由南美水蛭中提取和純化抗凝血成分的製作方法

2023-12-05 18:23:06 1

專利名稱：由南美水蛭中提取和純化抗凝血成分的製作方法
技術領域：
本發明是關於具有抑制凝血因子Xa活性的蛋白質以及用色譜分離技術從南美水蛭(Haementeriaghilianii)的唾液或唾液腺中分離它的方法。
在急性深部靜脈血栓形成、肺栓塞、肢體急性動脈栓塞、心肌梗死及瀰漫性血管內凝血的治療中，抗凝血劑是有效的治療藥物。一般認為，預防性服用抗凝血劑能防止風溼性心臟病或動脈硬化性心臟病患者栓塞復發，並可防止外科某些血栓栓塞性合併症。在冠狀動脈和腦血管疾病的治療中，應用抗凝血劑也被認為是必需的。動脈栓塞，特別是供應心肌和腦的動脈栓塞，是死亡的主要原因。
有效的血液凝固取決於多種酶和輔因子參與，並由二條獨立的途徑，即內源性凝血途徑和外源性凝血途徑進行。在內源性凝血途徑中，所有凝血因子都存在於循環血液中，但由此途徑引起的血凝固一旦開始需要幾分鐘時間才能完成。而在外源性凝血途徑中，某些脂蛋白，例如凝血因子Ⅲ，通常並不存在於循環血液中，而是由受損細胞釋放，血凝固可在數秒鐘內開始。這兩條凝血途徑都集中在血凝固過程的某一點上，其中，凝血因子Xa與凝血因子Ⅴ和鈣離子形成凝血酶原激活物，後者能催化凝血酶原轉化為凝血酶。因此，在二條凝血途徑中凝血因子Xa都起著至關重要的作用，不管原因任何，因子Xa受抑制便會減弱凝血作用。雖然因子Xa的若干抑制劑是已知的，但這類抑制劑或屬於毒性很大的氯酮類，或屬於絲氨酸蛋白酶的非特異性抑制劑。因此，一種特異性的和無毒的因子Xa抑制劑具有重要的治療價值。
自古以來，水蛭一直用於醫學。早在十九世紀，水蛭的醫學應用導致醫用水蛭(Hirudomedicinalis)幾乎滅絕，並促使俄國徵收出口限額稅。近年來，對水蛭的分泌物進行了較詳細的科學研究，並且發現它含有多種具有廣譜生物化學和藥理學活性的生物學產物，如抗凝血劑、抗轉移劑、麻醉劑、抗生素和血管擴張劑。例如，從醫用水蛭的唾液腺分離出的水蛭素是已知最具有特異性的作用最強的凝血酶抑制劑。此外，從南美水蛭(H.ghilianii)的唾液腺分離得到的水蛭素，據報告是一種高分子量的纖維蛋白(原)溶解酶。據報告，它是這種水蛭的抗凝血成分。這種酶的作用是使纖維蛋白原和纖維蛋白降解，而不是激活宿主的纖維蛋白溶解系統或抑制血凝固系統。
申請人已從南美水蛭(H.ghiliauii)的唾液和唾液腺組織的提取物中分離並鑑定一種蛋白質，它是凝血因子Xa的特異性抑制劑，並且它是有效的血凝固抑制劑。
這種來源於南美水蛭(H.ghiliauii)唾液腺並從其中分離得到的具有抑制凝血因子Xa活性的蛋白質，是一種有用的抗凝血劑。這種蛋白質通過以下方法分離純化先將南美水蛭(H.ghiliauii)的唾液或唾液腺提取物用陰離子交換樹脂進行色譜分離並用鹽濃度梯度遞增的方法進行洗脫，再將具有強的抑制凝血因子Xa活性和抗凝血活性的那些洗脫部分進行反向高壓液相色譜(HPLC)分離，以進一步純化具有抑制凝血因子Xa活性的這種蛋白質。
本發明所用的術語「唾液」，不僅包括唾液(或唾液分泌物)，而且也包括用水蛭任何部分尤其是唾液腺以及整個水蛭所製備的組織勻漿。當然，「唾液」這一術語也包括唾液的分離物，只要這種分離物或組織勻漿含有本發明所闡述的有抑制凝血因子Xa活性的蛋白質。在其他種水蛭，如藥用水蛭(H.officinalis)的唾液中也可以發現在活性方面類似於本發明的蛋白質。
本發明的具有抑制凝血因子Xa活性的蛋白質被認為是由幾種與胺基酸排列順序有關的蛋白質所組成，其中至少有二種蛋白質主要與抑制凝血因子Xa活性有關。本發明的目的是希望得到所有的能抑制因子Xa活性的，半數抑制濃度(Ic50)至少為1000nm的蛋白質/肽，它們可以是單一的成分，或為混合物，如用本發明的方法從南美水蛭(H.ghiliauii)的唾液中分離出來的混合物。本申請的目的尤其是，本發明的蛋白質還包括諸如用順序合成和區段合成方法或用基因克隆和基因表達方法獲得該類物質。
