一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗及其製備方法
2023-05-05 19:28:51
一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗及其製備方法
【專利摘要】本發明所述的一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗，其特徵在於，利用魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體的雜交瘤細胞株(2F4)中克隆出重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區基因，通過基因重組構建scFv及原核表達載體PET32a-AL，轉化大腸桿菌BL21後用IPTG誘導表達。表達後的重組蛋白利用動物免疫試驗進行免疫原性鑑定。scFv基因序列全長747鹼基對，編碼249個胺基酸，符合小鼠免疫球蛋白可變區基因特徵，含有框架區(FRs)、抗原互補決定區(CDRs)及抗體特徵性的半胱氨酸殘基。ELISA測定和動物免疫試驗顯示抗獨特性抗體的scFv具有與溶藻弧菌一樣的免疫原性。
【專利說明】一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程【技術領域】，具體涉及一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗的製備方法。
【背景技術】
[0002]溶藻弧菌(Vibrio, alginolyticus)是引起牙鮃、鰻鱺等許多名貴經濟魚類致病的病菌之一，嚴重威脅著我國水產養殖業的發展。可給漁業和養殖業帶來巨大的經濟損失。傳統防治溶藻弧菌感染的方法主要採用抗生素和減毒、滅活疫苗。抗生素的長期使用可使魚類產生耐藥性，而且殘留的抗生素可通過食物鏈對人類造成危害。減毒疫苗的安全性難以掌握；而用物理、化學方法製備的滅活疫苗，抗原活性可能遭到破壞，且殘存的雜質還可能引起魚的炎症反應而死亡。
[0003]針對引起細菌性魚病的溶藻弧菌抗獨特型抗體具有良好的免疫原性和安全性，而由基因工程構建的抗獨特型抗體可變區的小分子單鏈抗體一不但具備有分子量小，穿透力強，易於大量生產和降低成本等優點。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種抗體分子小，免疫原性低，組織穿透力強，使用方便，有效，可行，可大規模生產的魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗。
[0005]為實現上述 目的，本發明採用的技術方案為:
[0006]本發明所述的一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗，其特徵在於，利用魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體的雜交瘤細胞株(2F4)中克隆出重鏈(Vh)和輕鏈(\)可變區基因，通過基因重組構建 scFv及原核表達載體PET32a-AL，轉化大腸桿菌BL21後用IPTG誘導表達。表達後的重組蛋白利用動物免疫試驗進行免疫原性鑑定。scFv基因序列全長747鹼基對，編碼249個胺基酸，符合小鼠免疫球蛋白可變區基因特徵，含有框架區(FRs)、抗原互補決定區(CDRs)及抗體特徵性的半胱氨酸殘基。ELISA測定和動物免疫試驗顯示抗獨特性抗體的scFv具有與溶藻弧菌一樣的免疫原性。魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗，其基因序列和胺基酸序列如下:
【權利要求】
1.一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗，其特徵在於，利用魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體的雜交瘤細胞株克隆出重鏈(Vh)和輕鏈可變區基因，用(Gly4Ser)3組成的連接肽(linker)連接Vh和Vlj,構建Va-1inker-Vlj形式的單鏈抗體scFv基因,在大腸桿菌中表達，獲得魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗，基因序列全長747鹼基對，編碼249個胺基酸，其基因序列和胺基酸序列如下:
2.根據權利要求1所述的一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗，其特徵在於，構建單鏈抗體scFv基因引物序列為: Lback 5' -TCGACAGGTGGAGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCC-3， LFor 5' -CATCTGGATGTCAGAACCACCACCACCGGATCCACCACCACCGGAGCCGCCGCCGCC-3'。
3.實現權利要求1所述的一種魚類溶藻弧菌抗獨特型抗體基因工程疫苗的製備方法，其特徵在於，具體的步驟如下: 1)用重組PCR的方法，將已獲得的\和Vh基因以連接肽linker(Gly4Ser) 3連接，設計連接肽I inker的引物，斜體的為BamHI酶切位點，在反應體系中分別以回收的\和Vh基因為模板，加入 LBari^P VHFot、LFot和 Vlfeek 引物，參數為:94°C 3min，94°C 30s, 52°C 60s, 72°C 60s,30次循環，進行PCR擴增，10g/L瓊脂糖凝膠電泳並回收後的PCR產物用BamH I酶切後用T4連接酶連接，連接產物與PMD18-T vector連接，轉化感受態細菌E.col1.DH_5a，篩選陽性克隆提取質粒，篩選後的質粒命名為PET32a-AL，對PET32a_AL進行PCR鑑定，通用引物T7進行測序； 2)將PET32a-AL轉化BL21，挑取陽性克隆IPTG誘導表達，表達產物在破壁緩衝液中冰浴Ih和超聲破碎菌體4次，變性液:20mmol Tris-HCL, ρΗ7.5，IOmmol EDTA, 10g/LTritonX-100，復性液:2.5mmol Tris-HCL，pH7.5,0.0lmol NaCL, lOg/L 甘油，0.lmol/L 脲，離心收集上清液透析後純化。
【文檔編號】C07K16/12GK103463645SQ201210183806
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年6月6日 優先權日:2012年6月6日
【發明者】付建芳, 黃威權, 塗豔陽, 付菊芳 申請人:付建芳, 塗豔陽, 付菊芳, 黃威權