一種抗弓形蟲單克隆抗體及其製備方法與應用的製作方法
2023-11-11 01:11:47 1
一種抗弓形蟲單克隆抗體及其製備方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種抗弓形蟲單克隆抗體及其製備方法與應用,屬於生物製品領域。本發明通過人胚肺成纖維細胞培養弓形蟲,對收穫的弓形蟲純化後反覆凍融,免疫小鼠,取脾與骨髓瘤細胞SP2/0融合,篩選得到一株穩定分泌弓形蟲單克隆抗體的雜交瘤細胞株,其保藏編號為CGMCC No.9559,其分泌的單克隆抗體效價高,特異性好,可用於弓形蟲的檢測,也可用於製備檢測弓形蟲的試劑盒或診斷試劑,檢測結果準確率高,在弓形蟲診斷領域具有較好應用前景。CGMCC No955920140812
【專利說明】一種抗弓形蟲單克隆抗體及其製備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物製品領域與疫苗學領域,具體地,涉及一種抗抗弓形蟲的單克隆 抗體及產生該抗體的雜交瘤細胞株和應用,以及製備該單克隆抗體的方法。
【背景技術】
[0002] 弓形蟲又名剛地弓形蟲,呈全球分布,在人和多種動物中都能造成廣泛的流行,給 人畜均造成嚴重的危害。弓形蟲人群的感染率各地不同,許多國家和地區感染率為25%? 50%,高者達80%以上,推算全球平均感染率在25%左右,佔世界人口的四分之一。我國人 群弓形蟲感染率為4%?9%,被列為"TORCH症候群"的首要病原體,可經胎盤垂直傳播造 成流產,胎兒畸形,死胎等嚴重後果。
[0003]目前弓形蟲的診斷檢測方法很多,病原學方法是最準確的確診手段,但是此方法 靈敏度較低,易漏檢。分子生物學診斷方法對實驗室條件和操作人員技術要求較高,不適於 廣泛應用。酶聯免疫吸附法(ELISA)具有簡單、快速、結果明確、操作簡單等優點,已成為臨 床及檢疫診斷領域發展的一個方向。因此,為了提高檢測弓形蟲的敏感性和特異性,建立一 種快速、簡易和特異性好的診斷方法是十分必要的,而製備出高親和力的單克隆抗體是其 前提。
[0004] 在已報導的弓形蟲單克隆抗體製備方法中,根據免疫小鼠的抗原和抗原的來源不 同,有3種方法。一是通過表達弓形蟲的某一個蛋白(?30、5461、5八62、6狀3等)用做免疫 小鼠的抗原來製備單抗,該方法製備的單抗抗體效價要低於用弓形蟲做抗原製備的單抗。 二是從淋巴細胞分離液中分離純化弓形蟲,破碎弓形蟲用於免疫小鼠製備單克隆抗體。三 是將弓形蟲注射到小鼠腹腔,從抽取的腹水中分離純化速殖子,破碎速殖子用於免疫小鼠 製備單克隆抗體。第二種方法不適於弓形蟲的大批量擴繁。第三種方法在弓形蟲大批量制 備過程中存在成本高,耗時長,得到的弓形蟲數量不足等缺點。因此,第二種方法和第三種 方法不易獲取大量的速殖子用於製備弓形蟲的單克隆抗體。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於提供一種抗弓形蟲單克隆抗體的製備方法。
[0006] 本發明的另一目的在於提供利用上述方法獲得的能夠穩定分泌高效抗弓形蟲單 克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0007] 本發明的再一個目的在於提供一種生物活性高、特異性高的抗弓形蟲單克隆抗 體,用於檢測弓形蟲。
[0008] 為了達到上述目的,本發明首先提供一種製備抗弓形蟲單克隆抗體的方法,是採 用人胚肺成纖維細胞培養弓形蟲,收穫的弓形蟲純化後再免疫小鼠,取脾與骨髓瘤細胞 SP2/0融合,篩選雜交瘤細胞株製備腹水,得到抗弓形蟲單克隆抗體。
[0009] 本發明方法中,使用的人胚肺成纖維細胞是已經商品化應用的保藏編號為 CGMCC. 4875的人胚肺成纖維細胞。
