一種重組人促卵泡激素的純化方法

2023-05-19 04:46:01 3

一種重組人促卵泡激素的純化方法
【專利摘要】本發明涉及利用重組DNA技術生產基因工程藥物，屬於生物【技術領域】，具體涉及一種重組人促卵泡激素的純化方法，即將含有重組人促卵泡激素的細胞上清依次經過染料親和層析、疏水作用層析、脫鹽層析和羥基磷灰石層析得到高質量的重組人促卵泡激素目的蛋白。本發明具有工藝簡單、成本低、目的產物純度高以及中間過程便於控制和易於規模化放大生產等特點。
【專利說明】一種重組人促卵泡激素的純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及利用重組DNA技術生產基因工程藥物，具體涉及一種重組人促卵泡激素的純化方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)也稱為促卵泡激素,是一種屬於促性腺激素類的可注射的蛋白質。天然狀態下由垂體嗜鹼性細胞合成和分泌的，作為藥用，FSH可以重組產生，或者可以從絕經後的婦女尿液中分離得到。FSH可用於女性和男性病人的不孕和生殖紊亂的治療，目前國內已經上市的有從尿液中提取的注射用尿促卵泡激素，商品名麗申寶；採用基因重組技術生產的產品也已進口上市，其純度更高、避免了尿蛋白雜質及其他雜質的汙染，商品名果納芬(重組人α促卵泡激素)和普麗康(重組人β促卵泡激素)。
[0003]FSH是一種糖蛋白，糖蛋白激素的不均一性引起理化性質的差別較大，對色譜分離方法的選擇性提出了挑戰 ——既要保證製品的質量，又要有較高的回收率，這是蛋白質純化中一個重要的問題。
[0004]CN101087805中公開了一種重組FSH純化方法，該發明採用超濾、陰離子交換層析、染料親和層析、疏水層析、反相層析以及陰離子交換層析的方法純化重組FSH。CN1890265中公開了一種重組FSH純化的方法，該發明採用超濾、陰離子層析、金屬螯合親和層析、陰離子層析、疏水層析以及反相層析的方法純化FSH，製備的FSH比活性為8876IU/mg。這兩篇專利所涉及的純化工藝步驟較多，純化較為複雜，工業化生產過程中控制點多，對純化工藝可控性帶來一定的困難；另外，反相層析過程相對較慢，需要用到有機溶劑，最終導致產物要檢測有機物殘留，而且以後用於醫藥生產時還要考慮有機溶劑的存放問題，給醫藥生產帶來一定的不便。

【發明內容】

[0005]針對現有技術的不足，本發明提供一種適宜於規模擴大化生產的、快速、高效、簡便的重組人促卵泡激素目的蛋白的純化方法，具有工藝簡單、成本低，目的產物純度高以及中間過程便於控制和易於規模化放大生產等特點。
[0006]本發明將含有重組人促卵泡激素的液體依次經過染料親和層析、疏水作用層析、脫鹽層析和羥基磷灰石層析得到高質量的重組人促卵泡激素目的蛋白。
[0007]本發明的具體步驟為:
[0008]染料親和層析
[0009](I)用平衡緩衝液對染料親和層析柱進行平衡，將含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養上清進行上樣，重組人促卵泡激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上；
[0010](2)用含有NaCl的平衡緩衝液對步驟(1)處理的層析柱進行洗脫，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；[0011]疏水作用層析
[0012](3)用含鹽的平衡緩衝液對疏水層析柱進行平衡，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液；
[0013]脫鹽層析
[0014](4)將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩衝液平衡好的脫鹽柱上進行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液；
[0015]羥基磷灰石層析
[0016](5)用平衡緩衝液對羥基磷灰石層析柱進行平衡，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出並收集，即獲得目的蛋白原液。
[0017]本發明所採用的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養液在純化之前先進行澄清過濾,除去細胞培養液中的菌體等成分。
[0018]染料親和層析過程中，介質選用Blue Sepharose CL-6B、Blue Sepharose 6FastFlow或者Blue Sepharose High Performance,該過程主要用於捕獲細胞培養液中的重組人促卵泡激素目的蛋白，同時除去少量雜質蛋白，而且染料親和層析洗脫液不用經過樣品處理就可以直接進行後續的疏水層析，簡化了操作步驟。當重組人促卵泡刺激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上後採用添加了 NaCl的平衡緩衝液對其進行洗脫，其中NaCl的濃度為 I.0mol/L-2.5mol/L。
[0019]本發明各個步驟所用的平·衡緩衝液為本領域常用的緩衝體系，例如Tris-HCl緩衝液或磷酸鹽緩衝液或H印es緩衝液，緩衝液濃度為lOmmol/L-lOOmmol/L，pH值為
6.5-10.00
[0020]為了去除色素與雜質蛋白，染料親和層析後獲得的蛋白液進一步進行疏水作用層析。疏水作用層析所採用的層析介質苯基瓊脂糖凝膠6 (high sub)或丁基瓊脂糖凝膠4或者辛基-瓊脂糖凝膠4FF。該步驟中的平衡緩衝液通過添加鹽來增加其離子強度，所述的鹽可選擇為 NaCl、(NH4) 2S04 或者 Na2SO4,濃度為 0.5mol/L-2.0mol/L，其中優選 NaCl。
