一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法及其試劑盒的製作方法

2023-05-01 01:09:41 1

專利名稱：一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及華支睪吸蟲的檢測方法，特別是一種快速檢 測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法及其試劑盒。
背景技術：
華支睪吸蟲病(Clonorchiasis sinensis)又稱肝吸蟲病，是由華支睪吸蟲寄生在 人的肝膽管內所引起的肝膽病變為主的一種食源性人獸共患寄生蟲病。曾在中國、日本、韓 國、菲律賓、新加坡和馬來西亞、俄羅斯等國有華支睪吸蟲感染的報導。近年來，由於食物的 多樣化和國外飲食習慣的引入，本病在我國的感染率逐步增高，人群感人率從1 30%不 等。根據全國首次寄生蟲病調查表明，全國感染率平均為0. 356%,以此推算，全國大約有 470萬感染者。其主要原因是食生魚的習慣所致。據1988年的調查資料表明，黑龍江佳木 斯地區的麥穗魚感染率也為100% ；臺灣省日月潭地區，麥穗魚、克氏鰷魚感染華支睪吸蟲 囊蚴的感染率高達100%。華支睪吸蟲囊蚴主要分布在魚體的各個部分，如肌肉、頭、皮、鰭 及鱗等，一般以魚肉及魚頭肉最多。除淡水魚外，淡水蝦，如細足米蝦(Caridina nilotica gracilipes)、巨掌沼蝦(Macrobrachium superbum)等也有囊蚴寄生，因此，水產品、特別是 淡水魚中囊蚴的檢測已經成為食品安全的首要問題。華支睪吸蟲囊蚴呈橢圓形(如圖1所示)，大小92μπι ΙΙΟμ ΧΙΟΟμπι
140 μ m,囊壁分兩層，外壁較厚，內壁較薄。囊內有一幼蟲，幼蟲具口、腹吸盤、腸管和含黑色 鈣質顆粒的排洩囊。當人體感染華支睪吸蟲囊蚴後，可引起機體消化不良、腹瀉、腹痛、肝劇痛、肝腫 大、消瘦、侏儒症。在患者晚期可並發阻塞性黃疸、膽絞痛、膽管炎、膽囊炎及原發性膽管性 肝癌。吸蟲囊蚴直接威脅著人民的飲食安全，因此，需要一種快速、敏感、簡單的檢測淡水魚 中華支睪吸蟲囊蚴方法尤顯十分迫切和必須。FTA技術包含一種包埋在過濾基質中的蛋白質變性劑、螯合劑和自由基捕捉劑的 特殊乾燥化學試劑混合物。它對人無毒，用FTA技術收集的核酸可以在室溫和高溼度環境 下保存多年而不降解。FTA卡的工作原理是樣品中感染性病原體在接觸FTA時裂解失活，病 原體中的核酸則被固定下來。通過簡單的一步，從卡上純化洗脫下來DNA就可以應用於下 遊擴增實驗。FTA技術具有①節省低溫運輸樣品以及保存樣品的低溫冰箱的成本。②使有 機體快速失活，避免了操作過程中樣品汙染的風險。③處理樣品、分離得到DNA僅需15-30 分鐘，縮短、減少分離的步驟(4-16小時)。④樣品處理只需一個簡單的洗脫DNA的過程，省 去了使用純化試劑盒的花費。⑤樣品需求量最小化(每個樣品採集區12-40 μ 1)因此，已 廣泛的用於病毒、微生物、寄生蟲等生物DNA的提取。

發明內容
本發明的目的在於提供一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法及其試劑 盒，所述的這種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法及其試劑盒要解決現有技術中檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法複雜而且靈敏度不高的技術問題。本發明提供了一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，包括一個對離體的 淡水魚樣品處理的步驟、一個提取樣品DNA的步驟、一個對樣品的DNA進行PCR擴增的步驟 和一個對PCR擴增的產物進行電泳觀察的步驟；在所述的對離體的淡水魚樣品處理的步驟 中，將待檢測的樣品加入緩衝液玻璃株勻漿打碎，然後吸取勻漿液滴在FTA卡上；在所述的 提取樣品DNA的步驟中，將FTA卡自然乾燥，然後將FTA卡用FTA卡洗液洗滌；在所述的對 樣品的DNA進行PCR擴增的步驟中，將洗滌後的FTA卡晾乾後放入PCR反應管中進行PCR 擴增，擴增採用的上遊引物為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下遊引物為GGAAAGTTAAGCACCGACC， 然後對擴增的產物進行電泳並觀察。