雖然這些肽的全部胺基酸排列順序還尚未不清楚，但某些性質業已確定。組成本發明蛋白質的肽其分子量約為18000道爾頓，並且糖基化程度不高。儘管這些肽可能含一些糖基，但申請人發現，用SDSPAGE技術測得的分子量並不明顯地隨聚丙烯醯胺凝膠濃度的變化而改變，這表明肽分子上缺乏糖基。申請人還發現，胺基酸分析表明每種肽的胺基酸組成大致如下丙氨基殘基6個，甲硫氨酸殘基5個，賴氨酸殘基12-24個，精氨酸殘基18-21個，脯氨酸殘基16-17個，此外還含少量的芳香族胺基酸殘基，例如苯丙氨酸殘基4個，酪氨酸殘基6個。更精確的胺基酸組成資料，如半胱氨酸(或胱氨酸)和色氨酸殘基數，有待得到更大數量的肽和進行胺基酸排列順序分析。
本申請說明書採用的胺基酸通用的縮寫如下Ala(或A)-丙氨酸Arg(或R)-精氨酸Asx-天冬醯胺和/或天冬氨酸Gly(或G)-甘氨酸Glx-穀氨酸和/穀氨醯胺His(或H)-組氨酸Leu(或L)-亮氨酸Met(或M)-甲硫氨酸Phe(或F)-苯丙氨酸Pro(或P)-脯氨酸Ser(或S)-絲氨酸Thr(或T)-蘇氨酸Tyr(或Y)-酪氨酸Val(或V)-纈氨酸和其他許多蛋白質或肽一樣，本發明的具有抑制因子Xa活性的蛋白質也可以與各種無毒的有機酸或無機酸作用形成藥學上可接受的鹽。能形成適當鹽的無機酸的例子有鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和酸式金屬鹽(如磷酸氫二鈉，硫酸氫鉀)。能形成適當鹽的有機酸的例子有一元羧酸、二元羧酸和三元羧酸。作為這類酸的實例有乙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧基苯甲酸以及磺酸(如甲磺酸和2-羥基乙磺酸)。羧基末端胺基酸的鹽包括與任何適當的無機鹼或有機鹼所形成的無毒的羧酸鹽。舉例來說，這些鹽包括與鹼金屬(如鈉或鉀);鹼土金屬(如鈣和鎂);包括鋁在內的ⅢA族輕金屬;有機伯胺、仲胺和叔胺，例如三烷基胺(如三乙胺)、普魯卡因、二苄胺、1-乙烯胺(1-ethenamine)、N，N′-二苄基乙二胺、二氫樅酸胺、N-(低級)烷基哌啶以及其他適當的胺所形成的鹽。
能抑制因子Xa活性的本發明蛋白質的抗凝血劑量取決於病人狀況和需治療的血栓形成嚴重程度，其劑量範圍為0.2-250mg/kg體重/天。一個具體病人的適當劑量是容易確定的。較可取的給藥方法是每天1-4次劑量，每次劑量給予活性成分5-100mg。用於抑制因子Xa以阻止血液凝固，或抑制介質(如貯藏的血液)中因子Xa所需要的本發明蛋白質的濃度能容易地由熟悉本專業的人員確定。
抗凝血劑治療的適應症是治療和預防各種血栓形成，特別是冠狀動脈和腦血管疾病。在這一領域有經驗的人員容易發現需要抗凝血劑治療的各種情況。這裡所用的術語「病體」是指哺乳動物，如包括人在內的靈長類、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大鼠和小鼠。抑制凝血因子Xa不僅可用於有血栓形成的個體的抗凝血劑治療，而且也可用於預防血液凝固，為防止貯藏的全血凝固，以及用於防止供檢驗或貯藏的其他生物樣品的血凝固。因此，可以將本發明具有抑制因子Xa活性的蛋白質加到(或使其與)含有或懷疑含有因子Xa並希望防止血液凝固的任何介質中(接觸)。
雖然本發明具有抑制因子Xa活性的蛋白質口服後通過腸道仍保留活性，但申請人還是推薦採用非口服(例如皮下、靜脈內、肌內或腹腔內)給藥方法，或採用長效注射液製劑或植入片製劑的給藥方法。