[0021]為了除去疏水層析後蛋白液中的鹽，以進行後續的羥基磷灰石層析，疏水作用層析以後先進行脫鹽層析，所用的層析介質為Sephadex G-25 Fine、Sephadex G-25 Medium、或者Sephadex G-25 Coarse。另外,該脫鹽層析過程在一定程度上也能除去蛋白液中的一些色素和低分子量雜質蛋白。
[0022]雖然經過上述多次層析以後，蛋白液中的色素和雜質蛋白部分得到了去除，但是為了保證最終產品的品質，本發明最後採用了羥基磷灰石層析，去除蛋白液中大量的色素、內毒素以及雜質蛋白，層析介質為Bio-gel羥基磷灰石或者CHT羥基磷灰石，例如Bio-GelHTP Gel> Bio-Gel HTP, DNA Grade、Bio-Gel HT Gel 或者 CHT Ceramic Hydroxyapatite?
[0023]將經過上述層析純化後的穿出液進行納米過濾，即可獲得高純度目的蛋白液。
[0024]綜上所述，本發明首先採用染料親和層析捕獲重組人促卵泡激素目的蛋白，同時除去少量雜質蛋白，然後利用疏水層析、脫鹽層析去除少量色素、少量的雜質蛋白以及低分子量雜質，最終採用羥基磷灰石層析去除大量的色素與雜質蛋白，三種層析方法依次作用，相互補充，最終製得高質量產品，經檢測，本發明製備出的重組人促卵泡激素目的蛋白活性為13000IU/mg，整個純化過程中未採用任何有機溶劑，最終獲得的產品中無有機溶劑殘留，而且本發明所述的製備工藝簡便、快速、規模放大容易，適合大規模生產。【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為SDS-PAGE電泳分析實施例1純化後的重組人促卵泡激素目的蛋白純度圖譜，I為Marker ；2為重組人促卵泡激素目的蛋白原液,純度:99.68%。
[0026]圖2為Sec-HPLC液相分析實施例1純化後的重組人促卵泡激素目的蛋白純度圖譜，純度為99.98% 。
【具體實施方式】
[0027]以下通過實施例將進一步說明本發明，這些實施例不應作為本發明的限制。
[0028]本發明的方法包括順序使用含有重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養液澄清過濾，染料親和層析，疏水層析，脫鹽，羥基磷灰石層析來純化重組人促卵泡刺激素目的蛋白。本發明中所述的層析介質均為市購。
[0029]實施例1
[0030]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0031]染料親和層析
[0032](I)用 2OOml 濃度為 10Ommol /T,, pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩衝液平衡 BlueSepharoseCL-6B層析柱(1.6 X 10cm)，將澄清過濾後的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養液上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上；
[0033](2)用含有 2.0mol/L NaCl 的濃度為 100mmol/L、pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩衝液作為洗脫液對步驟(1)處理的層析柱進行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0034]疏水作用層析
[0035](3)用 20ml 含有 2.0mol/L NaCl 的濃度為 100mmol/L, pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩衝液平衡苯基瓊脂糖凝膠6 (high sub)，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結束繼續用含有2.0mol/L NaCl的濃度為100mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl緩衝液平衡，平衡至UV280小於IOOmAU ；
[0036]脫鹽層析
[0037](4)用 300ml 濃度為 100mmol/L，pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩衝液平衡 S印hadex G-25Fine (1.6X70cm)層析柱，平衡結束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣進行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結束；
[0038]羥基磷灰石層析
[0039](5)用 100ml 濃度為 IOOmmoI/L, pH 為 8.0 的 Tris-HCl 緩衝液平衡 Bio-GelHTPGel (1.6X5cm)層析柱，平衡結束後，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出並收集，上樣結束繼續用濃度為100mmol/L、pH為8.0的Tris-HCl緩衝液平衡，平衡至UV280小於lOOrnAU。
[0040]將穿出液進行納米過濾，所獲得的目的蛋白液採用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達到99.98%。
[0041]實施例2
[0042]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:[0043]染料親和層析