進一步的，還包括一個對陽性的對照品進行DNA提取和PCR擴增的步驟，所述的陽 性的對照品為華支睪吸蟲成蟲或者囊蚴。進一步的，在所述的對PCR擴增的產物進行電泳觀察的步驟中，將待檢測的樣品 的電泳條帶和陽性對照的電泳條帶進行比較，如果擴增產物的長度為3Mbp，則表示樣品中 含有華支睪吸蟲囊蚴，反之，則表示樣品中不含有華支睪吸蟲囊蚴。進一步的，在所述的對樣品的DNA進行PCR擴增的步驟中，將FTA卡裁剪後放入 PCR反應管中進行PCR擴增。進一步的，所述的FTA卡洗液為由Tri s-HCl和EDTA組成的水溶液，所述的 Tris-HCl在FTA卡洗液中的濃度為0. 01mol/L,所述的EDTA在FTA卡洗液中的濃度為 0. lmmol/L, pH 為 8. 0。進一步的，所述的PCR擴增的反應體系為2XTaq PCR Master Mix50 μ L, 1 % BSA 4 μ L, 10 μ mol/L上遊引物和下遊引物分別為3 μ L，ddH2040 μ L。進一步的，PCR反應條件是94°C預變性:3min ；94°C變性lmin，62°C退火lmin，72°C 延伸Imin, 40個循環；72°C延伸IOmin0本發明還提供了一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的試劑盒，所述的試劑盒 含有檢測引物CSl和檢測引物CS2，所述的CSl的序列為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，所述的CS2 的序列為 GGAAAGTTAAGCACCGACC。進一步的，還含有陽性對照品，所述的陽性對照品為華支睪吸蟲成蟲或者囊蚴的樣品。進一步的，所述的試劑盒中還含有PCR反應液，本發明的工作原理是本發明首先採用FTA法快速的提取待檢測樣品中的DNAJf 提取的DNA PCR擴增，然後將陽性對照品和待檢測樣品的擴增產物進行電泳，觀察電泳的長 度，如果擴增產物的長度為3Kbp，則表示樣品中含有華支睪吸蟲囊蚴，反之，則表示樣品中 不含有華支睪吸蟲囊蚴。本發明和現有技術相比，其效果是積極和明顯的。本發明提供了快速檢測淡水魚 中華支睪吸蟲囊蚴方法，用本發明的方法能檢測到每g淡水魚中1個吸蟲囊蚴，定量PCR技 術能區分淡水魚中3種不同的囊蚴，具有簡便、快速且敏感性高的優點，適宜食品安全、海 關防疫檢驗。


圖1是華支睪吸蟲囊蚴就剖鏡下囊蚴形態鑑定圖。圖2是本發明的一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法的流程圖。④「圖3是淡水魚中檢測華支睪吸蟲囊蚴的電泳比較圖。圖中「1」表示1克樣品 中含ι個華支睪囊蚴，「3」表示1克樣品中含3個華支睪囊蚴，依次類推。
具體實施例方式本發明採用的試劑為FTA卡(Whatman公司)；FTA卡洗液TE buffer :0. Olmol/ L Tris-HCl, pH 8. 0 ；0. lmmol/L EDTA, (Whatman 公司)；TAE 電泳緩衝液(購自上海生 工生物製品有限公司)(儲備液50X):撲化鹼對28、冰醋酸57. lmL、0.5mol/L EDTA(pH 8. 0) lOOmL，用蒸餾水定容至1，OOOmL，混勻，室溫保存，使用時取2mL 50 X TAE電泳緩衝液， 稀釋為200mL工作液(0. 5X)即可。水PCR用水符合GB/T 6682中一級水的規格並用DEPC 水處理；2XTaq PCR Master Mix(含有 0. IU Taq 聚合酶/L、500mol/L dNTPeach、20mmol/ L Tris-HCl (pH8. 3) UOOmmol/L KCl、3mmol/L MgCL2、其它穩定劑和增強劑，(購自上海生 工生物製品有限公司)；marker2000(takara公司)；0. lmmol/L EDTA (pH 8.0)(購自上海生 工生物製品有限公司)。