對鞘翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌cry8G基因、蛋白及其應用的製作方法
2023-10-31 21:11:27 1
專利名稱：對鞘翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌cry8G基因、蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物防治技術領域，本發明涉及對鞘翅目害蟲高毒力的cry8G基因的核苷酸序列，涉及對鞘翅目害蟲高毒力的蛋白質的胺基酸序列，涉及，人工設計合成的可以在植物中表達的cry8G基因的核苷酸序列，涉及該人工設計的cry8G基因的核苷酸序列編碼的蛋白質胺基酸序列，涉及含有cry8G基因的重組菌株，涉及使用該基因構建表達載體，還涉及利用上述基因序列進行植物轉化的方法。
背景技術：
金龜子屬於鞘翅目金龜總科(Scarabaeidae)，其幼蟲(俗稱蠐螬，本發明以下也簡稱為「蠐螬」)是一類重要的世界性分布地下害蟲，可危害糧食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、菸草、牧草、花卉、草坪草、果樹等多種植物。大量調查表明，蠐螬在地下害蟲中的危害居首位，其中主要以鰓金龜科和麗金龜科幼蟲為主，佔總地下害蟲量的70-80％以上。據統計每年全國蠐螬發生面積約1億畝，嚴重年份曾達3億2千萬畝，產量損失高達20％以上，有些地塊甚至絕產。近年發生面積最大、發生量最多的為黃淮海地區，主要危害糧食、油料等作物；其它地區的危害情況也很嚴重，如危害甘蔗的蠐螬，在廣東、廣西、雲南、四川、福建等地普遍發生；在西藏、青海、甘肅、新疆等西部地區，蠐螬的發生也很嚴重(魏鴻鈞等，《中國地下害蟲》，上海上海科學技術出版社，1989，1-41；王永祥等，「冀中平原區蠐螬種類及綜合防治技術」，《河北師範大學學報》(自然科學版)，1998，22(2)268-270)。以在我國油料作物中種植面積僅次於油菜居第二位的花生為例。我國的花生產量佔世界花生總產量的35％左右，居世界首位，年出口收入達207億美元，2001年全國花生面積(500萬公頃)和總產(1450萬噸)均達到歷史最高水平。但蠐螬對花生的危害十分嚴重。為控制蠐螬的危害，一般採用農業、化學、物理等綜合防治策略，這雖有一定成效，卻難以達到持續控制的效果。因此，尋找新的有效防治方法，已成為當務之急。
在獲得對蠐螬高毒力Bt基因的基礎上，培育殺蠐螬的轉基因植物是一條值得探索的新的防治途徑。
蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌。它在形成芽孢的同時，能產生蛋白性質的伴孢晶體(parasporal crystal)，對鱗翅目(Lepidoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目 (Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、蟎類和原生動物具有特異性的殺蟲活性(Schnepf，E.N.et al，Microbiol.And MolecularBiology Review，1998，623775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又稱δ-內毒素(delta-endotoxin)，對人畜無害，不汙染環境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應用。
目前人們已經克隆了近400種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬157種模式基因。近年國際上cry8類基因的研究動向引人矚目。研究表明，這類基因對金龜子科、象甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有殺蟲作用。1992年，Ohba等在世界上首次從Bt菌株中篩選出對金龜子幼蟲具有特異殺蟲活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba，M.et al.，A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a highlarvicidal activity specific for scarabaeid beetles，Letters in Applied Microbiology，1992.1454-57)，1994年Sato等從中克隆出一種新的殺蟲基因cry8C(Sato，R.et al，Cloning，heterologous expression，and localization of a novel crystal protein genefrom Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic to scarabaeidinsects，Curr.Microbiol.1994.2815-19.4)。目前已發現11種cry8類基因，編碼的蛋白由1160-1210個胺基酸組成，分子量在128-137kDa之間。詳細的信息見表1(Asano，S.，Yamanaka，S.and Takeuchi，K.，Protein haying insecticidal activity，DNA encoding theprotein，and controlling agent and controlling method of noxious organisms，2002，JP 2002045186-A and JP 2002045186-A/2))。其中美國Mycogen公司分離的Cry8Aal和Cry8Bal對金龜科的多種害蟲具有明顯的殺蟲活性(Tracy E.Michaels，et al.，Bacillusthuringiensis toxins active against scarab pests，1994，USP5554534)。美國從Bt菌株中分離了兩種基因cry8Bbl和cry8Bcl基因，發現對西方玉米根葉甲(Western cornrootworm)具有顯著的殺蟲效果並已用於轉基因抗蟲玉米的開發(Abad，Andre，R.，DuckNicholas，B.，Feng，Xiang，Flannagan Ronald，D.，Kahn，Theodore，W.，Sims，Lynne，E.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity against coleopterans，2002，WO 02/34774 A2)。在我國，河北省農業科學院植物保護研究所和河北農業大學近年來先後篩選獲得多株對黃褐麗金龜(Anomala exoleta)和銅綠麗金龜(A.corpulenta)幼蟲具有特異殺蟲活性的Bt菌株，室內生測死亡率均達100％(馮書亮等，「一株對金龜子類幼蟲具有殺蟲活性的蘇雲金桿菌新分離株」，《中國生物防治》，2000，16(2)74-78)。