[0044](I)用 200ml 濃度為 50mmol/L，pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩衝液平衡 Blue SepharoseHigh Performance層析柱(1.6X 10cm),將澄清過濾後的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養上清進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上；
[0045](2)用含有 1.0mol/L NaCl 的濃度為 50mmol/L、pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩衝液作為洗脫液對步驟(1)處理的層析柱進行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0046]疏水作用層析
[0047](3)用 20ml 含有 1.0mol/L NaCl 的濃度為 50mmol/L、pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩衝液平衡苯基瓊脂糖凝膠6 (high sub)，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結束繼續用含有0.5mol/L NaCl的濃度為50mmol/L、pH為7.0的Tris-HCl緩衝液平衡，平衡至UV280小於IOOmAU ；
[0048]脫鹽層析
[0049](4)用 300ml 濃度為 50mmol /L，pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩衝液平衡 S印hadex G-25Fine (1.6X70cm)層析柱，平衡結束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩衝液平衡好的脫鹽柱上進行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結束；
[0050]羥基磷灰石層析
[0051](5)用 100ml 濃度為 50mmol/L, pH 為 7.0 的 Tris-HCl 緩衝液平衡 Bio-GelHTPGel (1.6X5cm)層析柱，平衡結束後，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出並收集，上樣結束繼續用濃度為50mmol/L、pH為7.0的Tris-HCl緩衝液平衡，平衡至UV280小於lOOrnAU。
[0052]將穿出液進行納米過濾，所獲得的目的蛋白液採用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達到98.95%。
[0053]實施例3
[0054]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0055]染料親和層析
[0056](I)用200ml濃度為20mmol/L, pH為10.0的磷酸鹽緩衝液平衡Blue Sepharose
6Fast Flow層析柱(1.6X10cm)，將澄清過濾後的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養上清進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上；
[0057](2)用含有2.5mol/L NaCl的濃度為20mmol/L、pH為10.0的磷酸鹽緩衝液作為洗脫液對步驟(1)處理的層析柱進行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0058]疏水作用層析
[0059](3)用20ml含有0.5mol/L NaCl的濃度為20mmol/L、pH為10.0的磷酸鹽緩衝液平衡丁基瓊脂糖凝膠4，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結束繼續用含有0.5mol/L NaCl的濃度為20mmol/L、pH為10.0的磷酸鹽緩衝液平衡，平衡至UV280小於IOOmAU ；
[0060]脫鹽層析
[0061](4)用300ml濃度為20mmol/L, pH為10.0的磷酸鹽緩衝液平衡Sephadex G-25Medium (1.6X70cm)層析柱，平衡結束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩衝液平衡好的脫鹽柱上進行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結束；
[0062]羥基磷灰石層析[0063](5)用100ml濃度為20mmol/L，pH為10.0的磷酸鹽緩衝液平衡Bio-GelHT Gel(1.6X5cm)層析柱，平衡結束後，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出並收集，上樣結束繼續用濃度為20mmol/L、pH為10.0的磷酸鹽緩衝液平衡，平衡至UV280小於lOOrnAU。
[0064]將穿出液進行納米過濾，所獲得的目的蛋白液採用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達到99.95%。
[0065]實施例4
[0066]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0067]染料親和層析
[0068](I)用200ml濃度為60mmol/L, pH為7.0的磷酸鹽緩衝液平衡Blue SepharoseHigh Performance層析柱(1.6X 10cm),將澄清過濾後的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養上清進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上；