實施例本發明的一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法1.魚肉樣品DNA的提取將魚去鯪後，取背、尾鰭部肌肉，稱取魚肉1克，再加入PH 8. 0緩衝液(0. lmmol/L EDTA)用細玻璃珠勻漿打碎，吸取勻漿液20 μ L滴在FTA卡上，自然乾燥(或56°C 5min)後 直接提取DNA，用打孔機打孔制的一張直徑6mm的濾膜片，用FTA卡洗液洗3次，每次5min， 涼幹後剪碎濾紙片於PCR反應管中，以提取的DNA為模板進行PCR擴增。2. PCR檢測步驟PCR擴增總體積為100 μ L0反應體系為DNA模板剪碎(制好的直徑6mmFTA濾 膜片一片)，2XTaq PCR Master Mix 50 μ L ； 1 % BSA 4 μ L ;10 μ mol/L 弓|物各 3 μ L ;ddH20 40 μ L，擴增採用的上遊引物為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下遊引物為GGAAAGTTAAGCACCGACC。反應條件94°C預變性:3min；94°C變性 lmin，62°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，40 個 循環；72°C延伸IOmin。3.電泳擴增產物長度分別為3Kbp。瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產物是否有特徵條帶(採 用溴化乙錠顯色)。如果擴增產物的長度為3Kbp，則表示樣品中含有華支睪吸蟲囊蚴，反之，則表示 樣品中不含有華支睪吸蟲囊蚴。(如圖3所示)實施例2傳統的試劑盒法試劑盒法主要步驟是1.將超淨臺酒精消毒，紫外滅菌；鑷子和剪刀滅菌；取滅菌1. 5ml離心管，加入蟲 體(或囊蚴)，反覆用單蒸水充分水洗，最後將洗液棄去。2.預先調好恆溫器55攝氏度；樣品管加入=Nuclei lysis solution 200微升; 0.5M EDTA (PH8. 0 50 微升；Proteinase K U0mg/ml) 20 微升；RNase A Solution (4mg/ml)5微升。3.放入55攝氏度加熱16-18小時，加入250微升lysis Buffer，漩渦震蕩，馬上 移入minicolumns中(預先準備好)。4. 13000轉，離心，3分鐘30秒，倒掉收集管中的液體，將柱子重新放回收集管。5.加入 650 微升 wizard SV wash solution, 13000 轉離心 1 分 40 秒，棄去廢液， 13000轉離心，2分30秒。6.將柱子移入新的1. 5ml離心管，加入30微升Nuclease-Free Water,室溫放2 分鐘。7. 13000轉離心1分鐘30秒，離心後加入30微升Nuclease-Free Water,室溫放 2分鐘。8.再離心13000轉，2分30秒，去掉微型柱，離心管內液體為所需的DNA。9.然後進行擴增和電泳，如果擴增產物的長度為3Kbp，則表示樣品中含有華支 睪吸蟲囊蚴，反之，則表示樣品中不含有華支睪吸蟲囊蚴(如圖3所示)。由圖3可知，試劑盒法和FTA法的結果是一致的，但是傳統的試劑盒法處理樣品、 分離得到DNA時間比較長，而且步驟繁瑣，花費也比較高。
權利要求
1.一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，包括一個對離體的淡水魚樣品處 理的步驟、一個提取樣品DNA的步驟、一個對樣品的DNA進行PCR擴增的步驟和一個對PCR 擴增的產物進行電泳觀察的步驟；其特徵在於在所述的對離體的淡水魚樣品處理的步驟 中，將待檢測的樣品加入緩衝液用玻璃株勻漿打碎，然後吸取勻漿液滴在FTA卡上，在所述 的提取樣品DNA的步驟中，將FTA卡自然乾燥，然後將FTA卡用FTA卡洗液洗滌，在所述的 對樣品的DNA進行PCR擴增的步驟中，將洗滌後的FTA卡晾乾後放入PCR反應管中進行PCR 擴增，擴增採用的上遊引物為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下遊引物為GGAAAGTTAAGCACCGACC， 然後對擴增的產物進行電泳並觀察。