[0010] 具體地,本發明方法用含8%?10%新生牛血清的MEM培養人胚肺成纖維細胞, 待細胞長成單層後棄掉原培養基,換成含1 %?3 %新生牛血清MEM,然後接種弓形蟲,接種 M0I為0. 1?0. 5,5?9天後,待細胞CPE達到80%以上時收穫弓形蟲。優選7天後收穫 弓形蟲。
[0011] 在本發明的製備抗弓形蟲單克隆抗體的方法中,收穫的弓形蟲在純化前還需滅 活。在本發明的一個實施例中了,滅活方法是經56°C水浴滅活30min。
[0012] 對收穫並滅活後的弓形蟲通過蔗糖梯度離心進行純化。
[0013] 具體的純化方法為:將收穫的弓形蟲滅活後靜置,去除細胞及細胞團;蔗糖密度 梯度離心:先添加待離心的弓形蟲樣品,再加入低糖,再加入高糖,低糖和高糖按體積比 1:1添加,其中低糖的質量分數為15%?20%,高糖的質量分數為50%?55%,10000g? 20000g離心 30min?60min。
[0014] 純化後的弓形蟲蟲體反覆凍融5-10次後,與弗氏完全佐劑等體積混合乳化,免疫 注射小鼠。
[0015] 優選地,反覆凍融7次。
[0016] 本發明方法中,純化後的弓形蟲共免疫小鼠4次。免疫後檢測抗體效價,若抗體效 價不低於1 :1〇〇〇〇,採用純化後的弓形蟲腹腔衝擊小鼠,採用小鼠骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠 脾細胞融合技術篩選分泌抗弓形蟲單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0017] 在本發明的一個實施例中,免疫小鼠的方法是將凍融後的蛋白用〇.〇lmol/L的 PBS稀釋至終濃度為500yg/mL,使其與弗氏完全佐劑各取lmL混合乳化;乳化後於BALB/c 小鼠的背部皮下4點免疫注射,0. 2mL/只;首次免疫後的第14天、28天用500yg/mL的弓形 蟲和弗氏不完全佐劑各取lmL混合乳化,於BALB/c小鼠的背部皮下4點免注射,0. 2mL/只; 首次免疫後35天眼框採血,分離血清,ELISA檢測血清中的抗體效價,如果抗體效價不低於 1 :10000,則進行腹腔衝擊,將500iig/mL的弓形蟲注射到BALB/c小鼠腹腔,0.lmL/只。
[0018] 本發明通過上述方法與採用小鼠骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞融合技術篩選 得到分泌抗弓形蟲單克隆抗體的雜交瘤細胞株,於2014年8月12日在中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心保藏(地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號,中國科學院 微生物研究所,簡稱CGMCC,郵編100101),分類命名為弓形蟲單克隆抗體雜交瘤細胞株,其 保藏編號為CGMCCNo. 9559。
[0019] 本發明提供了保藏編號為CGMCCNo. 9559的雜交瘤細胞株在製備預防或治療弓形 蟲藥物中的應用。
[0020] 本發明還提供了由上述雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體。
[0021] 本發明提供了保藏編號為CGMCCNo. 9559的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體在制 備檢測弓形蟲試劑盒中的應用。
[0022] 本發明還提供了一種用於檢測弓形蟲的試劑盒,含有本發明的單克隆抗體。
[0023] 含有本發明單克隆抗體的用於檢測弓形蟲抗體的試劑盒或檢測試劑也屬於本發 明的保護範圍。
[0024] 本發明還提供了一種非疾病診斷目的的檢測弓形蟲的方法,是採用保藏編號為 CGMCCNo. 9559的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體進行檢測的。
