用於通過酶促轉化製備西他列汀的中間體的方法

2023-12-01 07:15:26

專利名稱：用於通過酶促轉化製備西他列汀的中間體的方法
技術領域：
本發明涉及用於製備3-羥基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氫-[1，2，4]三唑並[4，3-a]吡嗪-7(8H)_基)-4-(2，4，5_三氟苯基)丁 _1_酮的酶促還原方法。特別地，本發明涉及用於製備(S)或(R)-3-羥基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氫-[I，2，4]三唑並[4,3-a]吡嗪-7 (8H)_基)-4-(2，4，5-三氟苯基)丁-1-酮的立體選擇性酶促還原方法。本發明提供了具有相關氧化還原酶活性的多肽的胺基酸序列。此外，本發明提供了編碼具有氧化還原酶活性之多肽的多核苷酸序列。本發明還公開了通過基於底物或基於酶之系統的輔因子再生系統從而在目標酶促還原過程中再生輔因子。
背景技術：
下式(I)的3-羥基-1-(3-(三氟甲基)-5，6_ 二氫-[1，2，4]三唑並[4,3-a]吡嗪-7 (8H)-基)-4- (2,4, 5-三氟苯基)丁 _1_ 酮，
權利要求
1.一種用於製備式(I)的化合物
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述合適的酶是氧化還原酶。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述合適的酶是酮還原酶。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述合適的酶是短鏈脫氫酶。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述合適的酶是醇脫氫酶。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述合適的酶是醛酮還原酶。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述合適的酶分離自酵母(saccharomyces)、紅酵母(rhodotorula)、畢赤酵母(pichia)和大腸桿菌(E.coli)。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述合適的酶分離自選自釀酒酵母(saccharomyces cervisiae)、深紅酵母(rhodotorula rubra)、甲醇畢赤酵母(pichiamethanolica)和大腸桿菌的物種。
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述合適的酶選自序列IdN0.1、序列Id N0.2、序列 Id N0.3、序列 Id N0.4、序列 Id N0.5、序列 Id N0.6、序列 Id N0.8、序列 IdN0.9、序列Id N0.10、序列Id N0.11、序列Id N0.12和序列Id N0.13所示的核苷酸序列。
10.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述酶具有選自序列IdN0.1、序列Id N0.2、序列 Id N0.3、序列 Id N0.4、序列 Id N0.5、序列 Id N0.6、序列 Id N0.8、序列 IdN0.9、序列Id N0.10、序列Id N0.11、序列Id N0.12和序列Id N0.13所示核苷酸序列的核苷酸序列或其變體，所述核苷酸序列或其變體被克隆於載體中並且隨後表達於合適的重組全細胞中。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述重組全細胞還共表達具有由氧化型NAD(P)再生輔因子之潛力的多肽。
12.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述全細胞選自:MTCC5642、MTCC5643、MTCC5644、MTCC5645、MTCC5646、MTCC5647、MTCC5648、MTCC5649、MTCC5650、MTCC5651、MTCC5652、MTCC5653、MTCC5654。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述全細胞包含表達載體，所述表達載體包含: a)至少一個控制所述載體在宿主細胞內複製和保持的區域； b)第一啟動子，其與編碼所述氧化還原酶的選自序列IdN0.1、序列Id N0.2、序列Id N0.3、序列 Id N0.4、序列 Id N0.5、序列 Id N0.6、序列 Id N0.8、序列 Id N0.9、序列 IdN0.10、序列Id N0.11、序列Id N0.12和序列Id N0.13所示核苷酸序列的核苷酸序列或其變體有效連接； c)第二啟動子，其與編碼具有再生輔因子潛力之多肽的序列idno7所示核苷酸序列有效連接； d)合適的抗生素標記。
14.一種用於製備式⑴的合適中間體
