模擬桔青黴素抗原的納米抗體及其應用的製作方法
2023-11-05 18:53:07
模擬桔青黴素抗原的納米抗體及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物【技術領域】，設計一種模擬桔青黴素抗原的納米抗體，具有（a）SEQIDNO.:1所示的胺基酸序列或將該序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對抗桔青黴素單克隆抗體或多克隆抗體結合活性的由（a）衍生的與（a）具有90%以上同源性的胺基酸序列。本發明納米抗體能模擬模擬桔青黴素抗原，具有廣闊的市場空間。
【專利說明】模擬桔青黴素抗原的納米抗體及其應用
【技術領域】
[0001]本專利涉及生物【技術領域】，具體涉及模擬桔青黴素抗原的納米抗體及其應用。
【背景技術】
[0002]桔青黴素(Citrinin, CIT),又稱為桔黴素,是青黴屬和麴黴屬等真菌菌株產生的真菌毒素，廣泛存在於多種食品及動物飼料中。CIT汙染也存在於傳統紅曲發酵產品，廣泛用於食品著色及風味增強。同時因其發酵代謝產物有多種功能活性成分也用於保健食品中。毒理學研究表明CIT具有腎毒性、肝毒性和潛在的致畸性，且能引發腫瘤和誘發突變。嚴重危害人體和動物的健康。因此，對食品中CIT含量的檢測監控十分必要。
[0003]目前，常見的真菌毒素檢測方法有高效液相色譜法、液質聯用分析法、免疫分析法。高效液相色譜法等儀器分析法具有檢測準確、重複性好等特點，但同時也有儀器價格昂貴、樣品前處理過程繁瑣、樣本檢測耗時長、不能同時檢測多個樣品等缺點，因而其使用受到極大的限制，不適於基層監控使用。酶聯免疫吸附檢測法以其高靈敏度、檢測方便、成本低廉等優勢廣泛用於真菌毒素的初步檢測。然而，在方法建立過程中，必須使用真菌毒素標準品作為競爭抗原和製備包被抗原，對檢測人員的健康和環境造成極大的威脅。因此，採用抗獨特型抗體及抗原模擬表位等技術可替代有害的毒素標準品，並已取得了一定的進展。噬菌體展示技術已廣泛用於從天然抗體庫或免疫抗體庫中淘選得到特異抗體。該技術在研究未知蛋白空間結構表位，受體與配體結合位點、尋找高親和力生物活性的配體分子及新型疫苗的開發等方面也得到 廣泛應用。
【發明內容】
[0004]本發明通過對天然納米抗體噬菌體展示庫中，篩選得到能與抗桔青黴素單克隆抗體特異結合的納米抗體，該抗體具有與天然CIT分子相似的反應特性，能替代毒性較強的CIT標準品，並可作為競爭抗原或固相包被抗原應用於CIT的免疫學檢測。
[0005]本發明以抗CIT單克隆抗體為靶分子，將其固相包被於酶標板上，加入噬菌體展示的天然駝源單域重鏈納米抗體庫，進行親和淘選，獲得了可以模擬桔青黴素抗原的納米抗體。
[0006]本發明模擬桔青黴素抗原的納米抗體:
Ca)該抗體的胺基酸序列如下:
QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAGSGRTFNRYPMSWFRQVPGKEREFVAEINWSGSSTYYADSVKGRFTISRD
NAKNTVFLQMSSLKPEDTAVYYCAAGSPGRYDYWGQGTQVTVSS
上述納米抗體的序列中，大寫英文字母分別代表二十一種已知的天然L-型胺基酸殘基或其D-型異構體的一種，即A代表丙氨酸殘基，C代表半胱氨酸殘基，D代表天冬氨酸殘基，E代表穀氨酸殘基，F代表苯丙氨酸殘基，G代表甘氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，K代表賴氨酸殘基，L代表亮氨酸殘基，M代表蛋氨酸殘基，N代表天冬醯胺酸殘基，P代表脯氨酸殘基，Q代表谷胺醯氨酸殘基，R代表精氨酸殘基，S代表絲氨酸殘基，T代表蘇氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，W代表色氨酸殘基，Y代表酪氨酸殘基。
[0007](b)將(a)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對抗桔青黴素單克隆抗體結合活性的由(a)衍生的與(a)具有90%以上同源性的胺基酸序列。
[0008]本發明還涉及所述模擬桔青黴素抗原的納米抗體的核苷酸。
[0009]以及，包含所述核苷酸序列的載體，包含所述的載體的宿主細胞。
