一種動物防禦素保健製品及用途的製作方法

2023-12-05 06:58:36

技術領域：

本發明屬於動物保健用品，具體就是一種動物使用的防禦素保健製劑品。

背景技術：
：

防禦素(defensins)是生物體在抵禦病原微生物侵襲的防禦反應過程中產生的一種基本物質，分子量一般在4kd-10kd之間。防禦素的功能和應用情況如下：

(1)防禦素在機體的防禦系統中起重要作用

動物每天會直接接觸、食入、吸入大量的病原微生物而不患感染性疾病，這種抵抗外來致病微生物的能力主要是通過天然免疫的防禦機製得以實現的。防禦素是所有物種中天然防禦機制的重要組成部分，具有廣譜的抗菌活性，能殺滅革蘭氏陰性菌及陽性菌、真菌、寄生蟲、腫瘤細胞以及一些囊膜病毒如hiv、肝炎病毒等。防禦素通過趨化作用參與機體的獲得性免疫過程，實驗證明a-防禦素能夠吸引t細胞，有趨化作用，使之回流至炎症部位，從而在細胞免疫反應中發揮作用。防禦素的趨化作用有利於炎症效應細胞及效應分子向感染部位的回流，使機體能更有效的殺滅病原微生物。防禦素還具有提高動物免疫水平和特異性免疫抗體水平，調節動物的生長發育。從另一方面來講，防禦素也是獲得性免疫反應中效應細胞的重要活性介質，例如在b細胞能合成防禦素，對入侵的病源微生物起直接殺菌作用，所以防禦素是天然免疫與機體獲得性免疫的橋梁，在機體抵禦外來病原微生物的入侵中起著重要的作用。

(2)防禦素有重要的應用價值

防禦素對很多病原微生物有殺滅作用，包括一些抗生素耐藥株，它們能快速殺滅病原微生物而不易產生耐藥的突變株，還能促進動物生長，誘導動物的獲得性免疫。防禦素與一些傳統的抗生素、其他抗菌分子、溶菌酶有協同作用。因此更多的研究焦點是將其發展為新的抗微生物藥，應用在治療感染，食品防腐劑，飼料添加劑等領域。

技術實現要素：

為了充分發揮防禦素的抗病原微生物的作用，本發明的目的是提供一種利用鴕鳥皮膚提取製作的動物防禦素保健製品。

本發明的技術方案是以下述方式實現的：

一種動物防禦素保健製品：它是以液氮冷凍的生鮮鴕鳥皮膚為原料、經過下述製作步驟：

(1)將液氮冷凍的生鮮鴕鳥皮膚置5％～5.5％乙酸冰水混合物中混合、勻漿、水浴、離心、上清液浸提過夜；

(2)將步驟(1)中的沉澱物用等體積5％～5.5％乙酸混合，再次攪拌浸提過夜，離心取上清液：

(3)合併步驟(1)、(2)中的兩次上清液，調整ph值至6.0，離心，保留上清液；

(4)將上清液上樣於sephadexg-100凝膠柱，用乙酸鈉洗脫，經核酸蛋白檢測儀檢測後，自動收集器收集，通過瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脫液，真空冷凍乾燥保存，真空度-60kpa～-75kpa、冷凍乾燥溫度為-10℃～-15℃、時間為18h～20h，製得防禦素製品上述步驟1中液氮冷凍的生鮮鴕鳥皮膚重量與乙酸冰水混合物的體積比按1:10～15，上述步驟1中水浴的溫度為95℃～100℃滅活樣品中的其他微生物、時間為10min～12min，然後迅速冷卻至室溫；

上述步驟4中乙酸鈉水溶液濃度為0.20mol/l～0.25mol/l。

上述步驟中(1)：

所述的液氮冷凍的生鮮鴕鳥皮膚冷凍需先剪碎；所述的離心速度為4000r/min、時間為40min。

上述步聚4中：

所述的自動收集器收集，每4分鐘收集一管，每管1.6ml。

上述步聚4中：

所述的乙酸鈉水溶液濃度為0.2mol/l，恆流泵的速度為4滴/分，經核酸蛋白檢測儀檢測後有od值，收集值在0.3～0.6的收集管，意味著有蛋白。

上述防禦素製品在製備動物保健食品中的應用。

本發明人發現：低溫/室溫保存對防禦素空間結構影響較大，易失活。有抑菌作用的洗脫液經真空冷凍可有效保存其活

防禦素的活性檢測:

鴕鳥皮膚經乙酸浸提，sephadexg-100葡聚糖凝膠分離後，出現兩個峰，選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行體外抗菌活性試驗。結果表明：提取的抗菌肽對g+和g-都有抑菌作用，且抑菌作用的主要在第二峰，但皮膚抗菌肽對大腸桿菌的抑菌結果更明顯。1g鴕鳥皮膚經乙酸(1:10w/v)提取後，一般可得到12ml提取液。sephadexg-100每次分離2ml提取液，一般得到5ml有抑制細菌活性的洗脫液，經真空冷凍乾燥，可得到約5mg含有少量的乙酸鈉鹽成分及一些雜蛋白的蛋白成分，有效抑菌濃度為3.2-6.4mg/ml。

本發明的積極效果是：

本發明防禦素製品可調節動物免疫功能，包括促進中樞免疫功能，增強疫苗的免疫效果。防禦素上調雞免疫器官的免疫反應，法氏囊和胸腺是中樞免疫器官，是免疫細胞發生，分化，成熟的場所。脾臟是外周免疫器官捕獲和消化抗原。鴕鳥皮膚防禦素(1μg/ml)作為無害抗原促進中樞免疫器官的成熟。我們的實驗通過觀察組織學切片也沒有檢測到防禦素對細胞的損傷，也證明了在實驗中使用的鴕鳥皮膚防禦素濃度沒有發現毒性作用。可能有部分鴕鳥皮膚防禦素在消化道被蛋白酶降解，但是實驗結果證明口服途徑還是有效果。

附圖說明：

圖1為本發明的鴕鳥皮膚抗菌肽粗提物在sephadexg-100層析行為。

圖2為鴕鳥皮膚抗菌肽對抗原刺激的雛雞免疫器官淋巴細胞增殖的影響。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明：

實施例一

取液氮冷凍的新鮮鴕鳥皮膚，稱重，剪碎；按鴕鳥皮膚與乙酸冰水混合物的重量體積(w/v)比為1:10比例加入5％乙酸冰水混合物，手動勻漿器勻漿，100℃水浴10min，然後迅速冷卻，4000r/min離心30min去除沉澱。取上清液4℃浸提過夜，將沉澱物用等體積5％乙酸混合，再次攪拌浸提過夜，離心取上清液。合併兩次上清液，調整ph值至6.0，4000r/min離心30min，保留上清液。將上清液上樣於sephadexg-100凝膠柱，用0.2mol/l乙酸鈉溶液洗脫，恆流泵的速度為4滴/分，經核酸蛋白檢測儀檢測有od值，收集值在0.3的收集管，自動收集器收集，每4分鐘收集一管，每管1.6ml，通過瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脫液，真空冷凍乾燥保存。

低溫/室溫保存對防禦素空間結構影響較大，易失活。有抑菌作用的洗脫液經真空冷凍乾燥，真空度-60kpa、冷凍溫度-10℃、時間18h，可有效保存其活性。

實施例二

取液氮冷凍的新鮮鴕鳥皮膚，稱重，剪碎；按鴕鳥皮膚與乙酸冰水混合物的重量體積(w/v)比為1:10～15比例加入5.5％乙酸冰水混合物，手動勻漿器勻漿，100℃水浴10min，然後迅速冷卻，4500r/min離心40min去除沉澱。取上清液4℃浸提過夜，將沉澱物用等體積5.5％乙酸混合，再次攪拌浸提過夜，離心取上清液。合併兩次上清液，調整ph值至6.0，4500r/min離心40min，保留上清液。將上清液上樣於sephadexg-100凝膠柱，用0.2mol/l乙酸鈉水溶液洗脫，恆流泵的速度為4滴/分，經核酸蛋白檢測儀檢測有od值，收集值在0.3的收集管，自動收集器收集，每4分鐘收集一管，每管1.6ml，通過瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脫液，真空冷凍乾燥保存。