本發明具有抑制因子Xa活性的蛋白質，其非腸胃道途徑給藥是將該蛋白質溶於或混懸於生理上可接受的稀釋劑中，然後與藥用載體(如水或油等無菌液體)一起製備注射劑，可以加或不加表面活性劑和其他藥學上可接受的輔助劑。能用於該類製劑的油有石油產品、動物油、植物油以及合成來源的油，例如花生油、豆油和礦物油。總的來說，水、生理鹽水、葡萄糖和有關的糖溶液、乙醇和乙二醇(如丙二醇或聚乙二醇)是優選的液體載體，尤其適於作注射溶液。
本發明具有抑制因子Xa活性的蛋白質可以按長效注射液製劑或植入片製劑的形式給藥，它們可以按能使活性成分延緩釋放的方式配製。本發明的活性成分可壓製成小丸或小圓柱體，並以長效注射液或植入片製劑的形式注入皮下或肌內。植入片劑可以使用惰性材料，如生物降解的多聚物或合成的聚矽氧烷，例如矽橡膠、矽氧橡膠、或由DOW-Corning公司生產的其他多聚物。
本發明的蛋白質是從水蛭的唾液中製得的。用於製備並純化的本發明蛋白質，其唾液腺提取物(它可以由南美水蛭(H.ghilianii)的前或後唾液腺或由前後二個唾液腺得到)可用幾種方法得到，例如手術摘除唾液腺並製成勻漿，用硫酸銨溶液或其他的鹽類(如氯化鈉)或緩衝液，或用丙酮提取組織勻漿，然後濃縮提取物，或使提取物脫水，也可將組織勻漿進行超速離心。然後，將獲得的唾液腺粗提物進行常規色譜分離，以分離出有Fxa和抗凝血活性的那部分。申請人採用的是屬於陰離子交換樹脂的DEAE纖維素色譜和肝素-瓊脂糖樹脂色譜，用氯化鈉作漸增性線性梯度洗脫。當然，上述的二種樹脂也可以用其他類型的樹脂代替，並可按一般方法用其他鹽以不同的梯度或用有機溶劑或其混合液進行洗脫，並可改變色譜柱流速，以便分離出有抑制因子Xa和具有抗凝血活性的那部分。
所得純化的唾液腺提取物接著進行親和色譜分離，即將因子Xa(如牛因子Xa)結合到色譜樹脂上，如在親和色譜分離中通常使用的容易與因子Xa結合的化學基團的那些樹脂。申請人採用的是Affi-Gel-15樹脂，它是一種購自Bio-Red公司的含N-琥珀醯亞胺基酯的樹脂。將這種樹脂和因子Xa先與4-嗎啉代丙磺酸保溫，再與乙醇胺一起保溫，因子Xa就能結合到樹脂上。經過純化的唾液腺提取物用這種樹脂進行色譜分離，用含有活性部位可逆性絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲脒的4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)進行洗脫，收集具有抗凝血和醯胺解作用的那部分洗脫液。對於熟悉該項技術的人來說，有關親和色譜技術的各種常規條件的改變將是容易理解的。
然後進一步純化得到的具有抑制因子Xa活性的蛋白質粗製品。這種純化可以用反相色譜的常規方法完成，反相色譜的固定相為非極性的，洗脫相為極性的。固定相一般是與玻璃之類的惰性表面化學結合的烴，洗脫相是甲醇水溶液、乙腈或丙醇。在疏水性相互作用色譜中，固定相是非極性的，洗脫相是極性的(如水或或水緩衝液)。申請人採用C-18型樹脂，即在這種樹脂中，與固相樹脂結合的烴實質上是含18碳的烴(如Aquapore RP-300)。用含三氟乙酸的乙腈水溶液洗脫C18樹脂。但是，其他適用的色譜柱還可以包括C3、C4、C6和C8等。
實例本發明可以用下面的非限定的例子加以說明。
例1從南美水蛭(H.Ghillianii)唾液提取物中製備抑制Fxa的物質及該物質的特性血凝固試驗、生色試驗和纖維蛋白(原)溶解試驗在800型血凝固電子自動計時器(MadicalLaboratorgAutomation公司)上，用廠家推薦的操作規程和試劑，按一步血凝固試驗測定凝血酶原時間並用分光光度監測。簡要地說，向含枸櫞酸鹽的100μl正常人血漿中加入不同量的溶於20mMHEPES，0.15M NaCl和2.5mM CaCl2緩衝液(pH7.4)中的水蛭唾液腺組織粗提物(ⅰ);或加入不同量的溶於柱洗脫緩衝液中的水蛭唾液腺提取物色譜分離部分(ⅱ);或加入不同量的從水蛭唾液腺中分離純化的Fxa抑制劑在20mMHEPES，0.15M NaCl，2.5mM CaCl2緩衝液(pH7.4)中的溶液(ⅲ)。加入200μl含11.6mM CaCl2的促凝血酶原激酶試劑(DADE