[0025] 本發明提供的一種製備弓形蟲單克隆抗體的方法,通過人胚肺成纖維細胞培養弓 形蟲,對收穫的弓形蟲通過蔗糖梯度離心進行純化,純化後的弓形蟲經反覆凍融後,按弓形 蟲蛋白50yg/只免疫小鼠3次,50yg/只加強免疫一次,取脾與骨髓瘤細胞SP2/0融合,篩 選合適的雜交瘤細胞株,用篩選的雜交瘤細胞製備腹水,獲得弓形蟲的單克隆抗體。該方法 同已有的弓形蟲單克隆抗體製備方法相比具有明顯的優勢:一是通過細胞培養解決了弓形 蟲大量培養的問題;二是通過蔗糖梯度離心獲得純度在90%以上的弓形蟲;三是人胚肺成 纖維細胞培養的弓形蟲免疫原性要高於表達的弓形蟲的某一個蛋白,容易篩選到合適的雜 交瘤細胞株。本發明方法篩選得到一株穩定分泌弓形蟲單克隆合適的雜交瘤細胞株,其保 藏編號為CGMCCNo. 9559,其分泌的單克隆抗體效價高,特異性好,可用於弓形蟲的檢測,也 可用於製備檢測弓形蟲的試劑盒或診斷試劑,檢測結果準確率高,在弓形蟲診斷領域具有 較好應用前景
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026] 圖1為接種弓形蟲120h的人胚肺成纖維細胞(100X)
[0027] 圖2為SDS-PAGE鑑定實施例5的已純化的單抗。
【具體實施方式】
[0028] 以下實施例進一步說明本發明的內容,但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下,對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換,均屬於本發明 的範圍。
[0029] 本發明實施例中使用的人胚肺成纖維細胞保藏編號為CGMCCNo. 4875。BALB/c小 鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。若未特別指明,實施例中所用的技術手段為 本領域技術人員所熟知的常規手段;實施例中所用的試劑為市售商品。
[0030] 實施例1免疫原製備與動物免疫(1)
[0031] 1、用人胚肺成纖維細胞培養弓形蟲(見圖1),並對收穫的弓形蟲進行濃縮純化。
[0032] 弓形蟲培養:用含8%新生牛血清的MEM培養人胚肺成纖維細胞,待細胞長成單層 後,棄掉原培養基,加入含1%新生牛血清MEM,接種弓形蟲,接種M0I為0. 1,7天後收穫弓 形蟲。收穫的弓形蟲經56°C水浴滅活30min。
[0033] 弓形蟲純化:靜置45min,自然沉降去除細胞及細胞團;蔗糖密度梯度離心法去除 細胞碎片:蔗糖密度梯度離心:先添加700ml弓形蟲樣品,再加入低糖溶液500ml,再加入高 糖溶液500ml,其中低糖的質量分數為20%,高糖的質量分數為55%,20000g離心30min取 樣鏡檢純化結果。在顯微鏡下觀察(200X)到大量的弓形蟲,沒有雜質,純度達到90%以 上。
[0034] 2、純化好的弓形蟲蟲體反覆凍融7次後,將凍融後蛋白為500iig/mL的弓形蟲與 弗氏完全佐劑各取lmL混合乳化;乳化後於BALB/c小鼠的背部皮下4點免疫注射,0. 2mL/ 只。
[0035] 加強免疫;首次免疫後的第14天、28天用500yg/mL的弓形蟲和弗氏不完全佐劑 各取lmL混合乳化,於BALB/c小鼠的背部皮下4點免注射,0. 2mL/只。首次免疫後35天睛 框採血,分離血清,ELISA檢測血清中的抗體效價。抗體效價為1 :32768,不低於1 :10000。
[0036] 實施例2免疫原製備與動物免疫(2)
[0037] 1、用人胚肺成纖維細胞培養弓形蟲,並對收穫的弓形蟲進行濃縮純化。
[0038] 弓形蟲培養:用含9%新生牛血清的MEM培養人胚肺成纖維細胞,待細胞長成單層 後棄掉原培養基,加入含2%新生牛血清MEM,接種弓形蟲,接種M0I為0. 5, 5天後收穫弓形 蟲。收穫的弓形蟲經56°C水浴滅活30min。
