婦科千金方組合物聯合抗生素在製備降低血液粘度藥物方面的應用的製作方法
2023-12-06 13:54:21 1
本發明涉及醫藥技術領域，更具體地，涉及一種婦科千金方組合物聯合抗生素在製備降低全血粘度藥物方面的應用。
技術背景
血液粘度增高會引起血流阻力增加，使血流速度減慢，最後導致血流停滯，直接影響臟器血液供應，導致疾病。全血粘度增高常見於：血漿蛋白異常，如巨球蛋白血症、多發性骨髓瘤、先天性高纖維蛋白血症等，由於血漿中蛋白的含量異常增高，使血漿粘度增高，進而使全血粘度增高。
近年來，隨著中醫藥現代化進程加速，中西藥聯合應用日趨廣泛。婦科千金片主要由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木(十大功勞)、單面針、當歸、雞血藤、黨參八味藥組成，為臨床治療慢性盆腔炎的常用藥，臨床對慢性盆腔炎的治療亦常採用中西醫結合療法或中藥與抗生素聯合應用。阿奇黴素適用於敏感細菌所引起的感染，包括支氣管炎、肺炎等下呼吸道感染，皮膚和軟組織感染，急性中耳炎，鼻竇炎、咽炎、扁桃體炎等上呼吸道感染。近年來，大量研究報導婦科千金片與阿奇黴素聯合應用治療慢性盆腔炎療效顯著提高，且不良反應發生率明顯降低。研究表明，婦科千金片聯合阿奇黴素對慢性婦科炎症的療效優於單用阿奇黴素，因此臨床上常將兩者合用治療慢性婦科炎症疾病，相關婦科千金片與抗生素聯合應用的研究也多集中在二者聯用治療慢性婦科炎症方面。研究領域和應用領域相對局限。
目前未見婦科千金方組合物與抗生素聯合應用於製備降低全血粘度藥物組合物方面的相關技術報導。
技術實現要素：
本發明要解決的技術問題是填補現有婦科千金方組合物聯合阿奇黴素的應用技術不足，提供婦科千金方組合物聯合抗生素在製備降低血液粘度藥物方面的應用。
本發明的目的通過以下技術方案予以實現：
提供婦科千金方組合物聯合抗生素在製備降低血液粘度藥物組合物方面的應用，所述抗生素為阿奇黴素。尤其是在製備降低全血低切還原粘度和/或全血粘度藥物組合物方面的應用。
優選地，所述婦科千金方組合物聯合阿奇黴素在同時降低全血低切還原粘度和全血粘度方面起到具有明顯的作用，可以改善「血瘀」這一病理狀態。
優選地，所述婦科千金方組合物中，當歸、黨參、穿心蓮和單面針的摻入量各為藥材總重量的9％；金櫻根、雞血藤、功勞木和千斤拔的摻入量各為藥材總重量的16％。
優選地，所述婦科千金方組合物為婦科千金片或婦科千金膠囊。
本發明的有益效果如下：
阿奇黴素適用於敏感細菌所引起的感染，包括支氣管炎、肺炎等下呼吸道感染，皮膚和軟組織感染，急性中耳炎，鼻竇炎、咽炎、扁桃體炎等上呼吸道感染。婦科千金片主要由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、功勞木、單面針、當歸、雞血藤、黨參八味藥組成，目前有報導將阿奇黴素與婦科千金片聯合應用於治療盆腔炎等婦科炎症，但都是從二者聯合抗炎角度進行研究和應用，受到很大的局限。更重要的是，聯合應用的機理並不明晰。本發明另闢蹊徑，總結髮現婦科千金片聯合阿奇黴素在降低血液粘度方面良好的應用效果，並通過大量動物實驗證明婦科千金片對阿奇黴素改變血流變指標具有確切的影響作用，為中藥組合物和阿奇黴素的新領域應用都提供了有力技術支持。
附圖說明
圖1藥物聯合治療前後全血低切還原粘度變化情況。
圖2藥物聯合治療前後全血高切還原粘度變化情況。
圖3藥物聯合治療前後高切相對指數變化情況。
圖4藥物聯合治療前後低切相對指數變化情況。
圖5藥物聯合治療前後壓積變化情況。
圖6藥物聯合治療前後全血粘度變化情況。
圖7藥物聯合治療前後紅細胞剛性指數變化情況。
圖8藥物聯合治療前後紅細胞聚集指數變化情況。
圖9藥物聯合治療前後紅細胞變形指數變化情況。