2.如權利要求1所述的快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，其特徵在於還包 括一個對陽性的對照品進行DNA提取和PCR擴增的步驟，所述的陽性的對照品為華支睪吸 蟲成蟲或者囊蚴。
3.如權利要求1所述的快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，其特徵在於在所 述的對PCR擴增的產物進行電泳觀察的步驟中，將待檢測的樣品的電泳條帶和陽性對照的 電 泳條帶進行比較，如果擴增產物的長度為3Mbp，則表示樣品中含有華支睪吸蟲囊蚴，反 之，則表示樣品中不含有華支睪吸蟲囊蚴。
4.如權利要求1所述的快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，其特徵在於在所 述的對樣品的DNA進行PCR擴增的步驟中，將FTA卡裁剪後放入PCR反應管中進行PCR擴 增。
5.如權利要求1所述的快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，其特徵在於所述 的FTA卡洗液為由Tris-HCl和EDTA組成的水溶液，所述的Tris-HCl在FTA卡洗液中的濃 度為0. 01mol/L,所述的EDTA在FTA卡洗液中的濃度為0. lmmol/L, pH為8. 0。
6.如權利要求1所述的快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，其特徵在於所述 的 PCR 擴增的反應體系為 JXiTaq PCR Master Mix 50μ L, 1% BSA 4 μ L，10 μ mol/L 上遊 引物和下遊引物分別為3 μ L，ddH20 40 μ L。
7.如權利要求1所述的快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，其特徵在於PCR反 應條件是94°C預變性:3min ；94°C變性lmin，62°C退火lmin，72°C延伸Imin，40個循環；72°C 延伸lOmin。
8.一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒中含 有檢測引物CSl和檢測引物CS2，所述的CSl的序列為CGAGGGTCGGCTTATAAAC，所述的CS2 的序列為 GGAAAGTTAAGCACCGACC。
9.如權利要求8所述的快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的試劑盒，其特徵在於還 含有陽性對照品，所述的陽性對照品為華支睪吸蟲成蟲或者囊蚴的樣品。
10.如權利要求8所述的快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的試劑盒，其特徵在於所 述的試劑盒中還含有PCR反應液。
全文摘要
本發明提供了一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的方法，包括一個對離體的淡水魚樣品處理的步驟；一個提取樣品DNA的步驟；一個對樣品的DNA進行PCR擴增的步驟；一個對PCR擴增的產物進行電泳觀察的步驟；在一個對淡水魚樣品處理的步驟中，將待檢測的樣品加入緩衝液勻漿用玻璃珠打碎，然後吸取勻漿液滴在FTA卡上；在一個提取樣品DNA的步驟中，將FTA卡自然乾燥，然後將FTA卡用PTA卡洗液洗滌。本發明還提供了一種快速檢測淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴的試劑盒，用本發明的方法能檢測到每g淡水魚中1個吸蟲囊蚴，定量PCR技術能區分淡水魚中3種不同的囊蚴，具有簡便、快速且敏感性高的優點，適宜食品安全、海關防疫檢驗。
文檔編號C12Q1/68GK102146446SQ20111000477
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月11日 優先權日2011年1月11日
發明者張永年, 李樹清, 艾琳, 陳家旭, 陳韶紅 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所