細胞系LNCaP和細胞系C4-2的新用途的製作方法
2023-04-30 23:04:16 1
專利名稱：細胞系LNCaP和細胞系C4-2的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞系LNCaP和細胞系C4_2的新用途。
背景技術：
在前列腺癌(Prostate Cancer，前列腺癌)治療中，放射治療始終處於重要的地 位。早期前列腺癌的放射治療可以達到根治的目的，療效與前列腺癌根治性手術相近。而 對於局部晚期的前列腺癌(尤其是遠處轉移者)，放療雖然可減輕症狀，改善生存質量，但 其表現出放療抗性，經放療治癒的前列腺癌病人中30%會在原照射部位復發。腫瘤病人對 電離輻射(IR)的敏感性或抵抗性的個體間差異是很大的，個體的輻射敏感性或抵抗性不 能在治療前可靠地預測，造成放療反應不確定。目前對於癌細胞為什麼會從IR敏感發展到 IR抗性的作用機制還不清楚，但這無疑是與周期阻滯、凋亡或死亡相關基因表達變化相關。對輻射誘導的相關基因或信號通路認識的提高，有可能幫助開發出前列腺癌輻射 抗性改變的藥物。通過對前列腺癌進展相關基因的檢測，有可能幫助制訂個體化的放療方 案，為指導臨床醫生診斷治療提供依據。研究與IR敏感發展成為抗性的相關基因，首先需 要在細胞水平開展研究，因此建立能代表對輻射敏感與抗性不同階段的細胞模型顯得至關 重要。目前研究輻射敏感與抗性的前列腺癌細胞系通常是LNCaP和PC3或DU145。其中 LNCaP代表輻射敏感階段，PC3或DU145代表輻射抗性階段。但存在的問題是，LNCaP與PC3 或DU145細胞的遺傳背景不同。特別重要的是，雄激素受體(Androgen Receptor,AR)信號 通路在前列腺癌發展中起至關重要的作用，LNCaP為AR陽性細胞，其AR信號通路處於激活 狀態。然而PC3或DU145細胞中AR蛋白不表達，AR信號通路失活。因此它們間的差異表 達基因就不可能準確代表前列腺癌細胞系輻射敏感進展相關的決定性基因。C4-2細胞具有和LNCaP相同的遺傳背景，具有高惡性、轉移和雄激素非依賴生長 的特性。
發明內容
本發明的目的是提供細胞系LNCaP和細胞系C4_2的新用途。本發明所提供的新用途為細胞系LNCaP和細胞系C4_2在製備對輻射敏感和對輻 射產生抗性的前列腺癌細胞模型中的應用。所述輻射為電離輻射。所述對輻射敏感為如下1)、2)、3)和/或4)所示1)在輻射劑量為5Gy和輻射後培養時間為72小時的條件下，與未經輻射的細胞系 LNCaP相比，經輻射的細胞系LNCaP的生長率降低了 81% ；2)在輻射劑量為IOGy和輻射後培養時間為72小時的條件下，與未經輻射的細胞 系LNCaP相比，經輻射的細胞系LNCaP的生長率降低了 88% ； 3)在輻射劑量為5Gy和接種量為4000個細胞/孔的條件下，與 未經輻射的細胞系 LNCaP相比，經輻射的細胞系LNCaP的克隆形成率降低了 85% ；
4)在輻射劑量為5Gy和接種量為6000個細胞/孔的條件下，與未經輻射的細胞系 LNCaP相比，經輻射的細胞系LNCaP的克隆形成率降低了 86% ；所述對輻射產生抗性為如下I、II、III和/或IV所示I、在輻射劑量為5Gy和輻射後培養時間為72小時的條件下，與未經輻射的細胞系 C4-2相比，經輻射的細胞系C4-2的生長率降低了 33% ；II、在輻射劑量為IOGy和輻射後培養時間為72小時的條件下，與未經輻射的細胞 系C4-2相比，經輻射的細胞系C4-2的生長率降低了 35% ；III、在輻射劑量為5Gy和接種量為4000個細胞/孔的條件下，與未經輻射的細胞 系C4-2相比，經輻射的細胞系C4-2的克隆形成率降低了 51% ；IV、在輻射劑量為5Gy和接種量為6000個細胞/孔的條件下，與未經輻射的細胞 系C4-2相比，經輻射的細胞系C4-2的克隆形成率降低了 47% ；C4-2細胞具有和LNCaP相同的遺傳背景，具有高惡性、轉移和雄激素非依賴生長 的特性。本發明首先證明了 C4-2細胞的一個新的特性，即C4-2細胞對電離輻射具有抗性。 本發明的這一發現使LNCaP/C4-2可以作為代表前列腺癌細胞由IR敏感發展到IR抵抗的 細胞模型。本發明可以用於篩選出決定前列腺癌從輻射敏感進展為抗性的電離輻射誘導基 因，進而篩選出參與和決定前列腺癌進展的相關基因，從而為發現更有效的臨床激素抗性 和輻射抗性的治療靶標打下基礎。本發明還可應用於闡明IR抵抗發生發展過程，研究與IR抵抗雄激素非依賴發展 之間的關係，篩選代表IR不同階段的分子標誌物分子。本發明還可用於闡明輻射敏感性 的增強或減弱的分子機制，開發出適合於臨床使用的預測性分析方法；通過對特定基因的 檢測，篩選出可用於制訂個體化的放療方案和基因治療-放療增敏相關的電離輻射誘導基 因，為進一步研究DNA損傷修復提供重要線索，同時也為腫瘤的放射治療提供新的思路和 策略。
