一種監測溶瘤性腺病毒體內複製情況和範圍的方法

2023-05-18 23:55:51

一種監測溶瘤性腺病毒體內複製情況和範圍的方法
【專利摘要】本發明屬於分子標記【技術領域】，具體公開了一種監測溶瘤性腺病毒體內複製情況和範圍的方法。本發明將標記基因HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因組內，得到攜帶HSV-1TK基因的溶瘤性腺病毒，將病毒感染治療受體，可以利用對HSV-1TK成像的方法來間接反映溶瘤性腺病毒的表達情況和體內分布情況，從而實現非侵入和實時的監測溶瘤性腺病毒在體內複製和分布範圍。另外，標記基因HSV-1TK本身也是治療基因，與溶瘤性腺病毒在腫瘤基因治療中能起到協同殺傷腫瘤作用。
【專利說明】一種監測溶瘤性腺病毒體內複製情況和範圍的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子標記【技術領域】，更具體地，涉及一種監測溶瘤性腺病毒體內複製 情況和範圍的方法。

【背景技術】
[0002] 腺病毒因具有感染效率高、宿主範圍廣、容納量大、非整合性等特點而成為基因轉 移中最具前景的基因載體之一，並且被廣泛地改造成各種類型的溶瘤性腺病毒，應用於腫 瘤基因治療的研究之中。溶瘤性腺病毒是能特異性感染腫瘤細胞並在腫瘤細胞中大量複製 最終裂解腫瘤細胞，釋放出來以感染更多腫瘤細胞的一類病毒，同時這些病毒因無法在正 常細胞內複製而對正常細胞副作用小。溶瘤性腺病毒所攜帶的治療基因，在病毒複製的同 時，治療基因拷貝數也相應增加，這樣就使病毒溶瘤效應和基因治療作用結合起來，即"病 毒-基因治療"，起到治療的協同效應。"病毒-基因治療"要想成熟的運用於臨床，還要考 慮病毒使用的安全性和評價治療的有效性，即如何監測溶瘤性腺病毒在體內複製和播散情 況。
[0003] 目前常規是通過取活檢用免疫組化方法來檢測溶瘤性腺病毒在體內複製情況和 複製範圍，但這種方法存在著明顯的缺點：（1)對機體造成損傷，也不能進行重複連續觀 察。（2)不能方便實時獲得病毒在體內的分布和複製的信息。
[0004] HSV-1TK是一個被廣泛研究的基因。不僅可用來對多種腫瘤的基因治療。同時 HSV-1TK也是應用於分子成像較為成熟的"標記基因"。HSV-1TK酶的三個常用"標記底物" 是IUdR、GCV和FIAU，放射性標記底物可用於非侵入的分子成像。FIAU做為一個潛在的"標 記底物"，是因為它是典型的2' -氟代核苷類似物，放射性標記的碘（I)或碳（C)能摻入分子 中，可用gamma相機和SPECT成像。已有的研究表明，FIAU經放射性標記後，分子成像的穩 定性優於IUdR或GCV。基於此，以HSV-1TK基因做為"標記基因"，FIAU做為"標記底物"來 進行體內分子成像。


