用於肝纖維化診斷的生物標記的製作方法

2023-05-05 22:45:51

專利名稱：用於肝纖維化診斷的生物標記的製作方法
用於肝纖維化診斷的生物標記相關申請本申請要求2008年12月2日提交的美國臨時申請61/119，077號的優先權，其內容通過全文提述併入本文。
背景技術：
肝纖維化涉及細胞外基質蛋白(extracellular matrix proteins)(例如膠原蛋白)在肝臟細胞上過度聚集而產生疤痕組織。其發生於大部分慢性肝臟疾病中，例如代謝性肝臟疾病及與那些B肝或C肝感染和飲酒(alcoholconsumption)相關的肝病。較嚴重的肝纖維化導致肝硬化(cirrhosis)、肝癌、肝衰竭(liver failure)與門靜脈高壓 (portal hypertension)。目前，肝活檢(biopsy)是用來偵測肝纖維化和確認其嚴重度的最適方法。然而， 肝活檢為有創性(invasive)步驟，並非理想診斷方法。基於纖維化相關血清生物標記的無創(non-invasive)血清學(serology)分析已被開發用來診斷肝臟纖維化。此分析的準確度與靈敏度非常依賴所使用的生物標記。因此， 鑑定具高靈敏度以區分纖維化患者與非纖維化人類的可靠生物標記是非常重要。

發明內容本發明基於診斷肝纖維化的三種新穎血清生物標記，即尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活齊Ll (urokinase type plasminogen activator, uPA)、基質金屬蛋白酶 9 (matrix metalloproteinases 9,MMP9 ；)禾Π β_2_ 微球蛋白(β -2-microglobulin, β -2MG)之非預期的鑑定。因此，本發明的一個方面特徵為基於上列三種生物標記中一或多個的表達水平，且任選地結合一個或多個其他血清生物標記，例如穀氨酸草醯乙酸轉胺酶 (glutamic oxaloacetic transaminase, GOP)、穀氨酸丙酮酸轉氨酶(glutamic pyruvic transaminase, GPT)與甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)以供診斷肝纖維化的方法。上述診斷方法包括至少四個步驟(i)自被懷疑具有肝纖維化的人類受試者(例如B肝或C肝病毒攜帶者，或具有酒精相關的肝病或代謝性肝病的患者)獲得血樣，(ii) 檢測上述所列生物標記中的一個或多個在該血樣中的表達水平，(iii)基於該表達水平計算其疾病分數，(iv)基於該疾病分數確定該個體是否具有纖維化。診斷方法在步驟(iv)之後可任選地包括另外的步驟(ν)基於該疾病分數與指示不同纖維化階段(stage)的預先確認的截斷值(cutoff value)進行比較來評估該個體的纖維化階段。本文中使用的術語 「診斷」意指確認於受試者(例如，人類)中肝纖維化的存在與否或評估於受試者中的疾病程度。血樣可為獲得自血液的任何樣本，如血清樣本或血漿樣本。該疾病分數可藉由判別函數分析(discriminant function analysis)、嶺回歸分析(ridge regression analysis)或對數回歸分析(logistic regression analysis)對該生物標記表達水平進行分析運算。
本發明的另一個方面特徵為含有至少兩種抗體(例如，完整的免疫球蛋白分子) 的診斷試劑盒，兩種抗體之一為特異於uPA、MMP9或i3-2MG的抗體，而另一個則為特異於沾八、匪 9、0-21^、601\6 11或4 的抗體。此兩種抗體具有不同的抗原特異性。優選地， 試劑盒基本上由上述提及的抗體所組成，即僅包含特異於待檢測抗原(例如，纖維化相關生物標記)的抗體，以供診斷肝纖維化。在一個例子中，試劑盒含有抗-uPA抗體，抗-MMP9 抗體，以及抗-0-2MG抗體。本發明範圍亦包含上述任何抗體在診斷肝纖維化中或在製造肝纖維化診斷試劑盒中的用途。本發明一個或多個實施方案的細節列舉於以下的敘述中。自以下數個實施方案的詳細敘述，以及自所附的權利要求會彰顯本發明的其它特徵或優點。