具體實施方式
下面結合具體實施例進一步說明本發明。下述實施例僅用於示例性說明，不能理解為對本發明的限制。除非特別說明，下述實施例中使用的原料為常規市購或商業途徑獲得的原料，除非特別說明，下述實施例中使用的方法和設備為本領域常規使用的方法和設備。
實施例1
1.實驗菌種：金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，大腸埃希菌(ATCC25922)購
買於中國國家菌種庫。受試菌株凍乾粉用無菌M-H(B)培養基混懸後均勻鋪於無菌M-H(A)平板表面，35℃孵育過夜復活，18h後平板表面生長出菌苔，選取其中長勢良好的單一菌團，重新塗抹於M-H(A)斜面，相同條件下孵育18h，密封，4℃條件下冷藏保存；試驗前一天取斜面菌塗抹於M-H(A)平板，35℃孵育過夜，即可使用。所有操作均在超淨工作檯完成。
2.菌液製備方法
方法一：(高濃度菌液製備)
挑3～4個單菌落於40毫升的M-H(B)培養基中。受試菌隔夜增菌培養16小時(37℃，水浴搖床振搖16小時)，次日取出原菌液用全波長多功能讀數議測OD值(細菌生長飽和期)；取20mL，分裝於離心管中，每管2mL，離心10000～15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液之中的M-H(B)，用2mL生理鹽水混勻後，再離心15000rpm/min，10分鐘，棄取上清液中的生理鹽水，收集細菌細胞菌體2mL。將相同方法培養的金色葡萄球菌和大腸埃希菌按1：1混合即獲得4mL混合菌液。將該菌液為100菌液濃度，用生理鹽水進行10倍稀釋，稀釋至0.1×100，0.01×100，備用(共3個劑量)。
方法二：(低濃度菌液製備)
挑單一菌落(包括金色葡萄球菌和大腸埃希菌)於2毫升的生理鹽水中，分別配製成為0.5麥氏濃度(約1×108CFU·mL－1)細菌混懸液，將金色葡萄球菌和大腸埃希菌混懸液混合，即得到混合菌液4mL。將該菌液設置成為10A菌液濃度，用生理鹽水進行對倍稀釋，稀釋至0.5×10A，0.25×10A，備用(共3個劑量)。
經大量實驗總結，方法(一)為受試菌最佳培養方式；0.01×100，為最佳感染菌量；實驗方法可以複製大鼠盆腔細菌慢性感染所致「血淤」模型。後續實驗採用方法(一)的培養方式，感染菌量為0.01×100。
3.藥品與試劑：M-H(A)培養基(OXOID公司，生產批號：CM0337A)；M-H(B)培養基(OXOID公司，生產批號：CM0405B)；烏拉坦溶液(20％)；生理鹽水(四川科倫藥液股份有限公司，生產批號：M12012004)；其他試劑和耗材均由成都雅榮生化設備經營部購買提供。婦科千金片或婦科千金膠囊購自株洲千金藥業股份有限公司。
4.儀器：電熱恆溫培養箱(上海一恆科技有限公司，BPH-9162)；優普系列超純水機(成都超純科技有限公司，UpK-1-10T)；微量加樣器(EppendorfResearch，10、100、100uL)；空氣浴振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發，HZQ-C)；自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠，LDZX-40BI)；全波長多功能讀數議(美國Thermo)；菌落計數儀。
5.炎症導致「血瘀」模型製備