圖1為輻射後LNCaP和C4_2的生長曲線分析。圖2為輻射後LNCaP和C4-2的克隆形成分析。圖3為軟瓊脂集落形成試驗分析輻射後LNCaP和C4_2細胞的錨著非依賴生長能 力。圖4為流式細胞試驗分析輻射後LNCaP和C4_2細胞的S期數量和G2/M期細胞阻 滯狀況。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。人前列腺癌細胞系LNCaP購自Urocore (Oklahoma City, OK, USA)公司，人前列腺 癌細胞系 C4-2 購自 Urocore (Oklahoma City, OK, USA)公司。RPMI1640培養基每袋1640 (Gibco，IL裝)加入2g碳酸氫鈉 和4. 8g H印es，調pH值至7. 4，雙層0. 22 μ m濾紙過濾除菌後使用。下述實施例中的細胞培養中均使用RPMI1640
培養基。H印es購自AMRESC0公司，產品目錄號為0511。PBS 向900ml蒸餾水中加入8g氯化鈉，0. 2g氯化鉀，1. 44g磷酸氫二鈉，0. 24g磷
酸二氫鉀，調PH值至7. 4，定容至1L，高壓滅菌後使用。細胞培養用胰酶Ig胰酶加入400ml ΡΒ5，*Λ430μ1 0. 5Μ EDTA，雙層濾紙過濾
除菌後使用。下述實施例中的數據分析方法利用SigmapStat 3. 5軟體程序進行數據的分析 和處理。MTT、軟瓊脂集落形成實驗利用SigmapStat 3. 5軟體中的t檢驗。實施例1、LNCaP細胞和C4_2細胞對電離輻射的抗性檢測一、C4-2細胞具有更強的抗電離輻射生長能力為了解LNCaP/C4_2細胞模型對電離輻射的應答反應，MTT實驗分析了分別在0、 2. 5、5和IOGy輻射後培養不同時間的細胞生長狀況。將LNCaP細胞和C4-2細胞分別進行0、2. 5、5和IOGy劑量的電離輻射，放置於 37°C,5% CO2培養箱中培養0、6、12、24、48、72小時。向上述培養不同時間點的細胞中加入 20 μ 1 MTT溶液(MTT溶液是將MTT溶解於PBS中得到的，MTT的濃度為5mg/ml)，在5% CO2 培養箱中培養4小時後用150 μ 1 DMSO將其溶解，取150 μ 1細胞懸浮液在酶聯儀中讀取 490nm波長下的OD49tl數值，以時間為橫軸，OD49tl光吸收值為縱軸繪製細胞生長曲線。數據 用平均數和標準差來表示。結果如圖1所示，A表示LNCaP細胞，B表示C4_2細胞。細胞生長曲線結果顯示， 在5Gy輻射和培養72小時條件下，LNCaP的生長率是1. 1，而未受輻射的LNCaP的生長率是 5. 9，此時LNCaP的生長被抑制了 81. 3%。同樣在5Gy輻射和培養72小時條件下，C4-2的 生長率是4. 2，而未受輻射的C4-2的生長率是6. 4，C4-2的生長被抑制了 34. 4%。在IOGy 輻射和培養72小時條件下，LNCaP的生長率是0. 7，而未受輻射的LNCaP的生長率是5. 9， LNCaP的生長被抑制了 88. 1% ；在IOGy輻射和培養72小時條件下，C4-2的生長率是4. 1， 而未受輻射的C4-2的生長率是6.4，C4-2的生長被抑制了 35.9%。這些結果表明，當細胞 遭受電離輻射後，LNCaP和C4-2細胞的生長均以輻射劑量依賴方式被抑制，然而C4-2細 胞受電離輻射後較LNCaP細胞具有更強的生長能力，C4-2細胞表現出電離輻射的抗性(P < 0. 01)。用MTT溶液處理後細胞懸液在490nm波長下的數值表示生長率。活細胞線粒體中 的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物Formazan並沉積在細胞 中。