固定化細胞生產l-蘋果酸的製作方法

2023-04-30 19:51:06

專利名稱：固定化細胞生產l-蘋果酸的製作方法
技術領域：
本發明為用固定化的微生物細胞生產L-蘋果酸的方法，更具體的說本發明涉及將含延胡索酸酶的細胞固定化，通過該酶的作用將底物反丁烯二酸轉化為L-蘋果酸。
L-蘋果酸廣泛用於食品，醫藥等領域，在食品工業中用作酸味劑，可配製多種飲料和食品。因其有抑菌和輔助抗氧化作用，還可用作防腐劑。醫藥上可用於治療肝功能不全。還可用作除垢劑，驅蟲劑。此外可作為螢光增白劑的合成原料。全世界每年產量約3.5萬噸，它是國際市場上的暢銷貨。
延胡索酸酶又稱富馬酸酶，存在於一些微生物，如酵母、細菌的細胞內，能催化反丁烯二酸轉化為L-蘋果酸
已知一些用固定化微生物細胞將反丁烯二酸轉化為L-蘋果酸的方法。西德專利2450137公布了一種用固定化細胞生產L-蘋果酸的方法，用聚丙烯醯胺凝膠包埋產延胡索酸酶的微生物細胞，在柱式反應器中連續轉化反丁烯二酸鹽為蘋果酸鹽。Yamamoto等報導用聚丙烯醯胺凝膠包埋產氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)(Europ J.App l.Microbiol.3，169-183 1976)連續化生產L-蘋果酸，I.Takata等(Enzyme Microb.Technol.，Vol.2，30-36，1980)報導用卡拉膠包埋黃色短桿菌(B.flavum)，連續生產L-蘋果酸。楊廉婉等(微生物學報20(3)296-302，1980)研究了比較用聚丙烯醯胺凝膠，瓊脂凝膠和明膠三種膠包埋產延胡索酸酶的皺褶假絲酵母C90，表明用聚丙烯醯胺凝膠包埋優於用瓊脂凝膠或明膠，可用於連續化生產L-蘋果酸。以上報導的這些固定方法都是用的單一載體，聚丙烯醯胺凝膠中的單體有毒、抑制酶活力，而用卡拉膠包埋細胞，長時間使用固定化細胞易破碎。這些方法存在固定化細胞的延胡索酸酶活力回收率不高，固定化細胞的機械強度不夠理想等缺點。
本發明的目的在於提供一種用固定化細胞連續生產L-蘋果酸的方法，提高固定化細胞的機械強度，減少細胞漏失，使延胡索酸酶的活力回收率明顯提高(在本發明的實驗條件下，延胡索酸酶的活力回收率90%以上)，製備的固定化細胞機械強度好，彈性強，易於操作。
本發明的特徵在於使用混合載體製備含延胡索酸酶的固定化細胞，先用多孔珍珠巖粉吸附細胞，再與聚乙烯醇凝膠混合包理，在低溫下固化。
本發明所用的微生物細胞可以是產生胞內的延胡索酸酶的酵母、細菌等，在下述實驗條件下，以皺褶假絲酵母(Candida rugosa)Cr10為好。現以該菌株為例說明本發明的固定化細胞製備過程。
菌種保存在麥芽汁瓊脂斜面上，按微生物學常規方法培養細胞，發酵養基為0.3%NH4Cl，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.05%酵母膏，6%重液體石蠟和3%CaCO3，在旋轉搖床上30℃培養96小時。然後在4℃，每分鐘1萬轉離心10分鐘，收集細胞，稱重，加生理鹽水製成細胞懸浮液。每毫升細胞懸浮液中含有0.5克溼細胞。
細胞懸浮液中加入多孔珍珠巖粉(一種無機保溫材料)，細胞懸浮液與多孔珍珠巖粉的比例為每2毫升懸浮液加入0.3-1.0克多孔珍珠巖粉，即溼細胞與多孔珍珠巖粉的比例為10.3-1.0，充份攪拌使充份吸附，將聚乙烯醇事先溶解，製成凝膠液，加入聚乙烯醇凝膠溶液，使聚乙烯醇在溶液中的最終濃度為10-18%(按重量計)，細胞濃度為10%(按重量計)，多孔珍珠巖粉為3-10%。上述混合物在-20--30℃放置18-24小時，即製成固定化細胞。將製得的固定化細胞切成邊長2-3mm的小塊，用生理鹽水洗數次。用1M pH8.5的反丁烯二酸銨於30℃浸泡固定化細胞24小時後，裝在柱式反應器中，催化底物轉化為L-蘋果酸。