表1蘇雲金芽孢桿菌Cry8類殺蟲晶體蛋白
發明內容
本發明提供一種對大黑鰓金龜等鞘翅目重要害蟲具有高毒力的蘇雲金芽孢桿菌cry8G模式基因序列，以應用於轉化微生物和植物，使之表現出對相關害蟲的毒性，並克服、延緩害蟲對工程菌和轉基因植物的抗藥性產生。
蘇雲金芽孢桿菌菌株HBF-18，其保藏號為CGMCC2070。
對鞘翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌cry8Gal基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
一種工程菌菌株BioT8G，其特徵在於含有cry8Gal基因。
對鞘翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌cry8Gal蛋白，由上述cry8Gal基因所編碼，其胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。
cry8Gal蛋白在製備殺害鞘翅目害蟲藥劑中的應用。
一種蛋白，具有上述蛋白相同的功能，其胺基酸序列如SEQ ID NO4所示. 一種人工改造合成的mcry8Gal基因，其編碼上述的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
一種植物表達載體pBSmGN，其特徵是該植物表達載體由mcry8Gal基因序列、組成型表達啟動子或根特異性啟動子、終止子和一種能在大腸桿菌和根癌農桿菌中穿梭的雙元載體所構建。
mcry8Gal基因在植物抗鞘翅目害蟲中的應用。
所述應用為將含有mcry8Gal基因的植物表達載體pBSmGN轉化植物或微生物，使之產生抗鞘翅目害蟲的毒性。
所述植物是菸草。
所述應用為將mcry8Gal基因表達的蛋白製備成藥劑，用於殺滅鞘翅目害蟲。
本發明從河北土壤分離得到菌株HBF-18，其保藏編號為CGMCC2070，其生物學特性為在生長周期中可以產生芽胞，並且同時產生有毒殺作用的伴胞晶體。
根據cry8類基因保守區設計了一對通用引物 SN5un8 5`-GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3` SN3un8 5`-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3` PCR擴增鑑定HBF-18菌株，擴增結果(見附圖1)，其顯示條帶與已知cry8類基因(見表3)均不同，表明菌株HBF-18中可能含有新的cry8殺蟲基因。
設計一對全長基因引物cry8G5/cry8G3用來擴增全長基因。並且引入BamHI/SalI用於克隆與表達，引物對cry8G5/cry8G3的序列如下 BamHI cry8G55′-CGCGGATCCGAAATGAGTCCGAATAATCA-3′ SalI cry8G35′-ACGCGTCGACCTCTTCTTCTAACACGAGT-3′ 以菌株HBF-18的總DNA為模板，用pfuDNA聚合酶，進行PCR擴增，結果(見附圖2)顯示擴增出一3.5Kb的條帶，與載體pET21b連接轉化大腸桿菌JM110，得到重組質粒pSAS018(附圖2)。對插入片斷進行測序分析，得到序列SEQ ID NO 1為pSAS018中BamHI/SalI雙酶切片段，序列全長3472bps，分析表明其含有開放閱讀框，ORFl的位置是1-3472，GC含量為38.％，編碼1157個胺基酸組成的蛋白。經測定，其胺基酸序列為SEQ ID NO 2所示。同源分析表明該蛋白與Cry8類蛋白具有較高同源性，表4為其同源性數據。由於與已知的Cry8類蛋白胺基酸同源性均低於78％，最高只有58.2％(Cry8Bbl)，被Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會命名為Cry8Gal。
引物cry8G5/cry8G3分別引入BamHI和SalI位點，以菌株HBF-18質粒DNA為模板，擴增得到全長基因，插入Bt表達載體pSTK中得到重組質粒pSK018(見附圖3)，轉化大腸桿菌SCS110，提取質粒，電擊轉化Bt無晶體突變株HD-73-中(該突變株來源於中國農業科學院植物保護研究所生物技術實驗室，可以向公眾提供，見李海濤等，農業生物技術學報2005 Vol.13No.6 P.787-791)，得到工程菌BioT8G。
將上述工程菌BioT8G於30℃於牛肉膏培養基(蛋白腖5克，牛肉膏3克，葡萄糖10克，水1000mL，121℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌)中培養，提取蛋白進行SDS-PAGE電泳分析(方法參見Sambrook，J.et al，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)，結果(見附圖4)。結果表明工程菌Biot8G中的cry8Gal基因獲得了表達，表達物的分子量為130kDa左右。
Cry8Gal蛋白的活性測定表明，表達的Cry8Gal具有殺華北大黑鰓金龜和暗黑鰓金龜幼蟲的活性。