本發明人基於長期大量的研究，分析總結血液的活動性不僅是保證血液正常循環活動和組織器官正常的血液供給，也是促使組織和器官執行其正常生理功能和維持機體內環境恆定的重要因素，以及影響機體免疫功能和體液調節功能的重要因素。血流變學的改變主要包括毛細血管通透性增高，血流速度減慢及血液粘滯性增高等異常情況。血液流變性異常可導致血液循環和微循環的障礙，引起組織缺血、缺氧、代謝和功能失調等一系列嚴重後果。大量臨床試驗研究已證實CPID患者大都存在著不同程度的血液流變學的異常，與正常婦女比較有顯著性差異，即血液都處於「濃、黏、凝、聚」狀態，當血液黏度增高時血液流量減少，易造成組織缺血致血瘀。為順利實現驗證本發明方法，本實施例選擇建立炎症反應導致的「血淤」型實驗模型進行血液粘度變化的研究。
具體操作方法：大鼠稱重標記，腹部常規消毒，20％烏拉坦0.5mL/100g腹腔注射麻醉，用1mL注射器抽取預先製備的混合菌液，左手持鼠尾提起大鼠，用10mL注射器磨去針頭尖，於陰道底部的子宮頸分叉處小心進入一側宮腔內，針頭在宮腔內來回抽拉2次以機械性損傷子宮內膜組織，然後朝卵巢方向推注菌液0.1mL，同樣操作步驟將0.1mL菌液注入另一側子宮，注射完畢後，倒置大鼠5min，以防菌液漏出。分別於24h，48h觀察記錄各組大鼠感染情況，以大鼠無死亡，於造模後24h、72h、96h後分別陰道刮片，進行菌落培養，選擇菌落計數≥30，≤100的感染菌量作為最佳感染菌量。將該菌量作為體內感染的菌量。受試大鼠感染菌量為：
表1
所有實驗動物於造模後24h、72h和96h，麻醉，常規消毒腹部，用無菌棉籤伸入宮口，來回抽拉2次後，將棉籤放入含2mL生理鹽水的試管中，獲得含測試品混懸液，取出棉籤，再用新的無菌棉籤充分蘸取混合液均勻塗抹於無菌M-H(A)平板表面，35℃孵育過夜，18h後進行菌落計數。240h犧牲動物，觀察子宮感染情況。各組典型鼠感染菌落計數，結果如下表2：
表2受試大鼠感染菌量
所有實驗動物於造模後24h、72h和96h，麻醉，常規消毒腹部，用無菌落計數結果顯示，3組鼠所感染菌量符合實驗要求。同時，解剖後可見子宮等直觀可見炎性充血與炎性水腫。
6.試驗過程
模型大鼠隨機分為5組，即model、AZM、AZMQR、AZMDG、AZMFF(分別表示不予治療的模型組、單獨使用阿奇黴素組、阿奇黴素清熱合併組、阿奇黴素缺當歸合併組、阿奇黴素全方合併組)。
Model：不予治療的模型組；
AZM：阿奇黴素治療模型組。
AZMQR：阿奇黴素+以千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針按照婦科千金片配方中的比例和方法製得組合物聯合治療模型組。
AZMDG：阿奇黴素+以千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、雞血藤、黨參按照婦科千金片配方中的比例和方法製得製得組合物聯合治療模型組。
AZMFF：阿奇黴素+婦科千金片(包括千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、當歸、雞血藤、黨參成分，株洲千金藥業股份有限公司出品)聯合治療模型組。
1.受試劑量
(1)AZM劑量：本實施例對阿奇黴素(AZM)的可選受試劑量進行了分析和確定，目的為選擇一個試用後作用強度適中、時長適中的受試劑量，同時明確同中藥合併用藥時的時程長度。預試60、30、20、10mg/kg.d三天，發現原設定劑量過高，最終採用10mg/kg.d。
(2)受試藥物劑量：
原設定婦科千金方全方(AZMFF)為2.058g/kg.d，但預試發現，此劑量採用最大給容積配製的給藥液為稀漿狀，無法通過灌胃針頭。隨調整最終全方AZMFF給藥劑量為最大給藥量1.66g/kg.d，調整缺當歸組劑量DG為1.41g/kg.d、清熱組劑量QR為1.16g/kg.d。
2.給藥時間