反丁烯二酸用氨水溶解，配成反丁烯二酸銨水溶液，流經柱式反應器。反丁烯二酸銨的濃度為1-1.5M，以1-1.25M為好，pH為8.5，以裝有100毫升固定化細胞的反應器為例，流速以5-15毫升/小時為宜，在30℃條件下反應，流出液為轉化的產物L-蘋果酸銨溶液。溶液經酸化，沉澱出未反應的反丁烯二酸，回收再利用。將L-蘋果酸銨溶液中加入氫氧化鈣，轉化為L-蘋果酸鈣二水鹽，過濾烘乾後加水做成懸浮液再加入硫酸溶液，形成硫酸鈣沉澱，除去硫酸鈣沉澱，得到L-蘋果酸水溶液，再經過陽離子交換樹脂柱和陰離子交換樹脂柱，然後在60℃減壓濃縮，最終得到L-蘋果酸結晶。過濾掉母液(母液回收套用)，即得到L-蘋果酸結晶，在50℃烘乾，得到白色結晶的L-蘋果酸。
測定自然細胞和固定化細胞的延胡索酸酶的表現活力(測定方法按楊廉婉等微生物學報20(3)296-302，1980)。固定化細胞的延胡索酸酶活力回收率的計算方法為固定化細胞的延胡索酸酶的表現活力/自然細胞的延胡索酸酶的表現活力×100%。
L-蘋果酸的定量測定用Goodman等人(Anal.Chem.29283，1957)的方法。
本發明用多孔珍珠巖粉吸附細胞，用聚乙烯醇包埋製備固定化細胞，方法簡便易行，成本低，製得的固定化細胞機械強度好，彈性好。該方法可減少細胞的漏失，固定化細胞的延胡索酸酶的活力回收率高，達90%以上，固定化細胞的延胡索酸酶的活力可達12000微克分子/克·小時。用該固定化細胞連續生產L-蘋果酸，轉化率80%以上，無付產物。
實施例1將皺褶假絲酵母Cr10按常規方法接種培養，培養液在4℃，1萬轉/分鐘離心10分鐘，收集細胞，用生理鹽水懸浮，使每毫升菌懸液含0.5克溼細胞。測定自然細胞的延胡索酸酶的表現活力為13569.4微克分子/克·小時將40毫升上述細胞懸浮液(含20克溼細胞)加入12克多孔珍珠巖粉，充份混合、吸附，再加入18%的聚乙烯醇132克(含聚乙烯醇約24克)，加水至200克，攪拌，混合均勻後，置於-30℃，18小時固化，製備成固定化細胞，切成邊長2-3mm小塊，用生理鹽水洗三次，抽濾幹，測定製得的固定化細胞的延胡索酸酶的表現活力為12664.9微克分子/克·小時，延胡索酸酶的活力回收率為93.3%。
將固定化細胞在30℃條件下，用1M pH8.5的反丁烯二酸銨水溶液浸泡24小時，過濾出固定化細胞，量取100毫升固定化細胞，裝入5×30釐米的反應柱中，30℃反應，加入pH8.5的1.25M的反丁烯二酸銨水溶液，以不同的速度流經反應柱，分別收集流出的蘋果酸銨溶液，測定底物轉化為L-蘋果酸的轉化率。結果列於表1中。
表1 不同流速的反丁烯二酸銨轉化為L-蘋果酸的轉化率反丁烯二酸銨溶液流速 轉化率(毫升/小時) (%)6 85.512 83.121 73.542 67.554 56.0從表中可以看出底物對產物的轉化率在流速6毫升/小時達85.5%。
實施例2按實施例1的方法製備皺褶假絲酵母Cr10的固定化細胞，細胞溼重、多孔珍珠巖粉、聚乙烯醇分別為10%，6%和12%。自然細胞的延胡索酸酶的表現活力為13269.2微克分子/克·小時。固定化細胞酶的表現活力為12061.7微克分子/克·小時。該酶活力的回收率為90.9%。
取100毫升上述製備的固定化細胞，裝入5×30釐米的柱式反應器中，在30℃用1.25M pH8.5的反丁烯二酸銨水溶液以每小時12毫升的流速流經反應柱，連續運轉30天，分次取樣測定轉化率(每隔一天測一次)。底物轉化為L-蘋果酸的轉化率為80-82%，平均81.4%.