[0010]本發明提及的模擬桔青黴素抗原的納米抗體可通過噬菌體擴增或基因工程重組表達的方式進行大量製備。噬菌體擴增是指將展示有模擬桔青黴素抗原的納米抗體的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖展示有該納米抗體的噬菌體粒子。基因工程重組表達的方式是指將編碼該抗體的基因，通過克隆至表達載體上，以蛋白的形式大量製備。
[0011]本發明還涉及所述的該納米抗體在免疫學檢測分析中的應用。包括酶聯免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點雜交等基於抗原-抗體特異性反應的免疫學分析檢測方法。
[0012]本發明模擬桔青黴素抗原的納米抗體在應用時，可通過噬菌體擴增獲得的展示有該納米抗體的噬菌體粒子直接用於分析檢測，也可以通過基因工程表達成蛋白作為包被抗原用於分析檢測。當然，也可作為CIT標準品的代替物來進行免疫學檢測分析。
[0013]還涉及該納米抗體以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應用。 [0014]前述該納米抗體可替代具有較強毒性CIT標準品，並作為固相包被抗原或競爭抗原應用於CIT的免疫學檢測。該納米抗體具有與天然CIT分子相似的免疫反應特性，效果非常好。
[0015]本發明的意義在於可替代毒性較強的CIT標準品，並可作為競爭抗原或固相抗原應用於CIT的免疫學檢測，具有和天然CIT分子相似的免疫反應特異性。該方法成本低，可多樣品同時檢測，具有很高的應用價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為該納米抗體以噬菌體展示形式作為競爭抗原時的間接競爭ELISA標準曲線。檢測範圍 1.50 - 45.94 ng/mL, IC50 % 11.55 ng/mL。
[0017]圖2為該納米抗體以抗體蛋白形式作為固相包被抗原時的間接競爭ELISA標準曲線。檢測範圍 12.14-196.35 ng/mL, IC50 為 48.94 ng/mL。
【具體實施方式】
[0018]本發明將通過以下實施例作進一步的說明。
[0019]實施例1.抗桔青黴素單克隆抗體的製備 (一)免疫抗原的製備
桔青黴素為小分子半抗原不具備免疫源性，但可以通過偶聯大分子載體蛋白使其具有免疫源性。通過對桔青黴毒素結構分析，其具有羥基、羧基和羰基三個基團，都可通過適當的化學方法與蛋白質偶聯。但羧基和羥基是其抗原決定簇中的重要基團，若利用其作為連接基團與蛋白質連接將導致桔青黴素抗原性的改變，不能引發機體產生針對桔青黴素分子的抗體。故採用甲醛加成法，通過桔青黴素分子上的C1位置的活潑氫製備桔青黴素人工抗原。具體步驟如下:0.5 mg桔青黴素溶解於150 μ I甲醇中，加入100 μ I 37%的甲醛，滴入5 mg匙眼貝血藍蛋白(KLH，pH 4.2)溶液中，37 °C反應24 h，即得到桔青黴素人工抗原。同樣與卵清蛋白(OVA)反應得到的桔青黴素人工抗原作為檢測抗原。反應結束後，置
0.01 M PBS 4°C透析 72h。
[0020](二)抗桔青黴素單克隆抗體的製備
BALB/c小鼠經桔青黴素人工抗原免疫4次後，間隔四周，尾靜脈注射人工抗原0.05mg/只，3天後，脾細胞在50% PEG融合劑作用下與對數期生長的SP2/0雜交瘤細胞融合。經HAT選擇培養液培養7d後，換HT培養基培養，取雜交瘤細胞培養上清進行間接ELISA篩選陽性克隆，採用間接競爭ELISA篩選分泌抗桔青黴素單克隆抗體的雜交瘤細胞。陽性細胞經有限稀釋法亞克隆3次均為100%的陽性後，建立細胞系並凍存。並將雜交瘤細胞接種於提前注射降植烷的BALB/c小鼠腹腔，製備腹水，經辛酸.硫酸銨沉澱法純化單抗。
[0021](三)抗桔青黴素單克隆抗體的鑑定
經上述實驗，篩選到一株分泌抗桔青黴素單克隆抗體的雜交瘤細胞株(4G6)，3次亞克隆後，全部克隆為陽克隆。採用小鼠單抗分型試紙條測定該單抗為IgG2a型。與其他0ΤΑ、ZEN、AFB1和DON等常見的真菌毒素基本無交叉反應。成功篩選得到抗桔青黴素單克隆抗體。
[0022]實施例2.天然單域重 鏈抗體噬菌體展示文庫的構建及鑑定 (一)天然單域重鏈抗體噬菌體展示文庫的構建