)後測定凝固時間。
Fxa和凝血酶醯胺解活性的生色試驗分別用甲酯基-D-環己基甘氨醯-甘氨醯-精氨酸-P-硝基醯替苯胺乙酸鹽和H-D-六氫酪氨醯-L-丙氨醯-L-精氨酸-P-硝基醯替苯胺乙酸鹽，在96孔微量滴定板(Accurate Chemical and Scientific公司，Westbury，NY)上進行。在這些試驗中，將25μl含0.15-16ng酶的試驗緩衝液(由20mM HEPS，0.15M NaCl組成，pH7.4)加到25μl試驗緩衝液中，再加50μl適當的抑制劑樣品。將溶液於室溫下保溫10分鐘，然後加入100μl終濃度為2.5×10-4M的色原試劑引發反應，用EL309型微量板自動讀數器(BIO-TEK儀器公司)在405nm處進行分光光度測定，每分鐘記錄一次在有效劑和無抑制存在條件下反映醯胺解活性的P-硝基醯替苯胺的吸光度。
按Knight等(Thromb.Haemostas(Stuttgart)46，593-596(1981)報告的方法製備125Ⅰ標記的人纖維蛋白原。在一塑料培養管中順序加入5ml含5mg纖維蛋白原的緩衝液(pH7.9，由50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.025M枸櫞酸鈉組成);500μci Na125Ⅰ(New England Nuclear，Boston，MA)和5μl0.045%NaⅠ載體，混合，置冰浴上冷卻。為了引發反應，將此混合物移入一隻用100μg碘原包裹的冷卻試管中，在冰浴中輕輕攪動1小時。為了中止放射性碘化反應，將此蛋白質溶液傾入一隻塑料培養管中，以便將碘原與反應物分離。然後在此蛋白質溶液中加入5mg牛血清白蛋白(BSA)，再將其加到用0.05M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH7.9緩衝液平衡過的0.5×12ml BioGel p-2色譜柱上，分部收集，以便將殘留的游離125Ⅰ和125Ⅰ標記的纖維蛋白原分開。比放射活性為1.9×10dpm/mg。
纖維蛋白原溶解試驗是基於色譜分離部分中的水蛭素(S.M.Malinconico等;J.Lab.Clin.Med.103，44-58(1984)將125.Ⅰ標記的纖維蛋白原降解為三氟乙酸可溶的125Ⅰ標記肽的能力。在本試驗中，100μlDEAE-5PW色譜洗脫分部與227μl含50μg125Ⅰ標記纖維蛋白原的50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH7.9緩衝液保溫;將樣品調節為10mM的CaCl2溶液，然後於37℃保溫過夜。順序加入100μl BSA(3mg/ml)保溫緩衝液和427μl冰冷卻的20%三氯乙酸(TCA)，將內容物置冰浴上2小時，離心並用γ計數儀器測定沉澱物和上清液的放射活性。纖維蛋白原溶解活性用TCA可溶部分的計數值與TCA不可溶部分的計數值的比值(TCA溶解/TCA沉澱)表示。
製備唾液腺提取物將相當於50單位水蛭素(S.M.Malinconico等;J.Lab.Clin.Med，103，44-58(1984))活性(49單位/mg蛋白)的南美水蛭(H.ghilianii)的唾液腺用玻璃棒浸入容量為3ml的玻璃反應瓶(PierceChemical公司)中，瓶內含2ml20mMHEPES，pH7.8(提取緩衝液)。將此反應瓶置於冰浴上，內容物用微探針超聲破碎儀(BransonSonicPowerSupply公司)處理，超聲處理條件是，超聲破碎儀的負載循環為30%，功率級為3，一次超聲破碎30秒鐘，共4次。將此玻瓶以3750rpm速度離心5分鐘，收集上清液，並在Eppendorf型臺式離心機上以8500rpm速度再離心一次。第一次離心的沉澱部分重新混懸於2毫升提取緩衝液中，並重複以上操作，合併二次超聲破碎提取所得的上清液，並立即用於純化。