【發明內容】

[0005] 本發明為了克服現有技術的上述不足，提供一種監測溶瘤性腺病毒體內複製情況 和範圍的方法。所述方法能夠實現非侵入和實時監測溶瘤性腺病毒複製、播散、分布情況。
[0006] 為了實現上述目的，本發明是通過以下方案予以實現的。
[0007] -種監測溶瘤性腺病毒體內複製情況和範圍的方法，包括如下步驟：將標記基因 HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因組內，得到攜帶HSV-1TK基因的溶瘤性腺病毒，病毒感 染治療受體，利用對HSV-1TK體內分子成像的方法來間接反映溶瘤性腺病毒在治療受體內 的複製情況和體內分布情況。
[0008] 優選地，所述體內分子成像的方法為gamma相機成像或SPECT成像。
[0009] 優選地，所述標記基因 HSV-1TK以FIAU為標記底物，且FIAU的集聚水平與 HSV-1TK基因表達水平成正比。
[0010] 用溶瘤性腺病毒攜帶標記基因 HSV-1TK，當溶瘤性腺病毒在體內複製的時候，所攜 帶標記基因拷貝數也相應增加。由於基因拷貝數的增加和病毒的複製情況是成正比的，通 過對目的基因分子成像，就能間接監測病毒在活體器官或組織中的位置和劑量，來反映病 毒複製和體內播散情況。
[0011] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 本發明將標記基因 HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因組內，得到攜帶HSV-1TK基因 的溶瘤性腺病毒，病毒感染治療受體，可以利用對HSV-1TK成像的方法來間接反映溶瘤性 腺病毒的複製情況和體內分布情況，從而實現非侵入和實時的監測溶瘤性腺病毒在體內復 制和分布範圍。另外，標記基因 HSV-1TK本身也是治療基因，與溶瘤性腺病毒在腫瘤基因治 療中能起到協同殺傷腫瘤作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1.在NCIH460TK+細胞株中，檢測HSV-1TK mRNA表達、前藥GCV敏感性和FIAU 集聚水平三者間的關係；（A)HSV-ITK mRNA表達與前藥GCV敏感性關係；（B)HSV-ITK mRNA 表達與FIAU集聚水平的關係；（C) FIAU集聚水平與前藥GCV的關係。
[0013] 圖2. Gamma相機體內成像方法監測HSV-1TK基因的表達，其中，圖A中箭頭所示為 NCIH460TK+所成腫瘤，對側為野生型NCIH460所成腫瘤；圖B為靜脈注射2-[14C]FIAU 24小 時後gamma相機成像；圖C為靜脈注射2-[14C]FIAU 36小時後gamma相機成像。
[0014] 圖3.標記基因 HSV-1TK表達情況和溶瘤性腺病毒複製情況成線性關係。