[0069](2)用含有1.0mol/L NaCl的濃度為60mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩衝液作為洗脫液對步驟(1)處理的層析柱進行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0070]疏水作用層析
[0071](3)用20ml含有1.0mol/L NaCl的濃度為60mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩衝液平衡丁基瓊脂糖凝膠4，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結束繼續用含有1.0mol/L NaCl的濃度為60mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩衝液平衡，平衡至UV280小於IOOmAU ；
[0072]脫鹽層析
[0073](4)用300ml濃度為60mmol/L, pH為7.0的磷酸鹽緩衝液平衡Sephadex G-25Medium (1.6X70cm)層析柱，平衡結束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩衝液平衡好的脫鹽柱上進行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結束；
[0074]羥基磷灰石層析
[0075](5)用100ml濃度為60mmol/L，pH為7.0的磷酸鹽緩衝液平衡Bio-Gel HT Gel(1.6X5cm)層析柱，平衡結束後，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出並收集，上樣結束繼續用濃度為50mmol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩衝液平衡，平衡至UV280小於lOOrnAU。
[0076]將穿出液進行納米過濾，所獲得的目的蛋白液採用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達到99.97%。
[0077]實施例5
[0078]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0079]染料親和層析
[0080](I)用 200ml 濃度為 10mmol/T,, pH 為 6.5 的 Hepes 緩衝液平衡 Blue SepharoseCL-6B層析柱(1.6X 10cm)，將澄清過濾後的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養上清進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上；
[0081](2)用含有1.0mol/L NaCl的濃度為10mmol/L、pH為6.5的Ifepes緩衝液作為洗脫液對步驟(1)處理的層析柱進行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0082] 疏水作用層析
[0083](3)用 20ml 含有 2.0mol/L NaCl 的濃度為 10mmol/L、pH 為 6.5 的 Hepes 緩衝液平衡辛基-瓊脂糖凝膠4FF，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結束繼續用含有2.0mol/L NaCl的濃度為10mmol/L、pH為6.5的Ifepes緩衝液平衡,平衡至UV280小於IOOmAU ；
[0084]脫鹽層析
[0085](4)用 300ml 濃度為 10mmol/T,, pH 為 6.5 的 Hepes 緩衝液平衡 Sephadex G-25Coarse (1.6 X 70cm)層析柱，平衡結束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩衝液平衡好的脫鹽柱上進行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結束；
[0086]羥基磷灰石層析
[0087](5)用 100ml 濃度為 10mmol/L, pH 為 6.5 的 Hepes 緩衝液平衡 Bio-Gel HTP, DNAGrade (1.6 X 5cm)層析柱，平衡結束後，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出並收集，上樣結束繼續用濃度為10mmol/L、pH為6.5的Ifepes緩衝液平衡，平衡至UV280小於lOOrnAU。
[0088]將穿出液進行納米過濾，所獲得的目的蛋白液採用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達到99.96%。
[0089]實施例6
[0090]一種重組人促卵泡激素的純化方法，其具體步驟為:
[0091]染料親和層析
[0092](I)用 200ml 濃度為 100mmol/L, pH 為 9.0 的 Hepes 緩衝液平衡 Blue Sepharose
6Fast Flow層析柱(1.6X10cm)，將澄清過濾後的含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養上清進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上；