根據微生物和植物對密碼子偏好的不同，對cry8Gal基因的1-2040bp的序列進行了優化。本發明按照cry8Gal基因的人工改造序列進行了全基因合成，新基因見SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，對應蛋白序列見SEQ ID NO 4。cry8Gal基因與mcry8Gal(modified cry8Cal)基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原來cry8Cal的37.6％提高為45.2％。調整了Cry8Gal蛋白的胺基酸密碼子使用頻率，使mCry8Gal蛋白的胺基酸密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近，將cry8Ca基因的人工改造序列兩端引入BamHI和KpnI、SacI位點(見SEQ ID NO 3)，連至pUC57載體(該載體為常用載體，GenBank登錄號為Y14837)，重組質粒命名為pUC57-mcry8G。
在人工合成改造的Bt cry8G基因時，用BamHI和SacI酶切質粒pUC57-mcry8G回收2.0kb片段，用同樣的內切酶酶切質粒pBI121(該載體為常用載體，GenBank登錄號為AF485783。見Chen PY，et al，2003，Mol.Breed，11287-293)，回收12kb片段，將兩個片段連接，轉化JM110，得到陽性轉化子，把此新構建質粒命名為pBSmGN。該質粒含有組成型表達啟動子CaMV35S(即一段DNA序列，可以驅動所連接的基因片段進行轉錄，進而翻譯成蛋白質，組成型表達的啟動子可以調控基因在生長發育的任何階段和任何組織都有表達)、mcry8Gal基因和NOS終止子(一段DNA序列，含有基因表達的終止信號)。質粒構建圖見附圖5，該質粒可以轉化植物，獲得轉基因植物。
將人工合成改造的基因mcry8Gal農桿菌轉化，製備得到陽性克隆，再轉化菸草，轉基因菸草的生物活性檢測表明，轉基因植株表現出了良好的抗暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)性能。
菸草是植物基因工程中驗證基因功能常用的模式植物，轉基因菸草的抗暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)性能是因為在植物體中有啟動子啟動人工改造的mcry8Gal基因的轉錄，表達了Cry8G蛋白，雙元載體中的表達盒——組成型啟動子、人工改造的mcry8Gal和終止子只有整合到菸草的基因組中才能表達外源基因，所以可以用此雙元載體轉化任何已建立農桿菌轉化方法的植物，獲得的轉基因植物都具有抗暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)性能。
生物保藏信息 微生物名稱(屬、種的學名)蘇雲金芽孢桿菌Bacillus thuringiensis 保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏單位地址北京市海澱區中關村北一條13號 保藏日期2007年6月1日 保藏編號CGMCC No.2070
圖1菌株HBF-18的PCR-RFLP圖譜。其中 M.DNA分子量標準 1.PCR產物酶切 圖2重組質粒pSAS018酶切圖譜。其中 M.DNA分子量標準 1.PCR產物BamHI/SalI酶切 2.載體pET21bBamHI/SalI酶切 3.重組質粒pSAS018BamHI/SalI酶切圖譜 圖3重組質粒pSK018酶切圖譜。其中 M.DNA分子量標準 1.載體pSTK BamHI/SalI酶切 2.PCR產物BamHI/SalI酶切 3.重組質粒pSK018 BamHI/SalI酶切圖譜 圖4cry8Gal基因在Bt無晶體突變株中的表達。其中 M.蛋白質分子量標準 1.HBF-18 2.Biot8G 3.HD-73- 圖5pBSmGN質粒構建圖 圖6轉化菸草的分子檢測，其中 M.蛋白質分子量標準 1、2.為部分陽性轉基因植株檢測結果
具體實施例方式 下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1 1.1菌株185中cry基因鑑定 根據cry8類基因保守區設計了一對通用引物 SN5un8 5`GTCCGAATAATCAGAATGAATATG-3` SN3un8 5`-CGTTTCGCCTCTCTCACTGCAT-3` 表2是這些基因與引物的同源序列，表3是用這對引物預測的cry8基因擴增產物酶切片段大小，通過這種PCR-RFLP方法可以分別鑑定出將這些基因。
表2引物與cry8各基因的保守區配對情況及配對區在基因上的位置 表3 cry3的PCR擴增產物和限制性酶切長度多態性 用下列PCR反應體系(50μL)鑑定了Bt菌株185 10×PCR buffer 5μL MgCl2(20mM) 6μL dNTP(10mM) 1μL 引物對(10mM) 1μL/個 模板 1uL Taq聚合酶(5U/μL)0.5μL 超純水補至50μL，混勻離心，加石蠟油30μL。
擴增循環94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，25個循環，最後72℃延伸10分鐘。
對PCR產物利用KpnI和DraI酶切分析，結果(附圖1)顯示條帶是1260bp，570bp，320bp，與已知cry8類基因的圖譜(表3)不同，表明菌株HBF-18中可能含有新的cry8殺蟲基因. 1.2菌株HBF-18中cry8G基因的克隆 設計了一對全長基因引物cry8G5/cry8G3用來擴增全長基因。並且引入BamHI/SalI用於克隆與表達，引物對cry8G5/cry8G3的序列如下 BamHI cry8G55′-CGCGGATCCGAAATGAGTCCGAATAATCA-3′ SalI cry8G35′-ACGCGTCGACCTCTTCTTCTAACACGAGT-3′ 以菌株HBF-18的總DNA為模板，用pfuDNA聚合酶，用如下體系進行PCR擴增。。
超純水補至50μL，混勻離心，加石蠟油30μL。
擴增循環94℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，25個循環，最後72℃延伸10分鐘。結果(見附圖2)顯示擴增出3.5Kb的條帶，與載體pET21b連接轉化大腸桿菌JM110，得到陽性轉化子pSAS018。對插入片斷進行測序分析，得到序列SEQ ID NO 1為pSAS018中BamHI/SalI雙酶切片段，序列全長3472bps，分析表明其含有開放閱讀框，ORF1的位置是1-3472，GC含量為38.％，編碼1157個胺基酸組成的蛋白。經測定，其胺基酸序列為SEQ ID NO 2所示。同源分析表明該蛋白與Cry8類蛋白具有較高同源性，表4為其同源性數據。由於與已知的Cry8類蛋白胺基酸同源性均低於78％，最高只有58.2％(Cry8Bbl)，被Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會命名為Cry8Gal。