除空白和模型外，造模後第六日開始給予相應藥物。AZM與各中藥分別給予，相差時間約2小時。所有給藥組在8點左右均先給予相應劑量的AZM，兩個小時後開始給予相應的中藥生理鹽水水混物。
3.樣本收集
第1日給予AZM兩小時後，經尾靜脈採集各組大鼠末梢靜脈血。從第二日始各給藥組大鼠每日兩次採血，於給予阿奇前和給予中藥前各經尾靜脈採集一次，每次採集血量約0.3mL，取樣時間誤差約30min。於給藥第2、4、6、8日給予AZM兩小時後，各組麻醉後犧牲約2～4隻大鼠，採集下腔動脈抗凝全血。
4.送樣測試
所有時間點0.3mL及末次全血，末次抗凝全血送檢血細胞計數、血流變。
實驗結果見圖1至圖9所示。每個附圖中，從左至右分別顯示為AMZ、AMZDG、AZMFF、AZMQR、Model和正常組normal的指數變化情況。結果顯示，實驗動物造模後，全血低切還原粘度、全血粘度和紅細胞聚集指數，與正常組比較均升高，給予不同的藥物組合治療後，各指數都降低，趨向於回復正常水平。各治療組之間的治療效果比較，全血低切還原粘度：AZMFF>AZM>AZMDG>AZMQR；全血粘度：AZMFF>AZMDG>AZMQR>AZM。試驗證明，婦科千金方聯合阿奇黴素在血液流變狀態改變中起到有效作用，尤其是在降低全血低切還原粘度和/或全血粘度方面起到具有明顯的作用，可以改善炎症引致的「血瘀」這一病理狀態。
實施例2應用於改善其他血瘀症狀的試驗
1.大鼠急性血瘀模型：
健康SPF級SD大鼠，220g±20g，雌性，60隻。由四川省醫學科學院實驗動物研究所購得，實驗動物生產許可證號：SCXK(川)2008-24)。大鼠皮下注射0.8mg﹒kg-1鹽酸腎上腺素(天津金耀胺基酸有限公司)、冰浴時間4min、最後一次注射鹽酸腎上腺素後間隔12h頸總動脈後插管取血。
2.模型分組和給藥
大鼠隨機分成3組，每組20隻：對照Ⅰ組(灌胃等體積生理鹽水)；血瘀模型Ⅰ組每日早晚分別灌胃給藥1次，共7次。(可於第7次給藥後頸總動脈取血，進行測定。測定可以採用LG-R-80B電腦血液粘度測試儀測定全血粘度，用溫氏管法測定血沉和紅細胞壓積，驗證是否成功造模。
3.實驗過程和結果
高血粘度模型大鼠隨機分為3組，即model、AZM、AZMFF(分別表示不予治療的模型組、單獨使用阿奇黴素組、阿奇黴素與婦科千金片全方合併組)。
Model：不予治療的模型組；
AZM：阿奇黴素聯合治療模型組。
AZMFF：阿奇黴素+婦科千金片(主要成分為千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、當歸、雞血藤、黨參，株洲千金藥業股份有限公司出品)聯合治療模型組。
A.AZM劑量：本實施例對阿奇黴素(AZM)的可選受試劑量進行了分析和確定，目的為選擇一個試用後作用強度適中、時長適中的受試劑量，同時明確同中藥合併用藥時的時程長度。預試60、30、20、10mg/kg.d三天，發現原設定劑量過高，最終採用10mg/kg.d。
B.受試藥物劑量：
原設定婦科千金方全方(AZMFF)為2.058g/kg.d，但預試發現，此劑量採用最大給容積配製的給藥液為稀漿狀，無法通過灌胃針頭。隨調整最終全方AZMFF給藥劑量為最大給藥量1.66g/kg.d。
(2)給藥時間
除空白和模型外，造模後第六日開始給予相應藥物。AZM與各中藥分別給予，相差時間約2小時。所有給藥組在8點左右均先給予相應劑量的AZM，兩個小時後開始給予相應的中藥生理鹽水水混物。
(3)樣本收集
第1日給予AZM兩小時後，經尾靜脈採集各組大鼠末梢靜脈血。從第二日始各給藥組大鼠每日兩次採血，於給予阿奇前和給予中藥前各經尾靜脈採集一次，每次採集血量約0.3mL，取樣時間誤差約30min。於給藥第2、4、6、8日給予AZM兩小時後，各組麻醉後犧牲約2～4隻大鼠，採集下腔動脈抗凝全血。