DMSO能溶解細胞中的Formazan，測定上述處理細胞懸液在490nm波長下的數值，可代 表細胞的存活和生長狀態，即細胞的生長率。二、C4-2細胞具有更強的抗電離輻射錨著依賴和非依賴生長能力為了驗證LNCaP/C4_2細胞在遭受電離輻射後的存活能力，進行了 5Gy輻射條件下的平板克隆形成(錨著依賴)和軟瓊脂集落形成(錨著非依賴)實驗。1、平板克隆形成將細胞按照4000、6000、8000個細胞/孔接種6孔培養板，放置於37°C、5% CO2培養箱中培養24小時，分別設3個重複孔，然後將LNCaP細胞和C4-2細胞 各自分別進行5Gy的電離輻射，然後繼續培養10 16天，待有明顯克隆形成後，棄上清，用PBS清洗1 2次，甲醇固定10分鐘後用PBS清洗1 2次，加入的結晶紫染液30分 鍾後清水洗淨，掃描。同時以未進行電離輻射的作對照(記作OGy)。結果如圖2所示，A表示LNCaP細胞，B表示C4_2細胞。結果顯示，5Gy輻射後與 OGy相比，以4000、6000、8000個細胞/孔接種6孔培養板板，3個梯度接種的LNCaP細胞都 失去了克隆形成能力，表明LNCaP在上述輻射條件下細胞不能存活。而C4-2仍然形成很多 肉眼可見細胞克隆，說明C4-2具有較LNCaP細胞更強的抗輻射生長能力，而LNCaP則是對 輻射高度敏感的。2、軟瓊脂集落形成實驗將LNCaP細胞和C4_2細胞分別進行0和5Gy劑量的電離輻射，放置於37°C、5% CO2培養箱中培養24小時。先配製並鋪好底層瓊脂(瓊脂濃度0. 5% )。然後常規消化細 胞，將細胞數懸浮於0. 34%的瓊脂並接種於6孔板中，接種密度分別為4000個/孔、6000 個/孔、8000個/孔，放置於37°C、5% CO2培養箱中培養，1周後開始觀察，2周後多於50個 細胞形成的克隆被計數，終止培養。每個細胞接種密度重複3個孔，數據用平均數和標準差 來表示。同時以未進行電離輻射的作對照(記作OGy)。克隆形成率的計算公式克隆形成率=克隆數/接種細胞數X 100%。0. 34%的瓊脂溶液向RPMI1640培養基中添加瓊脂和FBS得到的，瓊脂在0. 34% 的瓊脂溶液中的濃度為0. 34% (質量百分含量)，FBS在0. 34%的瓊脂溶液中的濃度為 10% (質量百分含量)。結果如圖3所示，A表示LNCaP細胞，B表示C4_2細胞。錨著非依賴生長結果顯 示，在5Gy輻射和接種4000個細胞/孔接種6孔板時，LNCaP細胞的克隆形成率是0. 3%， 未經輻射處理時其克隆形成率是2.3%，克隆形成率降低了 86.9%。在同樣的輻射條件下， C4-2細胞的克隆形成率是2. 6%，未經輻射處理時其克隆形成率是5. 4%，克隆形成率降低 了 51. 9%。而在5Gy輻射和接種6000個細胞/孔接種6孔板時，LNCaP細胞的克隆形成率 是0.4%，未經輻射處理時其克隆形成率是3. l%，LNCaP細胞的克隆形成率降低了 87. 1%; C4-2細胞的克隆形成率是2. 6 %，未經輻射處理時其克隆形成率是5. 0 %，C4-2細胞的克隆 形成率降低了 48. 0% (P < 0. 01)。上述結果均表明，與LNCaP相比，輻射介導的克隆形成抑 制效率在C4-2細胞中顯著降低，C4-2細胞擁有明顯的輻射抵抗性質，而其母體細胞LNCaP 則是輻射敏感的。三、C4-2細胞更容易克服輻射造成的G2/M細胞周期阻滯用流式細胞技術分析了輻射對LNCaP/C4_2細胞周期的影響。將LNCaP細胞和C4_2細胞分別進行5Gy劑量的電離輻射，放置於37°C、5% CO2培 養箱中培養0、6、12、24、48、72小時。利用流式細胞儀檢測上述培養不同時間點的細胞周期 分布狀況。具體檢測方法1)先用PBS清洗2 3遍細胞，而後用0. 25%胰酶(含0. 02% EDTA)消化細胞。2)用含8%國產胎牛血清1640輕輕懸起細胞，轉移到離心管裡。IOOOrpm 離心，棄上清。3)加入300μ 1含5%國產胎牛血清的PBS重懸細胞，轉移至EP管中，再加 入700 μ 1的無水乙醇混勻，置於_20°C冰箱過夜。4) IOOOrpm離心，棄上清，用PBS洗兩次， 每次以IOOOrpm離心，棄上清。用100 μ 1的RNaseA(lmg/ml)重懸，37°C消化30分鐘。5) 加入400 μ IPI染色15 30分鐘，避光。6)利用流式細胞儀進行檢測。