牛Fxa-Affi-Gel-15親和基質的製備用下法將牛Fxa偶聯到Affi-Gel-15樹脂上2ml含2mg純化酶的4-嗎啉代丙磺酸(MOPS)，pH7.5緩衝液(偶聯緩衝液)與2.5ml樹脂混合，於4℃保溫過夜。充分洗滌樹脂並重新混懸於3ml偶聯緩衝液中。然後加入0.3ml1M乙醇胺，pH8.0，混合，於4℃反應過夜，接著用含0.1%吐溫-20的0.05MHEPES，0.1MHaCl，pH7.5緩衝液充分洗滌。
Fxa抗凝血劑的純化將含4mg可溶性蛋白的唾液腺提取物置於4ml提取緩衝液中，加到用pH7.8的20mMHEPES緩衝液(緩衝液A)平衡過的DEAE-5PW(WaterAssociates公司產品)陰離子交換柱(0.46×7.5cm)上。然後蛋白質用氯化鈉溶液作線性梯度洗脫，範圍自100%緩衝液A(起始條件)到100%緩衝液B(含0.5M氯化鈉的緩衝液A)，洗脫全程為60分鐘，流速為1ml/分鐘。合併含抗血劑和抗Fxa活性的氯化鈉濃度為0.1-0.2M之間的幾部分洗脫液(見圖2)，並用緩衝液A稀釋到導電率為≤ResearchLaboratoriesLifeTechnologies公司產品)上作進一步純化。具有抗凝血劑活性的DEAE洗脫部分進一步在肝素-瓊脂糖色譜柱上純化，結果見圖3。用緩衝液A充分洗柱後再用線性梯度鹽溶液洗脫，梯度範圍為從100%緩衝液A到100%緩衝液B(緩衝液A+1MNaCl)，洗脫全程為75分鐘，流速為1ml/分鐘。在某些應用中，具有抗Fxa活性的蛋白質在牛Fxa-Affi-Gel-15親和色譜柱上分離回收(圖4)。在具有抗凝血劑活性的粗提物或色譜洗脫液中加入吐溫-20，使後者濃度為0.1%，然後在床體積為2ml的牛Fxa-Affi-Gel-15柱上作親和色譜分離。用含0.1%吐溫-20的0.05MHEPES，0.1MNaCl，pH7.5緩衝液充分洗柱後，用含0.1M苯甲脒的0.05MHEPES，0.1%吐溫20，pH7.5緩衝液洗脫蛋白。收集的洗脫液以1∶500稀釋度作凝固試驗和醯胺解試驗。色譜柱洗脫流速為4ml/小時。有抗凝血劑活性和醯胺解活性的蛋白組分再在2.1×30mmAquaporeRP-300，C-18反相色譜柱上，用AppliedBiosystems130型蛋白/肽分離系統，作最後一次分離。蛋白用乙腈作線性梯度洗脫，梯度範圍從100%緩衝液A(0.1%三氟乙酸水溶液)到100%緩衝液B(0.07%三氟乙酸/70%乙腈/29.93%水)，洗脫時間為40分鐘。含蛋白的各分部(見圖5)置於Savant快速真空系統乾燥過夜。將樣品的重新溶於0.1%三氟乙酸水溶液，分成若干份分別作SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析、氣相微量順序分析、胺基酸分析以及抗凝血和醯胺解活性檢測。
聚丙烯醯胺凝膠電泳分析將含3%堆積凝膠、丙烯醯胺濃度分別為20%和12%的聚丙烯醯胺凝膠板(8×8cm和1mm厚)置於MigttySmall電泳儀(HoeferScientific公司產品)中，進行電泳，恆電流為10mA/每塊凝膠板。凝膠含0.25MTris-HCl緩衝液(pH9.0)和0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)。在25mMTris-HCl，0.2M甘氨酸，0.1%SDS，pH8.4的電泳緩衝液中進行電泳。