從兩隻健康未免疫的羊駝白細胞中提取總RNA。以Oligo dT反轉錄獲得cDNA，經半巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區編碼基因。將噬菌粒載體pHENl和PCR擴增得到的可變區編碼基因分別用Sfi !,Not I雙酶切後，用T4 DNA連接酶連接過夜，連接產物電轉化至大腸桿菌TGl中，取10 μ L轉化後菌液倍數稀釋測定庫容量。其餘菌液塗布於含100 μ g/mL2XYT培養板上。用含30%甘油的2XYT培養基刮下所有菌落。接種10倍庫容量的活細胞於5mL的2XYT (含2%葡萄糖、100 μ g/mL氨苄青黴素)培養基中，37°C，220r/min培養至OD 600nm達0.5，按感染複數20:1加入輔助噬菌體，371:、2201./!^!!培養60min。將培養物在1000 g離心10min，用50mL的2XYT(含100 μ g/mL氨苄青黴素和50 μ g/mL卡那黴素)培養液重懸沉澱，30°C>220r/min過夜培養，8000g離心取上清，PEG法純化噬菌體，即得到噬菌體展示抗體文庫，取10 μ L測定滴度，其餘分裝於-80°C保存備用。
[0023](二)抗體噬菌體展示文庫的鑑定
隨機挑取40個克隆進行分析，利用載體上的通用引物(M13-R和pHEN-R)進行PCR驗證。其中有35個能擴增出400-750bp條帶，提示文庫的克隆效率約為87%，因此該初級文庫的實際庫容為1.9 X IO7個。
[0024]實施例3.模擬桔青黴素抗原納米抗體的親和淘選及其鑑定 (一)納米抗體的親和淘選
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗CIT單克隆抗體4G6，並以終濃度100 μ g/mL包被於酶標板上，4°C孵育過夜。第二天用PBST (PBS包含0.1% Tween-20 (v/v))洗滌10次後，加入300 μ I封閉液(3% BSA-PBS)4°C孵育I小時。I小時後棄封閉液，用PBST洗滌5次，加入100 μ I製備的噬菌體展示抗體文庫(用PBS稀釋噬菌體至約1.0 X IO11 c.f.u)，37°C孵育反應I小時。棄去未結合的噬菌體，用PBST洗滌10次，結合上的噬菌體用0.2 MGlycine-HCl (pH 2.2)洗脫，並立即用 15 μ I I M Tris-HCl (pH 9.1)中和。取 10 μ I洗脫噬菌體測定滴度，其餘的用於感染20mL生長至對數前期的疋coli TGl菌株進行擴增。次日用PEG/NaCl沉澱純化噬菌體，並測定擴增後噬菌體的滴度。噬菌體回收率按以下公式計算:回收率=(洗脫噬菌體/投入噬菌體)X 100%。
[0025]在隨後三輪淘選過程中，包被的抗CIT單克隆抗體濃度分別為75 μ g/mL, 50 μ g/mL，25y g/mL，並用CIT標品溶液替代酸洗脫液，進行競爭洗脫。洗脫噬菌體的擴增同上。
[0026](二)陽性噬菌體克隆的鑑定
從平板上隨機挑取30個噬菌體克隆進行擴增。用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗CIT單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05%Tween-20 (v/v))洗滌3次後，用含有4%脫脂奶粉的PBS進行封閉，37°C孵育I小時。投入100 μL擴增後的噬菌體克隆，以原始噬菌庫體作為陰性對照，噬菌體濃度梯度稀釋，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育I小時。然後用TMB底物顯色，酶標儀(Thermo Scientific, USA)讀取450 nm處的吸收值。選取OD45c!大於陰性對照2倍的噬菌體克隆為陽性克隆。
[0027](三)噬菌體競爭結合實驗
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗CIT單克隆抗體，10 Pg/mL包被96孔酶標板，4°C孵育過夜。第二天用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次後，用含有4%脫脂奶粉的PBS封閉，37°C孵育I小時。投入50 μL噬菌體和50 μL CIT (100ng/mL)，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育0.5小時。然後用TMB底物顯色，讀取OD450。能結合抗CIT單克隆抗體，且能被CIT標準品阻斷的噬菌體pHEN-X27，鑑定為模擬桔青黴素抗原的陽性克隆。
[0028]實施例4.編碼模擬桔青黴素抗原的納米抗體基因的測序及胺基酸序列的確定 將前述得到的陽性克隆PHEN-X27進行擴增，菌液送自南京金斯瑞測序公司測序。依據