具體實施方式在一方面，本發明與診斷肝纖維化的方法相關，其基於個體的uPA、MMP9、β _2MG、 其組合，或(a)uPA、MMP9、β-2MG中一種或多種和(b)包括一種或多種其他纖維化生物標記(例如GOP、GPT和AFP)的組合在血液中的濃度。此方法可施用於有需要的人類患者以確認該患者中肝纖維化的存在與否，或他或她的纖維化階段。人類患者可為B肝病毒或C肝病毒的攜帶者，或具有與酒精相關的疾病(例如，脂肪肝(fatty liver)與酒精性肝炎 (alcoholich印atitis))、代謝性肝病或肝癌的患者。人類uPA具有兩種同工型(isoform)，兩者皆可用於本發明的診斷方法中。同工型1的GenBank登錄號為NP_002649. 1 (18-0CT-2009)，而同工型2的GenBank登錄號為 NP_001138503. 1 (18-0CT-2009)。其它兩個新穎的標記，MMP9 與 β -2MG 的 GenBank 登錄號分別為 NP_004985. 2 Q2-N0V-2009)和 NP_004039. 1 (25-0CT-2009)。為了實施本發明的方法，血樣可獲得自被懷疑具有肝纖維化的人類受試者且可藉由常規方法，例如ELISA與Westernblot來確定上述提及的生物標記中一個或多個的水平。對生物標記水平的數據進行合適的分析(例如，判別函數分析(discriminant function analysis)、對數回歸分析(logistic regressionanalysis)、嶺回歸分析(ridge regression analysis) Κ 分分豐斤(principalcomponent analysis))以產生生物標記的血液分布(blood profile)的疾病分數(例如藉由數值的數字來表現)。可視需要將臨床因素(例如年齡與性別)而置入考慮中。之後將疾病分數與區分肝纖維化有無的截斷值(cutoff-value)，或者與區分不同纖維化階段的一組截斷值進行比較以評估該受試者是否具有肝纖維化，且若有，位於哪個病程中。截斷值可藉由使用相同分析方法，分析在無纖維化的受試者中與在不同水平的肝纖維化患者中的相同生物標記的血液分布來確定。 例如，其可為介於無纖維化受試者的疾病分數與纖維化患者的疾病分數間的中點(middle point)ο下述為基於被鑑定為與不同程度纖維化相關的因素確定(determining)前述截斷值的示例性步驟(1)將肝纖維化患者根據其疾病狀況(例如纖維化階段與風險因素)歸類於不同群組；(2)確定在患者中可能與纖維化階段相關的潛在因素；
(3)藉由單變量分析(univariate analysis)來鑑定那些在不同患者群組間顯著不同的潛在因子；(4)對這些經鑑定的因素進行判別函數分析、對數回歸分析、嶺回歸分析或廣義線性模型(generalized linear model)以評估在纖維化診斷中的各因素的獨立值；(5)基於被鑑定的因素(包括纖維化相關生物標記，以及如果適用，臨床因素)，建立判別、嶺回歸或對數回歸模型(例如，公式)以計算疾病分數，和(6)基於表現各患者群組的疾病分數(例如，平均值)，與其它相關因素，例如敏感性、特異性、陽性預測值(Positive predictive value, PPV)與陰性預測值(Negative predictive value, PPV)，來決定對於各疾病水平的截斷值。可藉由接受者操作特徵分析(receiver operating characteristic，ROC)就其診斷價值評估遵循上述步驟確立的判別、嶺回歸或對數回歸模型以產生ROC曲線。在接受者操作特徵分析中，其最佳多變項模型(multivariable model)提供大的曲線下面積(Area under Curve, AUC)。參見敘述於以下實施例1_3中的模型。本發明範圍亦包含用於上述診斷方法中的試劑盒。此試劑盒包含一個或多個特異於纖維化相關物標記uPA、MMP9和β -2MG，以及視需要，其他感興趣的標記(例如GOT、GPT 和AFP)的抗體。在一個實例中，試劑盒包括與相同生物標記結合的兩種不同抗體(即塗覆抗體(coating antibody)與檢測抗體)。通常檢測抗體可藉由其本身或是經由與其它試劑結合，而結合於發射可檢測訊號的分子。本文中使用的術語「抗體」意指完整的免疫球蛋白或保留抗原結合活性的其片段，例如Fab或F(ab』)2。