【具體實施方式】
[0015] 下面結合說明書附圖和具體實施例來詳細解釋本發明，下列實施例並不能用於限 定本發明所保護的範圍。其中關於重組載體的構建、病毒感染細胞或動物的方法均為本領 域常規的方法，另外實施例中沒有詳細描述的分子生物學方法都參考本領域分子生物學的 常規操作來執行。
[0016] 實施例1本發明監測方法建立的依據 一、細胞水平研究FIAU的集聚水平與HSV-1TK基因表達水平成正比。
[0017] 1、製備穩定轉染HSV-1TK基因的NCIH460細胞株：轉染前24h接種NCIH460細胞 到6孔板中，轉染當天當細胞密度達到6(Γ80%時，用pcDNA3. 1-TK (攜帶HSV-1TK基因的 真核表達載體）轉染NCIH460,轉染方法按照轉染試劑Lipofectamine2000操作方法進行。 轉染48h後用G418抗生素進行篩選，以1(Γ14天細胞全部死亡的G418濃度為最佳篩選濃 度。用含維持濃度G418培養基維持細胞生長，直至篩選克隆可見為止。分離克隆放大培養 並獲得一定細胞數量後，用RT-PCR和Western方法鑑定，鑑定成功的細胞即是穩定轉染了 HSV-TK基因的NCIH460細胞系。
[0018] 2、篩選出穩定轉染HSV-1TK基因的NCIH460細胞株，命名為NCIH460TK+。然後，評 價在NCIH460TK+中是否FIAU集聚水平與HSV-1TK基因表達水平成正比，評價過程：為了評 價在NCIH460TK+中是否FIAU集聚水平與HSV-1TK基因表達水平成正比，從兩方面做了檢 測：（1) NCIH460TK+ 對前藥 GCV 的敏感性；（2) NCIH460TK+ 中 HSV-1TK 的 mRNA 表達水平。 結果如圖1所示，FIAU的集聚水平與HSV-1TK基因表達水平以及對前藥GCV的敏感性具有 高度的一致性。說明在體外實驗中，用HSV-1TK做為"標記基因"，放射性標記的FIAU做為 "標記底物"，能成功的反映出細胞中所轉染的HSV-1TK基因表達水平。體外實驗為HSV-1TK 做為"標記基因"和FIAU做為"標記底物"的體內分子成像可行性奠定了良好的基礎。
[0019] _、小鼠動物體內研究標記基因的體內表達情況。
[0020] 用Gamma相機方法體內成像檢測HSV-1TK基因的表達：將步驟一的NCIH460TK+細 胞株接種裸鼠一側皮下成瘤，對側用野生型NCIH460成瘤做為對照。待腫瘤生長到直徑為 3. 2±0. 6cm時，靜脈注射50 MCi 2-[14C]FIAU，用gamma相機分別於24、36小時後進行成 像，顯示出裸鼠體內分布和代謝示蹤劑(如圖2)。結果表明，在靜脈注射2-[ 14C]FIAU 24小 時和36小時後，用NCIH460TK+所成腫瘤區域有高水平的2-[14C]FIAU來源的放射活性。而 野生型NCIH460所成腫瘤和鼠的其它器官沒有顯示大量放射活性。
[0021] 實施例2 一種監測溶瘤性腺病毒體內複製情況和範圍的方法，具體包括如下步驟： 1、將標記基因 HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒基因組內，得到攜帶HSV-1TK基因的重組 溶瘤性腺病毒，具體方法如下： (1)穿梭質粒PDC311- (hTERT-ElA)- (CMV-TK)載體構建：構建攜帶端粒酶啟動子 (hTERT)調控E1A基因表達框和CMV啟動子調控HSV-1TK基因表達框的腺病毒穿梭質粒 pDC311- (hTERT-ElA)- (CMV- TK)。
[0022] (2) Ad- (hTERT-ElA) - (CMV- TK)病毒的包裝和鑑定：採用AdMax?腺病毒 系統包裝腺病毒，重組穿梭質粒PDC311- (hTERT-ElA) - (CMV -TK)和腺病毒骨架質粒 pBHGlox Δ E13cre用脂質體lipofectamine 2000共轉染包裝細胞293,於轉染後第5天經 胰酶消化，接種到l〇cm培養盤中，繼續培養一周，即可觀察到局部細胞形態出現變圓漂起， 隨之形成典型的彗星狀病變。待病變進一步擴大，大部分細胞變圓漂起時，收集細胞及其培 養液，反覆凍融三次後，作為原始病毒保存於_80°C。從中取出少量用病毒空斑法篩選三輪， 獲得預定的毒株，命名為Ad- (hTERT-ElA)- (CMV-TK)。採用Western blot方法檢測重組 腺病毒所攜帶的外源基因 E1A和HSV-1TK蛋白表達情況。鑑定正確的病毒就是攜帶hTERT 調控的E1A表達框和CMV啟動子調控TK基因表達框的重組溶瘤性腺病毒。病毒的複製特 性由hTERT所調控，可以選擇性的在hTERT活性高的腫瘤細胞中進行複製，而在hTERT活性 低的正常細胞中不複製。病毒所攜帶的HSV-TK，在病毒複製的同時，HSV-1TK基因的拷貝數 也相應的增加。
[0023] 2.研究溶瘤性腺病毒體內分布和表達情況：在裸鼠兩前上肢和一側後下肢接種 野生型腫瘤細胞，另一側後下肢接種攜帶標記基因 HSV-1TK的溶瘤性腺病毒作為陽性對 照。待腫瘤生長直徑達到3±0.6cm時。從靜脈給予2-[14C]FIAU。並於給予2-[ 14C]FIAU 後的4、24、36和48小時用gamma相機或SPECT成像，優化成像時間。在上述時間點體內 成像後殺死裸鼠，並迅速剝取腫瘤，用滴度測定方法檢測溶瘤性腺病毒的表達量和範圍，和 gamma相機和SPECT成像進行比較。
[0024] 檢測結果：4、24、36和48小時用gamma相機或SPECT成像結果顯示NCIH460TK+ 所成腫瘤區域有高水平的2-[ 14C]FIAU來源的放射活性，隨著時間點的延長，放射活性也增 強。用滴度測定和免疫組化的方法反映體內腺病毒複製情況和範圍，顯示隨著時間點的增 力口，病毒複製也增加，與2-[ 14C]FIAU來源的放射活性增加成正比。病毒分布的範圍都可以 檢測到2-[14C]FIAU來源的放射活性，結果見圖3。從圖3結果可知，標記基因"HSV-1TK表 達情況和溶瘤性腺病毒複製情況成線性關係。
【權利要求】
1. 一種監測溶瘤性腺病毒體內複製情況和範圍的方法，其特徵在於，將標記基因 HSV-1TK整合到溶瘤性腺病毒的基因組內，得到攜帶HSV-1TK基因的溶瘤性腺病毒；病毒感 染治療受體，利用對HSV-1TK體內分子成像的方法來間接反映溶瘤性腺病毒在治療受體內 的複製情況和體內分布情況。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述體內分子成像的方法為gamma相機成 像或SPECT成像。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述標記基因 HSV-1TK以FIAU為標記底 物，且FIAU的集聚水平與HSV-1TK基因表達水平成正比。
【文檔編號】C12Q1/70GK104195174SQ201410375784
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】張巨峰, 羅霞 申請人:廣東藥學院