要
本發明公開了一種番茄谷氧還蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途。SlGRX1基因是從番茄中分離到的第一個谷氧還蛋白基因，由1003個鹼基組成，編碼一個受乾旱、高鹽等環境脅迫誘導的CGFS類谷氧還蛋白，該基因在番茄的根、莖、葉片和花瓣中均表達，參與植物的抗非生物脅迫反應。在番茄中沉默該基因番茄則對乾旱、高鹽以及氧化脅迫更為敏感，而在擬南芥中超量表達該基因則能提高轉基因擬南芥對乾旱、高鹽以及氧化脅迫的抗性。故本發明提供的基因可以提高植物對乾旱、高鹽以及氧化脅迫的抗性，具有很強的理論研究和應用價值。
文檔編號A01H5/00GK101845443SQ20101014854
公開日2010年9月29日 申請日期2010年4月16日 優先權日2010年4月16日
發明者吳建祥, 周雪平, 郭玉雙 申請人:浙江大學