其可為自然發生或經遺傳工程改造的(例如，單鏈抗體、嵌合抗體(chimeric antibody)或人源化抗體)。可自商業製造供貨商獲得包含於本發明的試劑盒中的抗體。或者，可藉由常規方法製備出它們。參見，例如 Harlow and Lane, (1988)Antibodies =ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。為了產生抗如上列的特定生物標記的抗體， 可將任選地偶聯於載體蛋白(carrier protein)(例如，KLH)的標記與佐劑混合併注入宿主動物。之後可藉由親和層析(affinitychromatography)純化產生於動物中的抗體。一般使用的宿主動物包括兔子、小鼠、豚鼠與大鼠。可被用來增加免疫應答的多種佐劑視宿主種類而定且包括弗氏佐劑(Freund' s adjuvant)(完全與不完全)、礦物膠(mineral gel)例如氫氧化鋁、CpG、表面活性物質(surface-active substance)，例如溶血卵磷脂 (Iysolecithin)、pluronic 多元醇、聚陰離子(polyanion)、肽、油乳劑(oil emulsion)、鑰孑L蟲血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)與二硝基酚(dinitrophenol)。有效的人類 ^01 BCG (bacille Calmette-Guerin) g失豆/]、_#木幹胃(Corynebacterium parvum)。 多克隆抗體，即抗體分子的異質性群體(heterogeneous populations)表達於經免疫的動物的血清中。使用標準雜交瘤技術(參見，例如Kohler et al. (1975)Nature 256,495 ；Kohler et al. (1976)Eur. J. Immunol. 6,511 ；Kohler et al. (1976)Eur J Immunol 6, 292 ；and Hammerling et al. (1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y.)可製備單克隆抗體，即抗體分子的同質性群體(homogeneouspopulations)。特別是，藉由提供培養連續細胞系(continuous cell line)產生抗體的任何技術，例如敘述於Kohler et al. (1975)Nature 256,495和美國專利4，376，110號；人B細胞雜交瘤技術(Kosbor et al. (1983)Immunol Today 4，72 ；Cole et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,2(^6)，和 EBV-雜交瘤(EBV-hybridoma)技術(Cole et al. (1983)Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R. Liss, Inc. ,pp. 77-96) ^Τ|^ Ι#!·;^|1 ) #。 禾中抗體可為任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD與其任何亞類。可在體外或在體內培養本發明產生單克隆抗體的雜交瘤。在體內產生高效價的單克隆抗體的能力使其為特別有效的產生方法。此外，藉由已知技術可產生抗體片段。例如，此種片段包括，但不限於F(ab』)2片段，其可藉由胃蛋白酶(P印sin)消化抗體分子而產生；和Fab片段，其可藉由還原F(ab』)2 片段的雙硫鍵(disulfide bridge)產生。無須進一步詳細闡述，相信本領域技術人員可以基於上述，利用本發明至其最大範圍。因此，下述特定實施方案應視為僅為說明性，且不以任何方式限制本公開的其他部分。所有本文中引用的公開文獻通過提述併入本文。實施例實施例1 基於uPA、MMP9、β -2MG與其它纖維化相關標記的血清濃度在C肝病毒陽性患者中診斷肝纖維化材料與方法(i)患者140個C肝病毒陽性患者(通過經由免疫分析ELISA或RIA的血清測試來確認)與 93個健康志願者參與此研究。