表4 Cry8Gal與Cry8蛋白同源比較數據 本發明進一步分析了Cry8Gal蛋白的胺基酸組成(見表6)，得知其分子量為131.56kDa，等電點為pH4.735(見表5)，分析了蛋白的生化指標(見表5) 表5 Cry8Gal蛋白的生化特性 表6 Cry8Gal蛋白的胺基酸組成 1.3 cry8G基因的表達 引物cry8G5/cry8G3分別引入BamHI和SalI位點，以含全長cry8Gal的菌株HBF-18質粒DNA為模板，擴增得到全長基因，插入Bt表達載體pSTK(見附圖3)中，轉化大腸桿菌SCS110，提取質粒，電擊轉化Bt無晶體突變株HD-73-中，得到工程菌BioT8G。
分別將上述兩株工程菌30℃於牛肉膏培養基中培養30小時，取500μL菌液至Eppendorf管中，超聲波破碎30秒鐘(B.Braun U Labsonic，230V，T間隔＝0.5秒)；取100μL加入25μL新配0.5NNaOH，25℃作用5分鐘；加入65μL 3×樣品緩衝液(925μL上樣緩衝液+75μL β-巰基乙醇)，100℃煮沸5分鐘。離心除去沉澱。上樣10uL進行SDS-PAGE電泳分析結果。結果(附圖4)表明，工程菌Biot8G中的cry8Gal基閒均獲得了表達，表達物的分子量為130kDa左右。
1.4 Cry8G蛋白的活性測定 將Bt工程菌株接種在普通細菌瓊脂克氏瓶培養基上培養3天。將受體菌株HD-73-接種在普通細菌瓊脂克氏瓶培養基上培養4天。將培養物洗下，2倍梯度濃度稀釋，將40ml菌懸液加入到200g有均勻粗細土豆絲的細土(紫外線滅菌)中，混勻，使土壤含水量保持在18％-20％。接入暗黑鰓金龜15天齡幼蟲20頭，以加入清水的處理為空白對照，28℃感染飼養，14天檢查死蟲數，計算LC50。結果(見表8)表明工程菌株對華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)和暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)具有極高的毒殺活性。其表達的Cry8G蛋白具有殺華北大黑鰓金龜、暗黑鰓金龜蟲的活性。
表7 Bt工程菌和HBF-18菌株對華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)、暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)幼蟲殺蟲活性測定 注在結果的濃度單位中，×108/g土和×108/ml的換算，每200g土中加入36ml菌懸液。
實施例2 2.1人工設計合成的可以在植物中表達的cry8G基因的核苷酸序列 根據微生物和植物對密碼子偏好的不同，對cry8Gal基因的1-2040bp的序列進行了優化。本發明按照cry8Gal基因的人工改造序列進行了全基因合成，新基因見SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。cry8Gal基因與mcry8Gal(modified cry8Cal)基因的核苷酸序列同源性只有86.88％，G+C含量也由原來cry8Cal的37.6％提高為45.2％(表8)。調整了Cry8Gal蛋白的胺基酸密碼子使用頻率，使mCry8Gal蛋白的胺基酸密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近(表9)。將cry8Ca基因的人工改造序列兩端引入BamHI和KpnI位點，連至pUC57載體，重組質粒命名為pUC57-mcry8G。
表8 cry8Gal基因與mcry8GalG+C含量比較與聚腺苷酸化的信號序列情況 表9植物、Cry8al及mCry8Gal中蛋白的胺基酸密碼子使用頻率 2.2植物表達載體的構建 用BamHI和SacI酶切質粒pUC57-mcry8G(中國農業科學院植物保護研究所生物技術組保存)回收2.0kb片段，用同樣的內切酶酶切質粒pBI121(該載體為常用載體，GenBank登錄號為AF485783。見Chen PY，et al，2003，Mol.Breed，11287-293)，回收12kb片段，將兩個片段連接，轉化JM110，得到陽性轉化子，把此新構建質粒命名為pBSmGN。該質粒含有組成型表達的啟動子CaMV35S(即一段DNA序列，可以驅動所連接的基因片段進行轉錄，進而翻譯成蛋白質，組成型表達的啟動子可以調控基因在生長發育的任何階段和任何組織都有表達)、mcry8Ga基因和NOS終止子(一段DNA序列，含有基因表達的終止信號)。質粒構建圖見附圖5，該質粒可以在植物中表達外源基因。
2.3農桿菌轉化 取一管200μl農桿菌LBA4404的感受態細胞，加入1μg pBSmGN質粒DNA，液氮中速凍1分鐘，37℃恢復培養5分鐘，加入1ml YEB液體培養基，28℃慢速振蕩(＜100rpm)4小時，1,000rpm離心30秒種，棄上清，加入100μl YEB液體培養基重懸細胞，塗布於含有卡那黴素100μg/ml和鏈黴素125μg/ml的YEB培養基的平板上，28℃培養48小時。將YEB抗性培養基平板上的克隆，搖菌，提取質粒，應用PCR方法檢測陽性克隆。
2.4菸草轉化 將含有pBSmGN質粒的農桿菌克隆接種於含有卡那黴素100μg/ml和鏈黴素125μg/ml的YEB液體培養基中，28℃振蕩培養至OD600為0.6-0.8，1/50接種於MS鹽(pH7.0)中；將菸草無菌苗切成0.4×0.6cm2的小塊，將菸草葉片浸入MS鹽中，農桿菌侵染10分鐘；取出菸草葉片，用滅菌濾紙吸乾菌液，放置到鋪有一層濾紙的MS培養基中，28℃暗培養3天，3天後將菸草葉片轉移至MS篩選分化培養基(MS培養基+100μg/ml卡那黴素+500μg/ml羧苄黴素+3mg/ml 6-BA+0.2mg/ml NAA)，28℃，光/暗＝16小時/8小時，2周後，在葉片邊緣有綠色愈傷點出現，1周後，愈傷點分化成小植株，將小植株切下移至生根培養基(MS培養基+100μg/ml卡那黴素+500μg/ml羧苄黴素)生根，根部發育健壯後，移至花盆在土中繼續生長(普通土∶營養土∶蛭石＝2∶1∶1)。