結果如圖4所示。圖4中，A表示LNCaP細胞，B表示C4-2細 胞，C表示LNCaP細胞，D表示C4-2細胞。結果顯示，在正常條件下，C4-2細胞S期高於LNCaP(C4-2為33. 275%, LNCaP為 20. 25% )。在5Gy輻射後培養12小時時，LNCaP的S期細胞急劇降低(輻射後3. 49%，未 輻射22. 14% )，48小時後部分恢復(輻射後10%，未輻射19. 12% )，在第12小時可被觀 察到LNCaP細胞G2\M期細胞阻滯(輻射後37. 01%，未輻射14. 42 ，可持續至72小時 (輻射後40. 37%，未輻射16. 84% )0然而C4-2在5Gy輻射後的6小時S期細胞比例即明顯提高(輻射後48. 98%，未 輻射35. 85% ),12小時後急劇下降(輻射後5. 77%，未輻射31. 71% ),48小時後部分恢 復(輻射後11. 45%，未輻射32.65% )。第12小時可觀察到其G2\M期細胞阻滯(輻射後 56. 08%,未輻射15. 73% )，24小時時保持細胞阻滯(輻射後47. 52%,未輻射15. 24% )，在 48小時細胞阻滯基本恢復(輻射後23. 27%，未輻射10. 46% )。上述細胞周期結果顯示， C4-2細胞可以較快地通過輻射造成的G2/M阻滯，C4-2細胞中S期的細胞比例高於LN CaP， 因此促使細胞繼續增殖。
權利要求
細胞系LNCaP和細胞系C4-2在製備對輻射敏感和對輻射產生抗性的前列腺癌細胞模型中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述輻射為電離輻射。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述對輻射敏感為如下1)、2)、3)和/或4)所示1)在輻射劑量為5Gy和輻射後培養時間為72小時的條件下，與未經輻射的細胞系 LNCaP相比，經輻射的細胞系LNCaP的生長率降低了 81% ；2)在輻射劑量為10Gy和輻射後培養時間為72小時的條件下，與未經輻射的細胞系 LNCaP相比，經輻射的細胞系LNCaP的生長率降低了 88% ；3)在輻射劑量為5Gy和接種量為4000個細胞/孔的條件下，與未經輻射的細胞系 LNCaP相比，經輻射的細胞系LNCaP的克隆形成率降低了 85% ；4)在輻射劑量為5Gy和接種量為6000個細胞/孔的條件下，與未經輻射的細胞系 LNCaP相比，經輻射的細胞系LNCaP的克隆形成率降低了 86% ；所述對輻射產生抗性為如下I、II、III和/或IV所示I、在輻射劑量為5Gy和輻射後培養時間為72小時的條件下，與未經輻射的細胞系C4-2 相比，經輻射的細胞系C4-2的生長率降低了 33% ；II、在輻射劑量為10Gy和輻射後培養時間為72小時的條件下，與未經輻射的細胞系 C4-2相比，經輻射的細胞系C4-2的生長率降低了 35% ；III、在輻射劑量為5Gy和接種量為4000個細胞/孔的條件下，與未經輻射的細胞系 C4-2相比，經輻射的細胞系C4-2的克隆形成率降低了 51% ；IV、在輻射劑量為5Gy和接種量為6000個細胞/孔的條件下，與未經輻射的細胞系 C4-2相比，經輻射的細胞系C4-2的克隆形成率降低了 47%。
全文摘要
本發明公開了細胞系LNCaP和細胞系C4-2的新用途。該新用途為細胞系LNCaP和細胞系C4-2在製備對輻射敏感和對輻射產生抗性的前列腺癌細胞模型中的應用。本發明首先證明了LNCaP/C4-2細胞模型的一個新的特性，即其中的C4-2細胞對電離輻射具有抗性，LNCaP/C4-2可以是代表前列腺癌細胞由IR敏感發展到IR抵抗的細胞模型。本發明可以用於篩選出決定前列腺癌從輻射敏感進展為抗性的電離輻射誘導基因，進而篩選出參與和決定前列腺癌進展的相關基因，從而為發現更有效的臨床激素抗性和輻射抗性的治療靶標打下基礎。
文檔編號C12N5/09GK101831406SQ20101017304
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月11日 優先權日2010年5月11日
發明者周建光, 施慶國 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所