患者和健康受試者隨機被指派至一訓練組(training set) (η = 148)與一測試組(testing set) (η = 85)。所有人均接受例行性實驗室測試，包括肝功能組(liver panel) (GOT/AST、GPT/ALT、血清總膽紅素(bilirubin)、鹼性磷酸酶和血清白蛋白(albumin))、凝血酶原時間(ProthrombinTime)/國際標準化比值(International normalized ratio, INR)、甲胎蛋白(AFP)、用於排除肝臟疾病的其它起因的測試、肝臟超音波、上內視鏡(upper endoscopy)和經調整過的Skirmer調查(用於確認飲酒習慣)。(ii)活檢分析自患者獲得肝活檢樣本，且根據METAVR分數系統來分析其組織學特徵。簡單而言，將這些樣本(長度大於10mm)固定、以石蠟(paraffin)包埋，且以蘇木精伊紅番紅花 (hematoxylin eosin safran)與 Masson 氏的三色(Masson，strichrome)來染色以鑑定損傷或以苦味酸天狼星紅(Picrosirius-red)來染色以供檢測膠原蛋白。基於下列標準來評估各切片的肝纖維化階段(即纖維化的量)FO 無纖維化Fl 肝門的(portal)纖維化無隔膜(s印ta)F2 少數隔膜F3 為數眾多的隔膜無肝硬化(cirrhosis)F4 肝硬化亦採用一般方法決定各活檢的級別(grade)(即由C肝病毒感染導致的發炎水平)。(iii)血清學分析自每個患者取得IOmL的靜脈血液，收集於無添加劑的試管中，於室溫靜置30分鐘。之後將血樣在4°c進行離心1600g，15分鐘，且收集上清血清樣本。使用imubind uPA ELISA 試劑盒(american diagnostica he)，基於製造商提供的操作指南來測量upa的血清濃度。簡單而言，將血清樣本稀釋1/20於包含於此試劑盒的稀釋液中。將iooyl的upa標準品(提供於試劑盒中)或經稀釋的樣本置於預先以鼠類抗upa單克隆抗體塗覆的微量測試板(microtestplate)中。將此板密封，在4°c過夜培養， 且之後以洗滌緩衝溶液洗滌4次。之後將生物素化的(biotinylated)抗_upa抗體加至板中。在室溫培養1小時後，將此盤洗滌且加入鏈黴親和素(sti^ptavidin)結合的辣根過氧化酶(horseradishperoxidase，hrp)。1小時後，將含辣根過氧化酶底物的溶液，即高硼酸鹽(perborate)/3，3，5，5，-四甲基聯苯胺(3,3' ,5,5' -tetramethylbenzidine, tmb)加至板中，將其維持於室溫20分鐘以允許酶反應發生。藉由加入50yl 0.5n h2s04來終止反應,且使用spectramax m5 (molecular devices)來測量於450nm的吸光度。使用四參數擬合(four—parameter fit) (softmax pro software,moleculardevices)建立標準校ie曲線(standard calibration curve)。之後基於吸光度對照標準曲線，來決定血清upa水平。 基於製造商的操作指南，將所有測量執行三重複。藉由 quantikine mmp9 免疫分析(quantikine mmp9immunoassay) (r&dsystems, minneapoiis,mn)來決定mmp9的血清濃度。此分析設計來測量mmp9的總量，包括其92kda 前體與82kda成熟型兩者。簡單而言，將經稀釋的血清樣本(1 100)置於以抗-人類mmp9 抗體預塗覆的微孔板中。兩小時後，將此板進行洗滌且加入生物素化的(biotinylated) 抗-mmp9抗體。將此板培養於室溫1小時，且加入鏈黴親和素結合的辣根過氧化酶後加入 3』3，5，5，_四甲基聯苯胺(tmb)。藉由lmol/l硫酸終止反應且使用微板讀數器(microplate reader) spectramax m5 (molecular devices)測量在 450nm 與 540nm 的吸光度差值。可禾丨j 用上述方法基於此吸光度差值來決定血清mmp9的濃度。基於製造商的操作指南，將所有測量執行三重複。