[0039] 弓形蟲純化:靜置30min,自然沉降去除細胞及細胞團;蔗糖密度梯度離心法去除 細胞碎片:蔗糖密度梯度離心:先添加700ml弓形蟲樣品,再加入低糖溶液500ml,再加入高 糖溶液500ml,其中低糖的質量分數為15%,高糖的質量分數為50%,10000g離心60min取 樣鏡檢純化結果。在顯微鏡下觀察(200X)到大量的弓形蟲,沒有雜質,純度達到90%以 上。
[0040] 2、純化好的弓形蟲蟲體反覆凍融10次後,將凍融後蛋白為500i!g/mL的弓形蟲與 弗氏完全佐劑各取lmL混合乳化;乳化後於BALB/c小鼠的背部皮下4點免疫注射,0. 2mL/ 只。
[0041] 加強免疫;首次免疫後的第14天、28天用500yg/mL的弓形蟲和弗氏不完全佐劑 各取lmL混合乳化,於BALB/c小鼠的背部皮下4點免注射,0. 2mL/只。首次免疫後35天睛 框採血,分離血清,ELISA檢測血清中的抗體效價。抗體效價為1:16384,不低於1 :10000。
[0042] 實施例3免疫原製備與動物免疫(3)
[0043] 1、用人胚肺成纖維細胞培養弓形蟲,並對收穫的弓形蟲進行濃縮純化。
[0044] 弓形蟲培養:用含10%新生牛血清的培養人胚肺成纖維細胞,待細胞長成單 層後棄掉原培養基,加入含2 %新生牛血清MEM,接種弓形蟲,接種M0I為0. 1,6天後收穫弓 形蟲。收穫的弓形蟲經56°C水浴滅活30min。
[0045] 弓形蟲純化:靜置60min,自然沉降去除細胞及細胞團;蔗糖密度梯度離心法去除 細胞碎片:蔗糖密度梯度離心:先添加700ml弓形蟲樣品,再加入低糖溶液500ml,再加入高 糖溶液500ml,其中低糖的質量分數為18%,高糖的質量分數為53%,15000g離心45min取 樣鏡檢純化結果。在顯微鏡下觀察(200X)到大量的弓形蟲,沒有雜質,純度達到90%以 上。
[0046] 2、純化好的弓形蟲蟲體反覆凍融5次後,將凍融後蛋白為500iig/mL的弓形蟲與 弗氏完全佐劑各取lmL混合乳化;乳化後於BALB/c小鼠的背部皮下4點免疫注射,0. 2mL/ 只。
[0047] 加強免疫;首次免疫後的第14天、28天用500yg/mL的弓形蟲和弗氏不完全佐劑 各取lmL混合乳化,於BALB/c小鼠的背部皮下4點免注射,0. 2mL/只。首次免疫後35天睛 框採血,分離血清,ELISA檢測血清中的抗體效價。抗體效價為1:16384,不低於1 :10000。
[0048] 實施例4細胞融合與建株
[0049] 實施例1-3方法得到的免疫原的抗體效價均符合製備腹水的要求。本實施例採用 實施例1方法製得的弓形蟲對小鼠進行腹腔衝擊,500yg/mL的弓形蟲注射到BALB/c小鼠 腹腔,0.lmL/只。
[0050] (1)骨髓瘤細胞的準備:細胞融合前兩周復甦培養SP2/0細胞株,融合前3天擴大 培養,融合前1天將細胞培養液去除,重新添加培養液。
[0051] (2)脾細胞製備:處死進行動物免疫的小鼠,按照常規方法製備小鼠脾細胞懸液。
[0052] (3)根據計數結果將脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0分別加入適量無血清1640培養 液,SP2/0細胞晃動混勻,脾細胞吹打均勻。
[0053] (4)將脾細胞與SP2/0細胞按2:1?5:1(本實施例為2:1)的比例混合於一支 50ml離心管中,混勻。
[0054] (5)加無血清1640培養液至50ml,1500rpm離心5min,將上清儘量倒淨,可用移液 器將管口液體吸淨。
[0055] (6)輕擊融合管底,使沉澱細胞鬆散均勻,離心管置於37°C水浴,準備融合。
[0056] (7)將37°C保溫的lmlPEG1500,用滴管緩慢滴入離心管,邊滴邊轉動離心管,使 細胞保存在混勻狀態。
[0057] (8)靜置90s,立即在2?4min(本實施例為3min)內緩慢加入15ml無血清的1640 培養基(37°C),儘可能不攪動細胞。