(4)送樣測試
所有時間點0.3mL及末次全血，末次抗凝全血送檢血細胞計數、血流變。實驗效果標準：
1.顯效：用藥後全血粘度降至正常範圍者。
2.有效：全血粘度較前下降至接近參考值。
3.無效：血粘度下降不明顯者。
Model和AZM的各20例中，顯效0例，佔0％；有效0例，0％；無效20例，佔100％；總有效率為0％。AZMFF 20例中，顯效6例，佔30％；有效11例，55％；無效3例，佔15％；總有效率為85％。
實施例3應用於改善其他高血粘度症狀的試驗
1.動物和分組：健康SPF級SD大鼠，220g±20g，20隻。由四川省醫學科學院實驗動物研究所購得，實驗動物生產許可證號：SCXK(川)2008-24)。大鼠隨機分成4組，每組5隻：對照Ⅰ組(生理鹽水NS)；對照Ⅱ組(NS)；高血粘度Ⅰ組(高分子右旋糖酐，High Molecular Dextran，HMD)；高血粘度Ⅱ組(HMD)。
2.高血粘度模型製備：
高血粘度Ⅰ組：尾靜脈緩慢注射10％高分子右旋糖酐溶液(瑞士Amersham Biosciences公司)，20mL/kg，每天1次，連續3d。
高血粘度Ⅱ組：尾靜脈緩慢注射10％高分子右旋糖酐溶液(瑞士Amersham Biosciences公司)，20mL/kg，每天1次，連續6d。
3.血粘度的檢測：所有動物於最後一次注射後20min，摘眼球取血，肝素抗凝檢測全血粘度，驗證是否成功造模。
4.統計學處理：實驗數據以表示，採用SPSS8.0統計軟體，用t檢驗進行兩組間血粘度的顯著性檢驗，P＜0.05為顯著性標準。
3.實驗過程和結果
高血粘度模型大鼠隨機分為3組，即model、AZM、AZMFF(分別表示不予治療的模型組、單獨使用阿奇黴素組、阿奇黴素與婦科千金片全方合併組)。
Model：不予治療的模型組。
AZM：阿奇黴素聯合治療模型組。
AZMFF：阿奇黴素+婦科千金片(主要成分為千斤拔、穿心蓮、金櫻根、功勞木、單面針、當歸、雞血藤、黨參，株洲千金藥業股份有限公司出品)聯合治療模型組。
(1)受試劑量
A.AZM劑量：本實施例對阿奇黴素(AZM)的可選受試劑量進行了分析和確定，目的為選擇一個試用後作用強度適中、時長適中的受試劑量，同時明確同中藥合併用藥時的時程長度。預試60、30、20、10mg/kg.d三天，發現原設定劑量過高，最終採用10mg/kg.d。
B.受試藥物劑量：
原設定婦科千金方全方(AZMFF)為2.058g/kg.d，但預試發現，此劑量採用最大給容積配製的給藥液為稀漿狀，無法通過灌胃針頭。隨調整最終全方AZMFF給藥劑量為最大給藥量1.66g/kg.d。
(2)給藥時間
除空白和模型外，造模後第六日開始給予相應藥物。AZM與各中藥分別給予，相差時間約2小時。所有給藥組在8點左右均先給予相應劑量的AZM，兩個小時後開始給予相應的中藥生理鹽水水混物。
(3)樣本收集
第1日給予AZM兩小時後，經尾靜脈採集各組大鼠末梢靜脈血。從第二日始各給藥組大鼠每日兩次採血，於給予阿奇前和給予中藥前各經尾靜脈採集一次，每次採集血量約0.3mL，取樣時間誤差約30min。於給藥第2、4、6、8日給予22AZM兩小時後，各組麻醉後犧牲約2～4隻大鼠，採集下腔動脈抗凝全血。
(4)送樣測試
所有時間點0.3mL及末次全血，末次抗凝全血送檢血細胞計數、血流變。實驗效果標準：
1.顯效：用藥後全血粘度降至正常範圍者。
2.有效：全血粘度較前下降至接近參考值。
3.無效：血粘度下降不明顯者。
Model和AZM的各20例中，顯效0例，佔0％；有效0例，0％；無效20例，佔100％；總有效率為0％。AZMFF 20例中，顯效5例，佔25％；有效12例，60％；無效3例，佔15％；總有效率為85％。