使用夾心酶免疫分析試齊ll 盒(sandwich enzyme immunoassay kit) (genffaybiotech)來測量血清的β -2mg濃度，如下。將20 μ l的經稀釋的血清樣本 (1 100)置於以小鼠單克隆抗-i3-2mg抗體預塗覆的微孔板中，且以200yl的樣本稀釋液混合。將混合物於37°c培養30分鐘。將此板以蒸餾水洗滌4次，且之後加入辣根過氧化酶結合的綿羊抗-β-2mg抗體。在於37°c培養30分鐘後，再次洗滌此板後加入3』 3,5, 5，-四甲基聯苯胺(tmb)。20分鐘後，藉由in hcl終止酶反應。以spectramax m5 (molecular devices)測量在450nm的吸光度，且採用前述方法決定i3_2mg濃度。基於製造商的操作指南，將所有測量執行三重複。藉由常規方法來決定其它纖維化相關標記，例如got、gpt或afp的血清濃度。(iv)確定疾病分數經由判別分析、嶺回歸分析或對數回歸分析，並當適用時考慮臨床因素，來決定 upa、mmp9、β -2mg或其組合的表達水平與纖維化階段的水平間的相關性。基於敏感性、特異性、陽性預測值與陰性預測值來評估對於三個生物標記的每個或其組合的診斷價值。藉由篩選測試來決定其敏感性、特異性、陽性與陰性預測值，其中，對應至不同截斷值的roc曲線上的點代表測試陽性。統計分析以r軟體處理。結果
(i)患者特徵包括獲得自上述實驗室測試的臨床因素與纖維化相關的生物標記的血清水平的患者特徵，顯示於以下表1中。
權利要求
1.一種在人類受試者中診斷肝纖維化(fibrosis)的方法，包括自被懷疑具有肝纖維化的人類受試者獲得血樣；檢測該血樣中尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑(urokinase typeplasminogen activator, uPA)、基質金屬蛋白醇 9 (matrix metalloproteinases 9, MMP9)禾口 β _2_ 微球蛋白(β-2-microglobulin，β -2MG)中的一個或多個的表達水平；基於該表達水平計算疾病分數；和基於該疾病分數確定該個體是否具有纖維化。
2.權利要求1的方法，其中所述血樣為血清樣本。
3.權利要求1的方法，其中所述人類受試者選自下組C肝病毒攜帶者、B肝病毒攜帶者、遭受酒精相關肝病的患者和遭受代謝性肝病的患者。
4.權利要求1的方法，其中該檢測步驟藉由檢查所述血樣中的尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑、基質金屬蛋白酶9和β -2-微球蛋白中的兩個的表達水平來執行。
5.權利要求1的方法，其中該檢測步驟藉由檢查所述血樣中的尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑、基質金屬蛋白酶9和β -2-微球蛋白的表達水平來執行。
6.權利要求5的方法，其中所述血樣為血清樣本。
7.權利要求5的方法，其中該計算步驟藉由對尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑、基質金屬蛋白酶9和β-2-微球蛋白的表達水平進行判別函數分析(discriminant function analysis)、對數回歸分析(logistic regression analysis)或嶺回歸分析(ridge regression analysis) jft^^To
8.權利要求5的方法，進一步包括在確認所述受試者具有肝纖維化後，基於該疾病分數與指出不同纖維化階段的預先確定的截斷值(cutoff-value)的比較來評估該受試者的疾病階段。
9.權利要求8的方法，其中該疾病分數藉由判別函數分析、對數回歸函數或嶺回歸函數來計算。