[0093](2)用含有2.0mol/L NaCl的濃度為IOOmmoI/L, pH為9.0的Hepes緩衝液作為洗脫液對步驟(1)處理的層析柱進行洗脫，使目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液；
[0094]疏水作用層析
[0095](3)用 20ml 含有 2.0mol/L NaCl 的濃度為 100mmol/L、pH 為 9.0 的 Hepes 緩衝液平衡辛基-瓊脂糖凝膠4FF，將步驟(2 )中的洗脫蛋白液進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液，上樣結束繼續用含有2.0mol/L NaCl的濃度為IOOmmoI/L, pH為9.0的Ifepes緩衝液平衡,平衡至UV280小於IOOmAU ；
[0096]脫鹽層析
[0097](4)用 300ml 濃度為 100mmol/L, pH 為 9.0 的 Hepes 緩衝液平衡 Sephadex G-25Coarse (1.6 X 70cm)層析柱，平衡結束，將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩衝液平衡好的脫鹽柱上進行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液，收至IOOmAU結束；
[0098]羥基磷灰石層析[0099](5)用 100ml 濃度為 100mmol/L，pH 為 9.0 的!fepes 緩衝液平衡 CHT CeramicHydroxyapatite (1.6 X 5cm)層析柱,平衡結束後,將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出並收集，上樣結束繼續用濃度為IOOmmol/L、pH為9.0的Ifepes緩衝液平衡，平衡至UV280小於lOOrnAU。
[0100] 將穿出液進行納米過濾，所獲得的目的蛋白液採用SDS-PAGE與Sec-HPLC方法檢測重組人促卵泡激素目的蛋白純度可以達到99.90%。
【權利要求】
1.一種重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:其具體步驟為: 染料親和層析 (1)用平衡緩衝液對染料親和層析柱進行平衡，將含重組人促卵泡激素目的蛋白的細胞培養上清進行上樣，重組人促卵泡激素目的蛋白吸附於染料親和層析介質上； (2)用含有NaCl的平衡緩衝液對步驟(1)處理的層析柱進行洗脫，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出染料親和層析柱，收集洗脫蛋白液； 疏水作用層析 (3)用含鹽的平衡緩衝液對疏水層析柱進行平衡，將步驟(2)中的洗脫蛋白液進行上樣，使重組人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水層析柱，收集穿出蛋白液； 脫鹽層析 (4)將步驟(3)中的穿出蛋白液上樣到用平衡緩衝液平衡好的脫鹽柱上進行脫鹽，收集脫鹽的蛋白液； 羥基磷灰石層析 (5)用平衡緩衝液對羥基磷灰石層析柱進行平衡，將步驟(4)中收集的蛋白液上樣到羥基磷灰石層析柱上，重組人促卵泡激素目的蛋白穿出並收集，即獲得目的蛋白原液。
2.根據權利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:染料親和層析的介質選用 Blue Sepharose CL-6B 或 Blue Sepharose 6 Fast Flow 或 Blue SepharoseHigh Performance。
3.根據權利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:步驟(1)- (5)中所用的平衡緩衝液為Tris-HCl緩衝液或磷酸鹽緩衝液或Ifepes緩衝液，緩衝液濃度為IOmmoI/L-1OOmmoI/L, pH 值為 6.5-10.0。
4.根據權利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:步驟(2)中的平衡緩衝液中NaCl的濃度為1.0mol/L-2.5mol/L。
5.根據權利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:步驟(3)中所述的疏水層析採用的層析介質為苯基瓊脂糖凝膠6 (high sub)或丁基瓊脂糖凝膠4或者辛基-瓊脂糖凝膠4FF。
6.根據權利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:步驟(3)中的鹽為 NaCl 或(NH4) 2S04 或者 Na2SO4,濃度為 0.5mol/L_2.0moI/L0
7.根據權利要求6所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:步驟(3)中的鹽為 NaCl。
8.根據權利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:步驟(4)中的脫鹽層析介質為 Sephadex G-25 Fine 或 Sephadex G-25 Medium 或 Sephadex G-25 Coarse。
9.根據權利要求1所述的重組人促卵泡激素的純化方法，其特徵在於:步驟(5)中羥基磷灰石層析介質為Bio-gel羥基磷灰石或者CHT羥基磷灰石。
【文檔編號】C07K1/20GK103570820SQ201210276894
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月6日 優先權日:2012年8月6日
【發明者】陳俊良, 孫麗霞, 王晶翼, 孫波, 邢婷婷, 孫旭, 張宗輝 申請人:齊魯製藥有限公司