將乾燥樣品溶於35μl含10mMTris-HC(pH6.8)，1%SDS，20%蔗糖，1mMEDTA，6M尿素，1%2-巰基乙醇和0.03%溴酚蘭的緩衝液中。電泳前將樣品於60℃加熱15分鐘。固定凝膠並按Merrill等(Anal.Biochem.105，361(1980))的方法用銀染色法檢測蛋白。從標準蛋白分子量的對數對電泳遷移率作圖，從該標準圖上用外推法求出被檢蛋白質的表觀分子量。蛋白標準品有磷醯化酶B(94，000)，牛血清白蛋白(67，000)，卵清蛋白(43，000)，碳酸酐酶(30，000)，α-胰凝乳蛋白酶原(25，700)，大豆胰蛋白酶抑制劑(20，000)，β乳球蛋白(18，400)，α-乳清蛋白(14，400)，溶菌酶(14，300)，牛胰蛋白酶抑制劑(6，200)和胰島素(3，000)。
順序分析在470A型蛋白-肽順序儀(AppliedBiosystems公司產品)上，用廠商提供的試劑、說明和操作規程將被檢蛋白作自動埃德曼降解。在與470A氣相順序儀直接聯機的120型PHT分析儀(AppliedBiosystems公司)上分析每一輪降解得到的胺基酸乙內醯苯硫脲衍生物。
胺基酸分析將用作水解管的自動加樣器微量瓶(Hewlettpackard)置於甲醇中作超聲處理，然後置於加熱爐中在500℃加熱4小時。將肽與含幾微升液化酚(MCB)的200μl恆沸點鹽酸(PierceChemical公司)共置於PicotagWorkstation(WatersAssociates公司)中，用氣相水解法在105℃使肽水解20小時。水解的樣品在快速真空濃縮器(Savant)中乾燥後溶於少量(一般15-30μl)0.1N鹽酸中，置於1090型HPLC(Hewlwttpackard公司)的自動加樣器中。用Hewlettpackard公司的具有高靈敏結構(螢光檢測)的胺基酸定量分析儀進行胺基酸分析。在柱前先用鄰苯二醛(OPA)使伯胺基酸衍生，再用9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)使仲胺基酸衍生，然後測定胺基酸。用廠商提供的色譜柱、試劑和說明，用反相HPLC分離衍生的胺基酸。該系統能準確地定量測定1-500微微摩爾的氨醯基量。


圖1表示南美水蛭(H.ghilianii)唾液腺粗提物抗-Fxa的活性。該活性成分能抑制人(見插圖)和牛的Fxa，但不能抑制人和牛凝血酶(數據未圖示)。
圖2表示4mg可溶性蛋白提取物在DEAE陰離子交換色譜柱上的色譜分離結果。在0.1-0.16M NaCl即30-35分部(管)之間，有抗凝血活性和抑制Fxa活性的蛋白同時洗脫下來(方圖A)。有纖維蛋白原溶解活性但沒有抗-Fxa活性的蛋白在NaCl濃度＞0.2M(方圖B)即37-44分部(管)之間(畫斜線部分)洗脫下來。這種蛋白能促進纖維蛋白凝塊溶解，使125Ⅰ標記的纖維蛋白原降解(圖2、方圖B)，SDS-PAGE電泳證明，並使純化纖維蛋白原的α、β和γ鏈降解(未圖示)。這一組分纖維蛋白原溶解作用是水蛭素引起的結果。而且，有抗-Fxa活性的諸組分未顯示纖維蛋白(原)溶解活性。根據圖1和圖2的結果，0.1-0.16M NaCl之間洗脫的這種抑制劑既不歸因於醫用水蛭的水蛭素(J.Dodt等;Biol Chem.Hoppe-Seyler 366，379-385(1985))，也不歸因於南美水蛭的水蛭素(南美水蛭的纖維蛋白(原)成分(S.M.Malinconico等;J.Lab.Clin.Med.103，44-58(1984))。如圖2所示，25μl有最高活性的分部可使凝血酶原時間延長約16秒，並能完全抑制醯胺解試驗中17ng的Fxa。由DEAE色譜分離提取物的幾種試驗結果可看出，抑制Fxa活性是其抗凝血活性的主要原因。