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述全細胞選自:MTCC5642、MTCC5643、MTCC5644、MTCC5645、MTCC5646、MTCC5647、MTCC5648、MTCC5649、MTCC5650、MTCC5651、MTCC5652、MTCC5653、MTCC5654。
16.根據權利要求1所述的方法，其中通過基於酶的再生系統連續再生輔因子，其中所述酶氧化合適的共底物以再生輔因子。
17.根據權利要求1或16所述的方法，其中輔因子再生中所使用的所述酶選自:葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、亞磷酸脫氫酶。
18.根據權利要求16或17所述的方法，其中輔因子再生中所使用的所述酶是序列IdN0.7或其變體所示葡萄糖脫氫酶。
19.根據權利要求1所述的方法，其中通過基於底物的輔因子再生系統連續再生輔因子，其中所述酶氧化合適的共底物以再生輔因子。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述酶選自:氧化還原酶、酮還原酶、短鏈脫氫酶、醇脫氫酶和醛酮還原酶。
21.根據權利要求19所述的方法，其中所述共底物是異丙醇。
22.根據權利要求1和14所述的方法，其中式(III)的濃度選自0.1%至30% w/Vo
23.根據權利要求1所述的方法，其中所述輔因子是NAD(P) H和NAD (P)。
24.根據權利要求2所述的方法，其中pH維持在5至9，優選7至8。
25.一種用於表達手性醇的載體，其包含: a.至少一個控制複製的區域； b.合適的啟動子，其與選自序列IdN0.1、序列Id N0.2、序列Id N0.3、序列Id N0.4、序列 Id N0.5、序列 Id N0.6、序列 Id N0.8、序列 Id N0.9、序列 Id N0.10、序列 Id N0.11、序列Id N0.12和序列Id N0.13所示的期望核苷酸序列或其變體有效連接； c.抗生素標記。
26.根據權利要求25所述的載體，其還包含序列IdN0.7的多核苷酸序列或其變體。
27.根據權利要求23所述的載體，其表達氧化還原酶，所述載體是pETllaZBG5.1.1、pETllaZBG6.4.l、pETllaZBG2.0.1.pETllaZBG25.1.l、pETllaZBG8.1.l、pETllaZBG13.1.1，pET27bZBG5.1.1、pET27bZBG2.0.1、pET27bZBG8.1.1、pET27bZBG2.0.9、pET27bZBG13.1.1、pET27bZBG2.0.8、pET27bZBG2.0.ll、pET27bZBG2.0.5、pET27bZBGl.1.22、pET27bZBGl.1.2、pET27bZBG2.0.4。
28.根據權利要求31所述的載體，其表達氧化還原酶，所述載體是pET27bZBG2.0.9。
29.根據權利要求23所述的載體，其表達葡萄糖脫氫酶，所述載體是pET27bZBG13.1.1。
30.根據權利要求23所述的載體，其共表達氧化還原酶和葡萄糖脫氫酶，所述載體是PZRC2G-2ZBG2.0.9C1。
31.下式的化合物
32.一種用於製備式(II)化合物的方法，其包括: (a)使式(Ib)的(S)-3-羥基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氫-[I，2，4]三唑並[4,3-a]吡嗪-7 (8H)-基)-4- (2,4, 5-三氟苯基)丁 +酮
全文摘要
本發明提供了用於製備成為外消旋形式(R/S)或其任意光學活性(S)或(R)形式或者任意所述形式之對映體過量混合物的3-羥基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氫-[1，2，4]三唑並[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2，4，5-三氟苯基)丁-1-酮(式I)的方法，其包括a)在合適條件和輔因子的存在下，使式(III)4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5，6-二氫[1，2，4]三唑並[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2，4，5-三氟苯基)丁-2-酮與合適的氧化還原酶或其合適變體反應；b)分離成為外消旋形式(R/S)或其任意光學活性(S)或(R)形式或者任意所述形式之對映體過量混合物的3-羥基-1-(3-(三氟甲基)-5，6-二氫-[1，2，4]三唑並[4，3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2，4，5-三氟苯基)丁-1-酮。
文檔編號C12P17/18GK103228658SQ201180042086
公開日2013年7月31日 申請日期2011年10月10日 優先權日2010年10月8日
發明者桑吉夫·庫馬爾·門迪拉塔, 比平·潘迪, 茹帕爾·喬希, 烏曼·特裡維迪, 馬揚克·G·達弗, 希曼舒·M·科塔裡, 巴溫·舒克拉 申請人:卡迪拉保健有限公司