一種分子伴侶TSPcpn47和編碼此分子伴侶的多核苷酸的製作方法

2023-12-10 02:23:11 1

一種分子伴侶TSPcpn47和編碼此分子伴侶的多核苷酸的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種分子伴侶TSPcpn47和編碼該分子伴侶的多核苷酸，該分子伴侶TSPcpn47來源於高溫棲熱菌的噬菌體TSP4，能起到穩定蛋白質結構的作用並防止蛋白質凝聚、變性，提高蛋白質的穩定性，其核苷酸序列可用於構建生產此分子伴侶的基因工程菌株。
【專利說明】—種分子伴侶TSPcpn47和編碼此分子伴侶的多核苷酸
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分子伴侶TSPcpn47和編碼此分子伴侶的多核苷酸，分子伴侶在生物體內起著穩定新生蛋白、輔助其他蛋白質正確摺疊，提高蛋白質的穩定性，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]分子伴侶是一類在進化上非常保守的蛋白質家族，它能非特異性結合不同結構、大小和功能的蛋白質並催化介導這些蛋白質形成特定的構象，在生物體內起著穩定新生蛋白、輔助其他蛋白質正確摺疊、組裝、轉運甚至降解的作用，在脅迫條件下，分子伴侶起到穩定蛋白質結構的作用並防止蛋白質凝聚、變性，還具有修復變性蛋白的功能，對蛋白質功能的發揮具有重要意義。
[0003]第一個分子伴侶----核質蛋白(nucleoplasmin)是Laskey等人於1978年在
非洲爪蟾卵的浸出液中發現的，他們通過研究組蛋白與DNA結合形成核小體的過程中，必須依靠一種酸性核蛋白(nucleoplasmin)的參與才能完成它們的裝配。體外試驗也表明，只有將組蛋白與過量的酸性核蛋白混合，才能令其與後加入的DNA組裝最終形成核小體結構，但形成的核小體中並沒有酸性核蛋白。當僅有DNA與組蛋白存在時，並不能自我組裝成核小體結構，而是形成沉澱。
[0004]迄今為止發現的大多數的分子伴侶都屬於熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)的範疇,大致可主要分為伴侶素家族(chaperonin, Cpn )、熱休克蛋白7 O家族(HSP 70 family)、熱休克蛋白9 O家族(HSP 90 family)以及熱休克 蛋白100家族等保守的蛋白家族，目前還沒有來源於棲熱菌噬菌體的分子伴侶的報導，分子伴侶因其可以提高蛋白質(酶)的穩定性而使其在工業上具有應用價值。

【發明內容】

[0005]本發明旨在提供一種分子伴侶TSPcpn47，該分子伴侶TSPcpn47來源於高溫棲熱菌的噬菌體TSP4，其胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0006]本發明的另一個目的是提供一種編碼分子伴侶TSPcpn47的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本發明的有益效果:
本發明獲得的棲熱菌噬菌體TSP4的分子伴侶TSPcpn47，能夠單獨的行使分子伴侶功能，即幫助變性的蛋白復性，並且防止其它蛋白在高溫、酸性等條件下變性，可利用於在高溫等環境下協助功能蛋白保持其活性，減少蛋白變性，對保護功能蛋白的生理活性具有重要作用，其核苷酸序列可以用於構建能催化形成以上產物的基因工程菌株。
【專利附圖】

【附圖說明】[0008]圖1是本發明分子伴侶TSPcpn47基因的克隆片段電泳示意圖；
圖2是本發明分子伴侶TSPcpn47基因保守結構域分析示意圖；
圖3是本發明分子伴侶TSPcpn47基因、pET_28a(+)的酶切示意圖，其中泳道I為分子伴侶TSPcpn47基因的酶切膠回收產物，泳道2為pET_28a(+)，泳道3為Marker ；
圖4是本發明分子伴侶TSPcpn47基因表達蛋白的SDS-PAGE分析檢測電泳圖，其大小為為29000道爾頓，其中泳道I為Protein Marker ;泳道2為Ro_pET28a破碎後的上清；泳道3Ro-pET28a-7S/7/7破碎後的上清；泳道4為Ro_pET28a破碎後的沉澱；泳道5為Ro-m2Sa-TSPcpn47破碎後的沉澱。
[0009]圖5是本發明分子伴侶TSPcpn47純化SDS-PAGE分析檢測電泳圖，其中泳道I 為 Protein Marker ;泳道 2 為 vEYI&ArTSPcpM/ Rosetta 破碎後的上清；泳道 3 為X>E\2Sa-TSPcpn47/ Rosetta破碎後的上清過His_trap柱；泳道4為IOmM咪唑洗脫液；泳道5為150mM咪唑洗脫液；泳道6為500mM咪唑洗脫液；泳道7為500mM咪唑洗脫液；
圖6是本發明蛋白含量標準曲線示意圖；
圖7是本發明磷酸鹽濃度標準曲線示意圖；
圖8是本發明溫度對分子伴侶TSPcpn47活性的影響；
圖9是本發明分子伴侶TSPcpn47對GFP螢光強度恢復的幫組作用；
圖10是本發明分子伴侶TSPcpn47對GFP熱穩定性的影響。
【具體實施方式】
[0010]下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的內容並不局限於此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規方法操作，所用試劑如無特殊說明的採用常規試劑或按常規方法配置的試劑。
[0011]實施例1:分子伴侶TSPcpn47基因的擴增(以棲熱菌噬菌體TSP4基因組DNA為模 板)
(1)TSP4噬菌體分子伴侶TSPcpn47基因擴增所用引物序列如下:
正向引物:5』 - CGGAATTCATGGCACTCTTATCTAAC -3』
反向引物:5』 - ACATCTCGAGCCATGAGGCCACCTCCT -3』
(2)擴增體系如下:
表1:擴增反應體系組分
【權利要求】
1.一種分子伴侶TSPcpn47，其特徵在於:其胺基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.編碼權利要求1所述分子伴侶TSPcpn47的多核苷酸，其特徵在於:其核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所 示。
【文檔編號】C07K14/005GK103435689SQ201310364132
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】林連兵, 巴頓, 薛寒, 魏雲林, 季秀玲, 張琦 申請人:昆明理工大學