將從DEAE柱上分離出的有抗Fxa活性的各抗凝血分部合併，然後用肝素-瓊脂糖色譜分級分離(圖3)。在NaCl濃度為0.45-0.55M之間，有抗凝血活性和抗-Fxa醯胺解活性的蛋白同時洗脫下來。而且，顯示抗凝血活性峰的25μl分部使凝血酶原時間延長約17秒左右，並能完全抑制16ng純化的Fxa色原基質的水解。
抗凝血或抗Fxa活性的分部在Fxa-Affi-Gel-15柱上親和色譜分離的結果見圖4。如圖4所示，用0.1M苯甲脒-一種可逆性絲氨酸蛋白酶抑制劑-可將有抗凝血活性和抗-Fxa活性的組分從柱上一起洗脫下來。
該抑制劑用微孔反相HPLC進一步分離的結果用圖5表示。正如所見，跨越諸峰分布的抗凝血活性解析為二個主峰和四個次峰。再次色譜分離得到六個相互分開的峰，命名為P0-P5(見插圖)。這些峰中，P4和P5顯示較高的抗凝血活性和抗Fxa活性，而P1-P3顯示活性稍低。P0未能測出活性。
P0-P5各組分的SDS-PAGE(含20%丙烯醯胺)電泳證實，這些蛋白質的電泳遷移率相似，分子量約18，000(未圖示)。圖6顯示P5在微孔反相HPLC柱上的色譜分離圖。插圖顯示P5峰的12%SDS-PAGE(12%丙烯醯胺)電泳分離圖。此純組分的表觀分子量為18，000，即用12%和20%聚丙烯醯胺凝膠的兩個濃度電泳測得的該純化了的Fxa抑制劑的表觀分子量並無明顯差別，表明該成份並不是高度糖基化的。
圖7顯示P5濃度與抑制Fxa之間的劑量依賴關係，能產生半數最大抑制作用的P5濃度為60微微摩爾。
表1列出P0-P5各組分的胺基酸組成。就大多數殘基來說，除P4和P5含Asx和Glx稍高、含Lys和Pro明顯高之外，P1-P5的胺基酸含量是十分類似的。P0的Asx、Glx、Thr、Arg、Val、Met、Ile、Lys和Pro含量明顯不同於P、P1-P5。P1，P2和P3的活性降低可能與Lys和Pro含量明顯減少有關。除Lys和Pro外，胺基酸組成的總體相似性表明，P1-P5是胺基酸排列順序相關的蛋白質。
圖解釋圖1南美水蛭唾液腺粗提取物對Fxa的抑制作用。約11μg唾液腺提取物(可溶性蛋白)加到16ng純化的Fxa中。該樣品於室溫下保溫10分鐘，加入甲酯基-D-環己基甘氨醯-甘氨醯-精氨酸-P-硝基醯替苯胺乙酸鹽後測定醯胺解活性。在分光光度計405nm波長處，每分鐘記錄錄次，監測所生成的P-硝基醯替苯胺。上端曲線為牛Fxa和色原基質;底端曲線為牛Fxa、唾液腺提取物和色原基質;插圖中的上端曲線為人Fxa和色原基質底端曲線為人Fxa、唾液腺提取物和色原基質。南美水蛭唾液腺提取物並不能抑制牛和人凝血酶水解H-D-六氫酪氨醯-L-丙氨醯-P-硝基醯替苯胺乙酸鹽(未圖示)。
圖2唾液腺粗提物(4mg可溶性蛋白)在0.46×7.5cmDEAE陰離子交換色譜柱上的分級分離。蛋白用溶於20mMHEPES，pH7.8緩衝液中的氯化鈉線性梯度洗脫(詳見方法部分)，流速為1ml/分鐘，每分部(管)收集1ml。方圖A抗凝血活性(空心園圈)用一期凝固試驗測定，以凝血酶原時間的延長表示。應用色原基質甲酯基-D-環己基甘氨醯-甘氨醯-精氨酸-P-硝基醯替苯胺乙酸鹽，在405nm波長處監測抑制P-硝基醯替苯胺生成的情況來測定對Fxa的抑制作用(空心方塊)。方圖B此方圖表示在280nm波長處用吸光度監測南美水蛭蛋白質洗脫液各組分的分布。斜線區表示纖維蛋白原溶解活性。該活性部分與抗Fxa部分或主要的抗凝血活性部分不是同時洗脫下來的。
圖3部分純化的Fxa抑制劑用肝素-瓊脂糖色譜所作的分級分離。合併抗凝血活性和抗-Fxa活性同時洗脫下來的DEAE色譜各分部，並加到0.5×5cm肝素-瓊脂糖柱上。蛋白用溶於20mMHEPES，pH7.8緩衝液中的NaCl線性梯度洗脫。流速為1ml/分鐘，各分部(管)收集1ml。抗凝血活性(空心園圈)用一期凝固試驗測定，以凝血酶原時間延長表示。應用色原基質甲酯基-D-環己基甘氨醯-甘氨醯-精氨酸-P-硝基醯替苯胺乙酸鹽，在405nm波長處監測抑制P-硝基醯替苯胺生成的情況來測定對Fxa的抑制作用(空心方塊)。