取1升柱中流出液，加200毫升濃鹽酸沉澱除去未轉化的反丁烯二酸(可回收再利用)，上清液加Ca(OH)2，至pH6.8(用掉Ca(OH)285.5克)，得到蘋果酸鈣二水鹽，抽濾，50℃烘乾，得190克L-蘋果酸鈣二水鹽。加入1100毫升蒸餾水製成懸浮液，加入90毫升硫酸水溶液(3份98%的硫酸加入1份水配製)，邊加邊攪拌，形成硫酸鈣沉澱，過濾掉硫酸鈣沉澱，濾液通過180毫升732陽離子交換樹脂柱，再通過180毫升AmberliteIR-45陰離子交換樹脂柱，得到L-蘋果酸溶液，60℃減壓濃縮(濃縮到L-蘋果酸溶液的比重為1.37)，自然降溫到室溫，結晶出L-蘋果酸，50℃烘乾，得到61.8克L-蘋果酸結晶。母液回收得到20.8克L-蘋果酸結晶，總收率70%，按楊廉婉等的方法(微生物學報20(3)296-302，1980)對得到的L-蘋果酸進行質量鑑定，結果列於表2。
表2 L-蘋果酸的質量鑑定含量(%) 熔點(℃) 比旋光度[α]20D紙層析(在5%水溶液中) Rf值99.6 100-105 -2.2 0.46質量鑑定符合國外文獻報導的標準。
權利要求
1.一種用固定化細胞生產L-蘋果酸的方法，包括將反丁烯二酸經細胞內延胡索酸酶的催化作用轉化成L-蘋果酸，其特徵在於使用多孔珍珠巖粉和聚乙烯醇混合載體製備含延胡索酸酶的固定化細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵是先用多孔珍珠巖粉與細胞懸浮液混合，吸附，再與聚乙烯醇混合包埋，在低溫下固化。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於細胞(按溼重算)、多孔珍珠巖粉、聚乙烯醇三者的用量分別為10%，3-10%和10-18%，固化溫度為-20--30℃，固化時間為18-24小時。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於固定化微生物細胞可以為酵母、細菌，用發酵法製得。
5.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所用的固定化細胞為皺褶假絲酵母Cr10，用發酵方法製得。
6.根據權利要求1-5任選一項所述的方法，將pH8.5的1.25M的反丁烯二酸銨水溶液流經固定化細胞填充的反應柱，得到蘋果酸銨水溶液，經純化、分離，得到L-蘋果酸白色結晶。
全文摘要
本發明為一種用固定化細胞以反丁烯二酸為原料生產L-蘋果酸的方法。將發酵得到的微生物細胞用多孔珍珠巖粉吸附，再用聚乙烯醇包埋，低溫固化。本方法可減少細胞的漏失，固定化細胞的延胡索酸酶回收率90％以上，產物對底物的轉化率80％以上，固定化細胞的機械強度好，彈性好。
文檔編號C12N11/00GK1067451SQ9110360
公開日1992年12月30日 申請日期1991年6月4日 優先權日1991年6月4日
發明者楊廉婉 申請人:中國科學院微生物研究所