2.5轉化菸草的分子檢測 提取轉化菸草的基因組DNA，取1μg基因組DNA做模板，引物序列如下 8GF15′-TTCAGTTGTCCACTCCGCCTA 8GR15′-GCCATTCACAGCCTTCTTTGC PCR擴增的反應條件為94℃，5分鐘，1個循環；94℃，1分鐘，53℃，1分鐘，72℃，2分鐘，30個循環。把產物電泳。如圖6所示，陽性轉化株擴增出大小為640bp的片段。
2.6轉基因菸草的生物活性檢測 從田間採集華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)、暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)2種在我國北方危害比較嚴重的金龜子成蟲群體，帶回室內，分別放入40×40×50cm的飼養盒中，盒底放5-8cm厚的潮溼過篩細土，飼餵新鮮榆樹葉片，26-28℃飼養。待其產卵後，將卵挑出，放在潮溼土中使孵化。將剛孵化的幼蟲挑出，每個小飼養盒(Φ8cm，H5cm)放幼蟲5頭，飼餵土豆塊和新鮮的玉米嫩根，待幼蟲長到一定齡期後供生測用。
採用群體種植和群體接蟲的方法，進行生物測定。在大田土中採用分別種植及混合種植轉基因植株和未轉化植株的種植方法，每個處理12株。
按照建立的危害程度分級標準，華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)幼蟲對供試轉基因植物的危害程度、危害指數統計如下，見表10。
表10.轉基因植株與非轉基因株的危害統計。
從表10統計結果看，轉pBSmGN植株的危害率為62.5％，危害指數為22.9；非轉基因植株危害率100％，危害指數為72.9。轉pBSmGN植株表現出了良好的抗華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)的特性。
暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)幼蟲對供試轉基因植物的危害程度統計如下。轉pBSmGN植株危害率為50％，危害指數為12.5，低於非轉基因植株危害率為100％，未轉化植株危害指數75.0相當。可見轉pBSmGN植株表現出了良好的抗暗黑鰓金龜(Holotrichiaparallela)。
根據以上信息，利用可以在根部特異轉錄基因的啟動子，可以使該基因在植物根部得到表達，從而只在植物根部獲得對目標害蟲暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela)的抗性。
附錄本發明所涉及的DNA序列和蛋白質序列
SEQ ID NO 1(cry8Gal基因的核苷酸序列)
1
AGTCCGA ATAATCAGAA CGAATATGAA ATTATAGATG CGTCATCACC TACTTCTGTA
→
61TCTAATAACT CAGTGAAATA CCCTTTAGCA AGTGATCAAA CGACCACATT ACAAAATATG
121 AACTATAAAG ATTATCTGAG AATGTCTGAG GGAGAGAATC CTGAATTATT TGGAAATCCA
181 GAGACGTTTA TTAGTGCGCA GGATGCGGTT GGAACTGGGA TTGATATTGT GAGTAAACTA
241 CTAGGTAGTT TAGGGGTTCC ACTTGTTGGG CAAGCCGCAA CGGCACTTAA ATGGATTATA
301 GGTAAATTGT GGCCTTCTTC AGGAAACCCG TGGGATGATT TGATGACGGC AGTAGAAGAA
361 CTCATAAATC AAAAAATAGA AGCATATGCA AGAAGTAAGG CACTTGCTGA ATTGGGTGTT
421 TCGGGAAGAG CTGTAAAATC CTATCAAACC GCACTTGAAG AGTGGCAAAA AAACCCGAAT
481 AACGCGCGAA GCGCAGCACT TGTAAGGGAA AGATTTTCAG ATGCAGAACA TACATTGCGT
541 ACTCAAATGA GTTTATTTAC CGTTCGTGGT TATGAAATTC CGCTTTTAGC AACATATGCA
601 CAAGCTGCCA ATTTGCATTT GTTTGTAATG AAGGATATTC AAATTTACGG GAGAGAATGG
661 GGATATACTC AGGGAGATAT TAACCTTTTC TATCGAGAAC AAGTAGAATT TACAGGGGAA
721 TACTCTGATT ATTGTGTTAA GTGGTACAAT GCTGGCTTAG ATAAATTAAG AGGCTCGACT
781 GCTCTACAAT GGATTAACTA TAATCGTTTC CGCAGAGAAA TGACAGTGAT GGCACTGGAT
841 ATAGTTGCAT TATTCCCAAA TTATGACATA CGCATGTATC CAATGAAAAC AACCGCAGAA
901 TTAACGCGAA GAATTTATAC AGATCCGCTT GGTTATACGG GAAGTGGGTC TAACACGCCA
961 CCATGGTATA ATTATGGATA TTCTTTCTCA TGGATAGAAA ATAATGCCGT GCCAGCACCT
1021 GGATTGTTCC AGTGGTTACA AGGAATTGGG ATTTATACTA AATTTGCTCG TATAACTCCA
1081 TTTTATGCGA ACTATTGGTC AGGACATACT GTATTTTATA AATTTACTAA CGATTCTACT
1141 GAGAGACGTG TTCAGTATGG AGATACAGAT ACTCCAGAAT TAGATAGTTC TTCCTTTGAA
1201 AATGTTGACA TTTATAAGGT TTCAGCATCA GTTGGTTCGT ACAAAAGTAA TACCGTACTA
1261 TTACCAACTT TTAAAGCTAC TTTTGAGGGG GTAAATCAAA ATAATCAGTT AAAGACCTTT