測序結果及密碼子表可獲得該納米抗體的胺基酸序列為:QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAGSGRTFNRYPMSWFRQVPGKEREFVAEINWSGSSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVFLQMSSLKPEDTAVYYCAAGSPGRYDYWGQGTQVTVSS。
[0029]實施例5.模擬桔青黴素抗原的納米抗體的大量製備 (一)以噬菌體擴增的方式製備
將展示有含有模擬桔青黴素抗原的納米抗體陽性克隆子的TGl菌液加入至20mL2XYT (含有氨苄青黴素)液體培養基中，培養至對數生長期，加入輔助噬菌體進行救援。37°C孵育I小時後離心，用等體積培養基2 X YT (含有氨苄青黴素和卡那黴素)重懸菌體後，30°C搖床培養過夜。次日離心後，取上清加入1/5體積的PEG/NaCl，4°C靜置2小時。離心後，棄上清，加入ImL PBS重懸沉澱，即為噬菌體擴增液。
[0030](二)以納米抗體蛋白的方式製備
從含有模擬桔青黴素抗原的納米抗體陽性克隆子的TGl菌液提取質粒後，經Afco I和Not I雙酶切後回收編碼抗體的基因片段，然後亞克隆至表達載體pET-25b (+) (Novagen公司，加入6個組氨酸標籤)，電轉化至Rosetta (DE3)感受態細胞中。塗布於LB-A(含氨苄青黴素)固體培養基中，37°C培養過夜，得到陽性克隆。
[0031]將上述得到的陽性克隆子，從平板上挑單菌落接種於5mL LB-AC (含氨苄青黴素和氯黴素)液體培養基中，37°C培養過夜。將過夜培養物按1%接種量(v/v)接種於50mL的LB-AC培養基中，370C，200r/min振蕩培養1-2小時，當培養物細菌濃度0D600達到0.7-0.9時，加入終濃度為0.1 mM的IPTG誘導，30°C振蕩培養6_8小時。離心收集菌體沉澱，重懸於I mL PBS溶液中，超聲破碎後，離心取上清。經過Ni柱純化後，得到較高純度的納米抗體蛋白。
[0032]實施例6.模擬桔青黴素抗原的納米抗體作為競爭抗原在ELISA中的應用 (一)樣品提取
取紅曲液態發酵樣品2 mL，加入甲醇萃取後用PBS調至甲醇終濃度為10%，樣品待測。
[0033](二)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗CIT單克隆抗體，0.75 Pg/mL包被於96孔酶標板，4°C孵育過夜。次日用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次後，用含有4%脫脂奶粉的PBS封閉，37°C孵育I小時後，再用PBST洗滌3次，4°C保存待用。
[0034](三)標準曲線的建立
取出經上述步驟處理的酶標板，每孔分別投入50 μL表面展示有納米抗體的噬菌體和一系列不同濃度的50 μL CIT標準品，37°C孵育I小時。加入1:5000稀釋HRP標記的抗M13噬菌體二抗，37°C孵育0.5小時。然後用TMB底物顯色，讀取0D45(I。以CIT濃度對數為橫坐標，結合率(加入CIT的孔的OD450/未加入CIT孔的OD45tlX 100%)為縱坐標，結果顯示標準曲線呈S型，線性相關性較好，檢測範圍1.50 - 45.94 ng/mL, IC50為11.55 ng/mL (圖1)。
[0035](四)樣品的檢測
取出處理好的酶標板，每孔分別投入50 μL表面展示有納米抗體的噬菌體和待測樣品提取液，其餘步驟同上述步驟。根據標準曲線，倒推出樣品中CIT的含量。
[0036]實施例7.模擬桔青黴素抗原的納米抗體作為固相抗原在ELISA中的應用 (一)樣品提取
取紅曲大米固體發酵樣品lg，加入5mL甲醇超聲萃取20 min後，靜置30min，將上清液轉入具塞試管中。殘渣再加5mL甲醇超聲萃取，共萃取3次，合併上清液。取適量用PBS調至甲醇終濃度為10%後待測。
[0037](二)包被及封閉
用10 mM PBS (pH 7.4)稀釋抗納米抗體至終濃度1.8 Pg/mL，取100μΙ包被於96孔酶標板，4°C孵育過夜。次日用PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v))洗滌3次後，用含有4%脫脂奶粉的PBS封閉，37°C孵育I小時後，再用PBST洗滌3次，4°C保存待用。
[0038](三)標準曲線的建立