圖4Fxa抑制劑在牛Fxa-Affi-Gel-15柱上的親和色譜分級分離。蛋白用0.1M苯甲脒從柱上洗脫下來，流速為4ml/小時，各分部(管)收集1.2ml。收集到各分部洗脫液經1∶500稀釋後按前述方法分別測定抗凝血活性(空心園圈)和抗Fxa活性(實心圖)。
圖5用反相HPLC法純化南美水蛭抗-Fxa成分。同時洗脫下來的抗凝血活性和抗-Fxa活性最高的分部在2.1×30mm的Aquapore RP-300柱上，用微孔反相HPLC色譜進一步作分級分離。陰影區域表示抗凝血活性，它跨越諸峰分布。插圖表示首次反相色譜分離的純化蛋白在相同的柱上再次色譜分離結果。通過再次色譜分離，得到不重疊的相互分開的5個峰。P4和P5峰具有較高的Fxa抑制活性(深陰影);P1，P2和P3峰中也可檢測出這種活性(淺陰影)，P0峰中檢查不出這種活性(無陰影)。
圖6P峰的微孔反相HPLC色譜分離。在214nm波長處監測吸光度，以此檢查南美水蛭蛋白P。插圖表示用微孔反相HPLC分離的P5的SDS-PAGE(12%丙烯醯胺)電泳圖譜。A行是分子量標準蛋白，B行是純化的P5。按Merrill等的方法，用銀染色法檢查蛋白。
圖7在給出的P5濃度下，以其抑制甲酯基-D-環己基甘氨醯-甘氨醯-精氨酸-P-硝基醯替苯胺乙酸鹽水解的能力，檢查純化P5蛋白與抑制Fxa之間的劑量依賴關係，在405mm處監測P-硝基醯替苯胺生成量。
表1 南美水蛭唾液腺經微孔反相HPLC分離得到的P0-P5各組分的胺基酸分析a
a以每摩爾蛋白的胺基酸殘基數表示，表中數值以每摩爾蛋白含6個丙氨酸殘基為標準。
權利要求
1.從水蛭(Haementeria ghilianii)的唾液中分離具有抑制因子Xa活性的蛋白質的方法，該方法包括a)在陰離子交換樹脂上使唾液進行遞增的鹽梯度洗脫，並且分離出具有抑制因子Xa活性的洗脫液；b)以肝素、因子Xa、或肝素和因子Xa兩者為基準，使由(a)分離出的部分進行親和色譜分離，並且分離出具有抗凝血和醯胺解活性的部分，以及c)使(b)的分離物進行反相高壓液相色譜分離，並且分離出具有抑制因子Xa活性的洗脫液。
2.權利要求1的方法，其中陰離子交換樹脂是二乙氨乙基纖維素。
3.權利要求1的方法，其中HPLC樹脂是含有樹脂的N-琥珀醯亞胺基酯。
4.用權利要求1～3中任何一項的方法從水蛭(Haementeriaghilianii)的唾液中分離出的具有抑制因子Xa活性的蛋白物質。
5.從水蛭(Haementeriaghilianii)的唾液中分離的具有抑制因子Xa活性的物質，該物質實質上是很純的，其特徵在於它在60pm濃度下具有半數最大抑制因子Xa的能力，並且該蛋白質的分子量為15，000-20，000道爾頓。
6.抑制因子Xa的方法，該方法包括使含有介質的因子Xa與權利要求4所述一定量的能有效抑制因子Xa活性的蛋白質接觸。
7.減少需要治療的病人血液凝固的方法，該方法包括給患者服用權利要求4所述具有抑制因子Xa活性的抗凝血有效量的蛋白質以及藥學上適用的載體。
全文摘要
申請人已經從水蛭(H.ghilianii)的唾液腺提取物中分離出抑制因子Xa的物質。應用二乙氨乙基纖維素和肝素-瓊脂糖色譜樹脂分離提取物，用遞增的鹽梯度進行洗脫。應用結合到Affi-Cel-15樹脂上的因子Xa，使提取物進行親和色譜分離，用含有苄脒的HEPES進行洗脫。反相色譜分離得到幾種具有抑制因子Xa活性的純肽或純蛋白質。本申請還公開了上述FXa抑制劑的性質和臨床上應用的組合物。
文檔編號C07K1/20GK1038649SQ89104078
公開日1990年1月10日 申請日期1989年6月15日 優先權日1988年6月16日
發明者卡丁·阿蘭·道格拉斯 申請人:默裡爾多藥物公司