1321 AGGTATCAAA AAGAATCTAA TGTCCCAAGT CAAACGAAAA ACTCAACCAC AGAGCTGCCT
1381 GTTCAGTTAT CAACTCCGCC TACTTACGGA GATTCTGAAC AGTACAGTCA TAGACTAGCC
1441 TATGTTTTTG ATGCCCCAAT CGATTCATAT ACAGGCATAT ATCGCATGTA TGGATTTGCC
1501 CCTATTCTTG GTTGGACACA TATTAGTGTA AGTCGTGACA ATAGGATTGA TCCAGATAAA
1561 ATTACTCAAA TTCCAGCTGT AAAGGCATAT GCTGAGGGTC TTGCTAATTA TATCAAAGAT
1621 CCGGGGTTTA CAGGAGGAGA TTTATTAGCT TTAGGTAGAA ACTCAAATAC TTCATTGATT
1681 GTCAATTTTT CGAAGCCTCA AACATACCGT ATTCGTATTC GTTATGCTGC TAGTAAAACT
1741 TCGTATTTTC AACTACGTGG GCTGCATAAT ATAGCTCAGT CTCAGCGTTT CGAAGCGACG
1801 TATTCTAATA AAAATGAAAA CGATTTGACA TTTAACGATT TTAAATATGT AGAAATTCAA
1861 AAAACTGTTT CAATAGACAA TCCATCAGAA AGTCGTAGTA TAAGTATATA CACTCAATCA
1921 GATACAGAAT ACTTATTATG GACAAATCGA ATTCATCCCA GTAGATGCAA CATTTGGAGC
1981 GGAACAAGAC CTAGATGTGG CAAAGAAAGC GGTGAATGGC TTGTGTACCA ATACAAAAGA
2041 TGCCTTACAG ACAAGTGTAA CGGATTATCA AGTCAATCAA GCGGCAAACT TAGTAGAATG
2101 CCTATCGATG AGTTATACCC AAATGAAAAA CGCATGTTAT GGGATGCAGT GAAAGAGGCG
2161 AAACGACTTG TTCAGGCACG TAACTTACTC CAAGATACAG GCTTTAATGT AATAAATGGA
2221 GAAAACGGAT GGACGGGAAG TACGGGAATT GAGGTTGTGG AAGGGGATGT TCTGTTTAAA
2281 GATCGTTCGC TTCGTTTGCC AAGTGCGAGA GAGATTGATA CAGAAACATA TCCAACGTAT
2341 CTCTATCAAC AAATAGATGA ATCGCTTTTA AAACCATATA CAAGATATAG ACTAAGAGGT
2401 TTTATAGGAA GTAGTCAAGA TTTAGAGATT AAATTAATAC GTCATCGGGC AAATCAAATT
2461 GTCAAAAATG TACCGGATAA CCTCTTGCCA GATGTACGCC CTGTCAATTC TTGTGGTGGA
2521 GTCGATCGCT GCAGTGAACA ACAGTATGTA GACGCGAATT TAGCACTCGA AAACAATGGA
2581 GAAAATAGAA ATATGTCTTC TGATTCCCAT GCATTTTCTT TCCATATGGA TACAGGTGAA
2641 ATAGATTTAA ATGAAAATAC AGGTATTTGG GTCGTATTTA AAATTCCGAC AACAAATGGA
2701 TACGCAACAT TAGGAAACCT TGAATTGGTA GAAGAGGGGC CATTATCAGG AGACGCACTA
2761 GAACGCTTGC AAAGAGAAGA ACAGCAGTGG AAGCTTCAAA GAACCAAAAG ACGTGAAGAG
2821 ACGGATAGAA AATATATGGC AGCAAAACAA GCCATTGATC GTTTATTCGC AGATTATCAA
2881 GACCAACAAC TCAATTCTGG TGTAGAAATG TCAGATTTGC TTGCAGCTCA AAACCTTGTA
2941 CAGTCCATTC CTTATGTGTA TAACGAAATG TTCCCAGAAA TCCCTGGAAT GAACTATACA
3001 AATTTCACAG AGTTAACAAA CAGACTCCAA CAAGCATGGA ATTTGTATGA TCTTCGAAAT
3061 GCTATACCAA ATGGAGATTT TCGAAATGGA TTAAGTGATT GGAATGCAAC ATCAGATATA
3121 AATGTGCAAC AACTAAACGA TACATCTGTC CTTGTCATTC CAAACTGGAA TTCTCAAGTG
3181 TCACAACAAT TTACAGTTCA ACCGAATTAT AGATATGTAT TACGTGTCAC AGCGAGAAAA
3241 GAGGGAGCAG GAGACGGATA TGTGATCATC CGTGATGGTA CAAATCAGAC AGAAACACTC
3301 GCATTTAATA CATGTGATAA TGATGCAGGT GTTTTATCTA CTAATCAAGC TAGCTATATC
3361 ACAAAAACAG TGGAATTCAC GCCATCTACA GAGCAAGTTT GGATTGACAT GAGTGAGACC
3421 GAAGGTGTAT TCAACATAGA AAGTGTAGAA CTCGTGTTAG AAGAAGAGTA AG
SEQ ID NO 2(Cry8Gal蛋白的胺基酸序列)
1 MSPNNQNEYE IIDASSPTSV SNNSVKYPLA SDQTTTLQNM NYKDYLRMSE GENPELFGNP
61ETFISAQDAV GTGIDIVSKL LGSLGVPLVG QAATALKWII GKLWPSSGNP WDDLMTAVEE