10.一種在人類受試者中診斷肝纖維化的方法，包括自被懷疑具有肝纖維化的人類受試者獲得血樣；檢測下述在血樣中的表達水平(a) —個或多個選自下組的標記尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑(uPA)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)和β-2-微球蛋白(β-2MG)， 和(b) —個或多個選自下組的標記穀氨酸草醯乙酸轉氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase, GOT)、谷氛酸丙麗酸轉氛醇(glutamicpyruvic transaminase, GPT)禾口甲月臺蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)；基於所述表達水平計算疾病分數；和基於所述疾病分數確定該受試者是否具有纖維化。
11.權利要求10的方法，其中所述血樣為血清樣本。
12.權利要求10的方法，其中該計算步驟藉由對所述表達水平進行判別函數分析、對數回歸分析或嶺回歸分析來執行。
13.一種用於診斷肝纖維化的試劑盒，包含與尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑 (uPA)特異性結合的第一抗體、與基質金屬蛋白酶9(MMP9)特異性結合的第二抗體和與 β-2-微球蛋白(i3-2MG)特異性結合的第三抗體。
14.權利要求13的試劑盒，進一步包含與穀氨酸草醯乙酸轉氨酶(GOT)特異性結合的抗體、與穀氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)特異性結合的抗體、與甲胎蛋白(AFP)特異性結合的抗體，或其組合。
15.權利要求13的試劑盒，其中所述抗體為完整的免疫球蛋白分子。
16.一種用於檢測肝纖維化的試劑盒，基本上由與尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑(uPA)特異性結合的第一抗體、與基質金屬蛋白酶9(MMP9)特異性結合的第二抗體和與 β-2-微球蛋白(i3-2MG)特異性結合的第三抗體組成。
17.權利要求16的試劑盒，進一步包含與穀氨酸草醯乙酸轉氨酶(GOT)特異性結合的抗體、與穀氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)特異性結合的抗體、與甲胎蛋白(AFP)特異性結合的抗體，或其組合。
18.一種用於診斷肝纖維化的試劑盒，包含(a)與尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑 (uPA)特異性結合的抗體、與基質金屬蛋白酶9 (MMP9)特異性結合的抗體、與β-2-微球蛋白(i3-2MG)特異性結合的抗體，或其組合；和(b)與穀氨酸草醯乙酸轉氨酶(GOT)特異性結合的抗體、與穀氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)特異性結合的抗體、與甲胎蛋白(AFP)特異性結合的抗體，或其組合。
19.權利要求18的試劑盒，其中所述抗體為完整的免疫球蛋白分子。
20.一種用於診斷肝纖維化的試劑盒，基本上由(a)與尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑(uPA)特異性結合的抗體、與基質金屬蛋白酶9 (MMP9)特異性結合的抗體、與β-2-微球蛋白(0-2MG)特異性結合的抗體，或其組合；和(b)與穀氨酸草醯乙酸轉氨酶(GOT)特異性結合的抗體、與穀氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)特異性結合的抗體、與甲胎蛋白(AFP)特異性結合的抗體，或其組合組成。
全文摘要
鑑定尿激酶型血纖蛋白溶解酶原激活劑(urokinase type plasminogenactivator，uPA)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9，MMP9)和β-2-微球蛋白(β-2-microglobulin，β-2MG)為新穎的肝纖維化相關生物標記，及其在診斷肝纖維化中的用途。
文檔編號C12Q1/68GK102301237SQ200980155916
公開日2011年12月28日 申請日期2009年12月1日 優先權日2008年12月2日
發明者劉怡貞, 葉宏仁, 曾錙翎, 李彥朋, 李懷洛, 李泓毅, 林微雅, 鄭平福 申請人:財團法人工業技術研究院