[0058] (9) 1500rpm離心 5min,棄去上清。
[0059] (10)加入含10%胎牛血清的1640培養液,輕輕混勻,將混懸液分別加至96孔細 胞培養板中,每孔1〇〇U1。
[0060](11)將培養板放到37°C,5%C02培養箱內培養。
[0061] (12)融合第2天,添加HAT培養液,每孔100y1。
[0062] (13)每2?3天換一次HAT培養液,連續兩周觀察雜交瘤是否出現,兩周後換用 HT培養基,觀察融合細胞的生長狀況。
[0063] (14)雜交瘤細胞的篩選:細胞融合後第七天開始觀察雜交瘤細胞生長情況,待細 胞覆蓋孔底面積1/10以上時吸出上清進行抗體ELISA檢測。陽性孔細胞轉入24孔板擴大 培養,及時做亞克隆。
[0064] (15)經3次亞克隆得到穩定分泌抗體的細胞系,命名為Tox-Gl。將雜交瘤細胞 株進行保藏,保藏號CGMCCN0. 9559,分類命名為:弓形蟲單克隆抗體雜交瘤細胞株;保藏 時間:2014年8月12日;保藏單位:中國普通微生物菌種保藏管理中心(ChinaGeneral MicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC),地址北京市朝陽區北辰西路 1 號 院3號,中國科學院微生物研究所,郵編100101。
[0065]實施例5單抗細胞株腹水製備與抗體效價檢測及單抗的純化 [0066] 按常規方法將凍存的實施例4獲得的雜交瘤細胞進行復甦,培養到細胞覆蓋瓶底 的80 %左右時搖下細胞,計數5X106個/mL,腹腔免疫BALB/c小鼠,0. 5mL/只,製備腹水。 [0067] 弓形蟲單抗腹水鑑定:採用間接ELISA法檢測抗體的效價。弓形蟲5iig/ml包被 過夜後檢測腹水的抗體效價,抗體效價為1〇6。具體結果見表1。
[0068] 表1腹水中抗體效價檢測結果
[0069]
【權利要求】
1. 一種製備抗弓形蟲單克隆抗體的方法,其特徵在於,採用人胚肺成纖維細胞培養弓 形蟲,收穫的弓形蟲純化後免疫小鼠。
2. 如權利要求1所述的方法,其特徵在於,人胚肺成纖維細胞長成單層後棄掉原培養 基,換用含1 %?3 %新生牛血清MEM培養基,接種弓形蟲,接種MOI為0. 1?0. 5,培養弓形 蟲5?9天後,待細胞CPE達到80%以上時,收穫弓形蟲。
3. 如權利要求1所述的方法,其特徵在於,對收穫的弓形蟲通過蔗糖梯度離心進行 純化:對收穫的弓形蟲滅活後靜置,去除細胞及細胞團;加入低糖,再加入高糖,低糖和高 糖的體積比為1:1,其中低糖的質量分數為15%?20%,高糖的質量分數為50%?55%, 10000g ?20000g 離心 30min ?60min。
4. 一種抗弓形蟲單克隆抗體雜交瘤細胞株,其保藏編號為CGMCC No. 9559。
5. 權利要求4所述雜交瘤細胞株在製備檢測弓形蟲試劑盒中的應用。
6. 由權利要求4所述雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
7. -種用於檢測弓形蟲或其抗體的試劑盒,其特徵在於,含有權利要求6所述的單克 隆抗體。
8. 含有權利要求6所述單克隆抗體的檢測試劑。
9. 權利要求4所述的雜交瘤細胞株或權利要求6所述的單克隆抗體在製備預防或治療 弓形蟲藥物中的應用。
10. -種非疾病診斷目的的檢測弓形蟲的方法,其特徵在於,採用保藏編號為CGMCC No. 9559的雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體進行檢測。
【文檔編號】C12N5/20GK104387470SQ201410613919
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】童欽, 張星星, 姚志東, 劉可心, 高強, 尹衛東 申請人:北京科興生物製品有限公司