121 LINQKIEAYA RSKALAELGV SGRAVKSYQT ALEEWQKNPN NARSAALVRE RFSDAEHTLR
181 TQMSLFTVRG YEIPLLATYA QAANLHLFVM KDIQIYGREW GYTQGDINLF YREQVEFTGE
241 YSDYCVKWYN AGLDKLRGST ALQWINYNRF RREMTVMALD IVALFPNYDI RMYPMKTTAE
301 LTRRIYTDPL GYTGSGSNTP PWYNYGYSFS WIENNAVPAP GLFQWLQGIG IYTKFARITP
361 FYANYWSGHT VFYKFTNDST ERRVQYGDTD TPELDSSSFE NVDIYKVSAS VGSYKSNTVL
421 LPTFKATFEG VNQNNQLKTF RYQKESNVPS QTKNSTTELP VQLSTPPTYG DSEQYSHRLA
481 YVFDAPIDSY TGIYRMYGFA PILGWTHISV SRDNRIDPDK ITQIPAVKAY AEGLANYIKD
541 PGFTGGDLLA LGRNSNTSLI VNFSKPQTYR IRIRYAASKT SYFQLRGLHN IAQSQRFEAT
601 YSNKNENDLT FNDFKYVEIQ KTVSIDNPSE SRSISIYTQS DTEYLLWTNR IHPSRCNIWS
661 GTRPRCGKES GEWLVYQYKR CLTDKCNGLS SQSSGKLSRM PIDELYPNEK RMLWDAVKEA
721 KRLVQARNLL QDTGFNVING ENGWTGSTGI EVVEGDVLFK DRSLRLPSAR EIDTETYPTY
781 LYQQIDESLL KPYTRYRLRG FIGSSQDLEI KLIRHRANQI VKNVPDNLLP DVRPVNSCGG
841 VDRCSEQQYV DANLALENNG ENRNMSSDSH AFSFHMDTGE IDLNENTGIW VVFKIPTTNG
901 YATLGNLELV EEGPLSGDAL ERLQREEQQW KLQRTKRREE TDRKYMAAKQ AIDRLFADYQ
961 DQQLNSGVEM SDLLAAQNLV QSIPYVYNEM FPEIPGMNYT NFTELTNRLQ QAWNLYDLRN
1021 AIPNGDFRNG LSDWNATSDI NVQQLNDTSV LVIPNWNSQV SQQFTVQPNY RYVLRVTARK
1081 EGAGDGYVII RDGTNQTETL AFNTCDNDAG VLSTNQASYI TKTVEFTPST EQVWIDMSET
1141 EGVFNIESVE LVLEEE*
SEQ ID NO 3(人工設計基因的核苷酸序列)
BamHI
1 CGCGGATCCGCGATGAGTCCGAATAACCAGAACGAATATGAGATCATCGATGCTTCCTCC
61CCCACCTCTGTTTCTAATAACTCAGTGAAGTACCCTCTTGCAAGCGACCAGACGACCACA
121 TTGCAAAACATGAACTACAAAGATTACCTGCGGATGTCTGAGGGAGAGAATCCTGAACTT
181 TTTGGAAATCCCGAGACGTTCATTAGTGCTCAGGACGCTGTTGGCACTGGTATTGATATT
241 GTGAGCAAGCTGTTGGGTAGTTTGGGGGTTCCACTTGTTGGTCAGGCCGCCACGGCACTT
301 AAATGGATCATAGGTAAGTTGTGGCCTTCTTCCGGAAACCCCTGGGACGATTTGATGACG
361 GCCGTAGAAGAACTCATCAACCAGAAGATAGAAGCGTATGCCAGAAGCAAGGCACTTGCT
421 GAATTGGGTGTTAGCGGACGGGCTGTGAAGTCCTACCAAACCGCCCTTGAAGAGTGGCAG
481AAGAACCCCAATAACGCTCGAAGCGCAGCCCTTGTCAGGGAAAGATTTTCAGACGCAGAA
541CACACATTGCGTACCCAAATGAGTTTGTTCACCGTTCGTGGTTACGAAATTCCGCTTTTA
601GCCACATATGCACAAGCTGCCAATTTGCACTTGTTTGTGATGAAGGATATTCAAATTTAC
661GGTAGAGAATGGGGATACACTCAGGGCGACATCAACCTTTTCTACAGGGAACAAGTAGAA
721TTCACAGGGGAATACTCTGATTATTGCGTTAAGTGGTACAACGCTGGCTTGGACAAACTT
781AGAGGCAGCACCGCTCTACAATGGATTAACTACAATAGGTTCCGCAGAGAAATGACAGTG
841ATGGCCCTGGATATCGTTGCACTTTTCCCCAATTACGACATCCGCATGTATCCAATGAAG
901ACAACCGCAGAACTTACGCGAAGAATTTACACAGACCCCCTTGGTTACACGGGAAGCGGT
961TCTAACACGCCACCATGGTATAACTACGGATACTCTTTCTCCTGGATAGAAAACAACGCC
1021 GTGCCAGCCCCTGGATTGTTCCAGTGGTTGCAAGGCATTGGGATCTATACCAAGTTTGCT
1081 CGTATCACTCCATTTTACGCGAACTACTGGTCAGGACATACTGTCTTCTACAAATTTACT
1141 AACGATTCTACTGAGAGACGTGTTCAGTATGGAGACACAGATACTCCAGAATTAGACAGT
1201 TCTTCCTTCGAAAACGTTGACATTTATAAGGTTTCCGCCTCAGTTGGTTCGTACAAGAGC
1261 AATACCGTGTTGTTACCAACTTTTAAAGCTACTTTCGAGGGTGTCAATCAGAACAATCAG
1321 CTTAAGACCTTTAGGTATCAAAAGGAATCTAATGTCCCAAGCCAAACGAAGAACTCAACC