低溫/室溫保存對防禦素空間結構影響較大，易失活。有抑菌作用的洗脫液經真空冷凍乾燥，真空度-65kpa、冷凍溫度-12℃、時間19h，可有效保存其活性。

實施例三

取液氮冷凍的新鮮鴕鳥皮膚，稱重，剪碎；按鴕鳥皮膚與乙酸冰水混合物的重量體積(w/v)比為1:12比例加入5.2％乙酸冰水混合物，手動勻漿器勻漿，100℃水浴10min，然後迅速冷卻，4200r/min離心42min去除沉澱。取上清液4℃浸提過夜，將沉澱物用等體積5.2％乙酸混合，再次攪拌浸提過夜，離心取上清液。合併兩次上清液，調整ph值至6.0，4300r/min離心40min，保留上清液。將上清液上樣於sephadexg-100凝膠柱，用0.2mol/l乙酸鈉水溶液洗脫，恆流泵的速度為4滴/分，經核酸蛋白檢測儀檢測有od值，收集值在0.3的收集管，自動收集器收集，每4分鐘收集一管，每管1.6ml，通過瓊脂糖彌散方法檢測各收集管液體對大腸桿菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脫液，真空冷凍乾燥保存。

低溫/室溫保存對防禦素空間結構影響較大，易失活。有抑菌作用的洗脫液經真空冷凍乾燥，真空度-75kpa、冷凍溫度-15℃、時間20h，可有效保存其活性。

本發明防禦素制器的應用實例如下：

一、1ug/ml的防禦素可調節動物免疫功能，包括促進中樞免疫功能，增強疫苗的免疫效果如表1、表2。

表1鴕鳥皮膚防禦素對雛雞免疫器官指數和體重的影響

註：免疫器官指數＝免疫器官重量(mg)/雛雞體重(g)

表2雛雞免疫ibd疫苗後血清中ibdv抗體滴度的變化(490nmod)

ibd：雞傳染性法氏囊炎

ibdv：雞傳染性法氏囊炎病毒

從表1、表2中可以看出：為研究鴕鳥皮膚防禦素是否對雛雞的體重有影響，本研究在1、4、7、10、17日齡對雛雞的體重進行了記錄，結果見表1。由此結果可知，對照組和鴕鳥皮膚防禦素組雛雞的體重無明顯差別，統計學上沒有差異。為研究鴕鳥皮膚防禦素是否對雛雞的免疫器官指數有影響，本研究在1、4、7、10、17日齡對雛雞的免疫器官重量和體重進行了記錄，並計算免疫器官指數，結果見表1。由此結果可知，與對照組比較，鴕鳥皮膚防禦素提高了7～17日齡雛雞的胸腺指數，4～7日齡雛雞的法氏囊指數並且在4日齡差異顯著(p0.05)。

為研究鴕鳥皮膚防禦素與疫苗是否有協同作用，本研究對鴕鳥皮膚防禦素組和對照組雛雞常規滴鼻點眼接種ibdv疫苗，在疫苗免疫後選取一些時間點觀察兩組雛雞血清中ibdv抗體滴度的變化。結果見表2，由結果可見在實驗的觀察期間，即疫苗免疫後14～35d，鴕鳥皮膚防禦素組雛雞血清中ibdv抗體水平高於對照組，並且在第21d明顯高於對照組，且差異顯著(p<0.05)。

從圖1中可以看出：本發明防禦素製品對多種細菌病毒有明顯的抑制或殺滅作用，如對多殺性巴氏桿菌有殺滅作用，最低殺死濃度0.16mg/ml。從圖1中還可以看出：有抑菌作用的主要在第二峰，瓊脂糖彌散方法檢測洗脫液對巴氏桿菌的抑菌作用，主要集中在7～10管。

從圖2中可知：鴕鳥皮膚抗菌肽對抗原刺激的雛雞免疫器官淋巴細胞增殖的影響中可以看出：由於此防禦素在功能上具有免疫調節作用，可開發為綠色環保型動物保健劑。