取出經上述步驟處理的酶標板，每孔分別投入50 41濃度為3.5 Pg/mL抗CIT單克隆抗體和一系列不同濃度的50 μL CIT標準品，37°C孵育I小時。加入1:2000稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗，37°C孵育0.5小時。然後用TMB底物顯色，讀取0D.。以CIT濃度對數為橫坐標，結合率(加入CIT的孔的OD45tl/未加入CIT孔的OD45tlX 100%)為縱坐標，結果也顯示標準曲線呈S型，線性相關性較好，檢測範圍12.14-196.35 ng/mL, IC50為48.94 ng/mL(圖 2)。
[0039](四)樣品的檢測取出處理好的酶標板，每孔分別投入50 μL濃度為3.5Pg/mL抗CIT單克隆抗體和待測樣品提取液，其餘步驟同上述步驟。根據標準曲線，倒推出樣品中CIT的含量。
[0040]實施例7:易錯PCR法對模擬桔青黴素抗原的納米抗體進行改造
以噬菌粒pHEN-X27作為模板，易錯PCR向X27的DNA序列片段中隨機引入突變，上遊引物 F:5』 -TCG CGG CCC AGC CGG CCA TGG CCC AGT TGC AGC TG -3』，下遊引物 R:5』_CGA GTG CGG CCG CTT GTG GTT TTG GTG TCT TGG G- 3』。50 μ L 易錯 PCR 體系如下:5μ L IOX 易錯PCR緩衝液(500 mmol/L KCl, 70 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L Tris-HCl pH8.3，0.1%(W/V，明膠));0.5 mmol/L dATP/dGTP, 2.5 mmol/L dCTP/dTTP;引物 F/R 各 40pmol ；MgCl2 7 mmol/L ；MnCl2 0.3 mmol/L ；Taq DNA 聚合酶 2.5 U, ddH20 補至 50 μ L。PCR擴增條件:94° C，3 min ；94° C I min, 59° C I min, 72° C 2 min，30 個循環；72。C 10min。易錯PCR擴增產物經DNA純化試劑盒純化後，用限制性內切酶SfiI和? I對擴增產物和噬菌粒pHENl進行酶切，酶切產物經凝膠純化試劑盒純化後進行連接，轉化至大腸桿菌TGl感受態細胞，塗布LBA平板，37° C過夜培養。將獲得的轉化子用輔助噬菌體KM13進行救援，得到展示突變的X27片段的噬菌體展示突變文庫。
[0041]採用應用實例3中的親和淘選和鑑定的方法，獲取具有與原始單域重鏈抗體X27同樣性質(即與天然桔青黴素分子相似的反應特性，能與抗桔青黴素單克隆抗體或多克隆抗體結合)的突變體，這些突變體的胺基酸序列具有與抗桔青黴素單克隆抗體或多克隆抗體結合活性，由(a)衍生 的與(a)具有90%以上同源性。
【權利要求】
1.模擬桔青黴素抗原的納米抗體，其特徵如(a)或(b)所述:(a)、具有SEQID N0.:1所示的胺基酸序列；或(b)、將(a)中的胺基酸序列經過一個或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有針對抗桔青黴素單克隆抗體或多克隆抗體結合活性的由(a)衍生的與(a)具有90%以上同源性的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1所述模擬桔青黴素抗原的納米抗體的核苷酸。
3.包含權利要求2所述核苷酸序列的載體。
4.包含權利要求3所述的載體的宿主細胞。
5.根據權利要求1所述納米抗體的製備方法，其特徵在於通過噬菌體擴增或基因工程重組表達的方式進行大量製備；所述噬菌體擴增是指將展示模擬桔青黴素抗原的納米抗體的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖展示有納米抗體的噬菌體粒子；所述基因工程重組表達的方式是指將編碼納米抗體的基因，通過克隆至表達載體，以抗體蛋白的形式大量製備。
6.權利要求1所述模擬桔青黴素抗原的納米抗體在免疫學檢測分析中的應用。
7.根據權利要求6所述應用，其特徵在於該納米抗體以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應 用。
【文檔編號】C07K16/42GK103965358SQ201410160576
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】李燕萍, 許楊, 熊亮, 何慶華 申請人:南昌大學