1381 ACAGAGCTGCCTGTTCAGTTGTCCACTCCGCCTACTTACGGAGACTCTGAACAGTACAGT
1441 CACAGACTAGCCTACGTTTTCGATGCCCCAATCGACTCATATACAGGCATATACCGCATG
1501 TACGGCTTTGCCCCTATTCTTGGTTGGACACACATTAGCGTGAGTAGGGACAACAGGATC
1561 GATCCAGACAAGATTACTCAAATTCCAGCTGTAAAGGCATATGCTGAGGGTCTTGCTAAT
1621 TACATCAAAGATCCCGGGTTCACAGGAGGCGACTTACTTGCTTTAGGTAGAAACTCCAAT
1681 ACTTCATTGATTGTCAACTTTTCGAAGCCTCAAACATACCGTATCCGTATTAGGTACGCT
1741 GCTAGCAAAACTTCGTATTTCCAACTACGTGGTCTGCACAATATCGCTCAGTCTCAGCGT
1801 TTCGAAGCTACGTACTCTAATAAGAACGAAAACGATTTGACATTTAACGACTTCAAGTAC
1861 GTCGAAATTCAAAAAACTGTTTCCATCGACAATCCATCAGAAAGCAGGAGTATATCCATC
1921 TACACTCAATCAGATACAGAACTTCTTATTATAGACAAAAATCGAATTCATCCCAGTAGAC
1981 GCCACATTTGAAAGCGGAACAAGACCTAGATGTGGCAAAGAAGGCTGTGAATGGCTTGTTC
KpnI SacI
2041 ACGAACACAAAGTAACGGGGTACCCCGAGCTCG
SEQ ID NO 4(人工設計基因mCry8Gal蛋白的胺基酸序列)
1 MSPNNQNEYE IIDASSPTSV SNNSVKYPLA SDQTTTLQNM NYKDYLRMSE GENPELFGNP
61ETFISAQDAV GTGIDIVSKL LGSLGVPLVG QAATALKWII GKLWPSSGNP WDDLMTAVEE
121 LINQKIEAYA RSKALAELGV SGRAVKSYQT ALEEWQKNPN NARSAALVRE RFSDAEHTLR
181 TQMSLFTVRG YEIPLLATYA QAANLHLFVM KDIQIYGREW GYTQGDINLF YREQVEFTGE
241 YSDYCVKWYN AGLDKLRGST ALQWINYNRF RREMTVMALD IVALFPNYDI RMYPMKTTAE
301 LTRRIYTDPL GYTGSGSNTP PWYNYGYSFS WIENNAVPAP GLFQWLQGIG IYTKFARITP
361 FYANYWSGHT VFYKFTNDST ERRVQYGDTD TPELDSSSFE NVDIYKVSAS VGSYKSNTVL
421 LPTFKATFEG VNQNNQLKTF RYQKESNVPS QTKNSTTELP VQLSTPPTYG DSEQYSHRLA
481 YVFDAPIDSY TGIYRMYGFA PILGWTHISV SRDNRIDPDK ITQIPAVKAY AEGLANYIKD
541 PGFTGGDLLA LGRNSNTSLI VNFSKPQTYR IRIRYAASKT SYFQLRGLHN IAQSQRFEAT
601 YSNKNENDLT FNDFKYVEIQ KTVSIDNPSE SRSISIYTQS DTEYLLWTNR IHPSRCNIWS
661 GTRPRCGKES GEWLVYQYKR
權利要求
1.蘇雲金芽孢桿菌菌株HBF-18，其保藏號為CGMCC2070。
2.對鞘翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌cry8Ga1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
3.一種工程菌菌株BioT8G，其特徵在於含有權利要求2所述的cry8Ga1基因。
4.對鞘翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌cry8Ga1蛋白，由權利要求2所述的cry8Ga1基因所編碼，其胺基酸序列如SEQ ID NO2所示。
5.權利要求4所述的cry8Ga1蛋白在製備殺害鞘翅目害蟲藥劑中的應用。
6.一種蛋白，具有權利要求4所述蛋白相同的功能，其胺基酸序列如SEQ ID NO4所示。
7.一種人工改造合成的mcry8Ga1基因，其編碼權利要求6所述的蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
8.一種植物表達載體pBSmGN，其特徵是該植物表達載體由權利要求6所述的mcry8Ga1基因序列、組成型表達啟動子或根特異性啟動子、終止子和一種能在大腸桿菌和根癌農桿菌中穿梭的雙元載體所構建。
9.權利要求7所述的mcry8Ga1基因在植物抗鞘翅目害蟲中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵是將含有mcry8Ga1基因的植物表達載體pBSmGN轉化植物或微生物，使之產生抗鞘翅目害蟲的毒性。
11.根據權利要求10所述的應用，所述植物是菸草。
12.根據權利要求9所述應用，其特徵是將mcry8Ga1基因表達的蛋白製備成藥劑，用於殺滅鞘翅目害蟲。
全文摘要
本發明為「對鞘翅目害蟲高效的蘇雲金芽孢桿菌cry8G基因、蛋白及其應用」，屬生物防治技術領域。本發明提供了對鞘翅目害蟲高毒力的蘇雲金芽孢桿菌cry8G基因的核苷酸序列和其編碼的蛋白質的胺基酸序列，同時提供了人工設計用於轉基因植物的該基因的核苷酸序列及其編碼的胺基酸序列。通過使用上述基因或其人工設計序列轉化微生物和植物，使它們表現出對相關害蟲的毒性，克服或延緩昆蟲對工程菌和轉基因植物抗藥性的產生。
文檔編號C07K14/32GK101113424SQ200710118289
公開日2008年1月30日 申請日期2007年7月4日 優先權日2007年7月4日
發明者束長龍, 宋福平, 馮書亮, 傑 張, 王容燕, 黃大昉, 郎志宏 申請人:中國農業科學院植物保護研究所, 河北省農林科學院植物保護研究所