一種NK細胞培養基及NK細胞的培養方法與流程
2023-05-05 10:39:36
本發明涉及細胞培養領域，特別涉及一種NK細胞培養基及NK細胞的培養方法。
背景技術：
：自然殺傷細胞(naturalkillercell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生，其發育成熟依賴於骨髓和胸腺微環境。NK細胞的功能主要是通過一下方式實現的。NK細胞自然殺傷活性：NK細胞識別靶細胞(某些腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些自身組織細胞、寄生蟲等)，接著NK細胞釋放穿孔素，細胞毒因子，活化的NK細胞釋放TNF因子，從而達到裂解和殺傷靶細胞的可能。NK細胞毒作用(ADCC效應)，主要是NK細胞表面具有FcγRⅢA，主要結合人IgG1和IgG3的Fc段(Cγ2、Cγ3功能區)，在針對靶細胞特異性IgG抗體的介導下可殺傷相應靶細胞。活化的NK細胞可合成和分泌多種細胞因子，發揮調節免疫和造血作用以及直接殺傷靶細胞的作用。NK細胞通過自然殺傷和ADCC發揮的細胞毒作用，在機體抗病毒感染、免疫監視中起重要作用。因此，現有技術中為了能夠獲取更多數量的NK細胞，所以研究人員通過體外培養的方式來進行大規模的繁殖，但是，由於體外環境與人體內的環境不完全相同，所以導致NK細胞的免疫活性並不是很高。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種有利於提高NK細胞的免疫活性的NK細胞培養基及NK細胞的培養方法。本發明的上述目的是通過以下技術方案得以實現的：一種NK細胞培養基，按重量份數計，包括無血清基礎培養基94～98份、血漿7～10份、抗CD3單克隆抗體0.6～1.6份、類胰島素一號增長因子2～4份、PBS緩衝液20～30份、烏賊墨1～4份、紅花多糖2～6份、大蒜素2.5～4.5份、苜蓿多糖1～3份、桂皮醛2～4份。作為優選，按重量份數計，包括無血清基礎培養基96份、血漿8.5份、抗CD3單克隆抗體1份、類胰島素一號增長因子3份、PBS緩衝液25份、烏賊墨2.5份、紅花多糖4份、大蒜素3.5份、苜蓿多糖2份、桂皮醛3份。由於無血清基礎培養基、血漿、抗CD3單克隆抗體、類胰島素一號增長因子共同組成為了NK細胞生存所需的人體骨髓的環境。由於烏賊墨內還有IL-2,而在NK細胞表面有IL-2親和性受體，IL-2可誘導NK細胞的活化和分化，從而有利於提高NK細胞的增殖效率，並活化後的NK細胞能夠合成和分泌多種細胞因子，進而直接抑制腫瘤細胞分化增殖。同時，在烏賊墨中還存在大量的抗腫瘤的肽聚糖，分別是：SIPG02-A、SIPG02-B、SIPG02-C，他們在NK細胞培養的過程中就會很自然的依附在NK細胞的表面，這樣在利用NK細胞抑制腫瘤細胞的時候，抗腫瘤的肽聚糖也能夠進一步協助NK細胞提高免疫能力。再者，NK細胞培養基內部還含有大量的胺基酸和金屬元素，而這些又是NK細胞分化和增殖的過程中所不可或缺的物質，從而進一步提高了NK細胞的活化性能。再者，桂皮醛和紅花多糖在NK細胞培養的過程中能夠促進細胞因子分泌，從而進一步提高了NK細胞殺傷活性。另外，苜蓿多糖可以顯著地增強NK細胞對K562靶細胞的殺傷活性，而大蒜素能夠改變NK細胞S+G2/M1周期比例，同時，其可以促進NK細胞分泌IFN-γ，而IFN-γ又大大提高了NK細胞的殺傷性能。作為優選，所述無血清基礎培養基為LonzaX-VIVO15無血清細胞培養基。LonzaX-VIVO15無血清細胞培養基是由美國Lonza公司生產的，其一般保存在2～8℃，同時，其化學成份明確，不含任何外源生長因子、人造細胞增殖刺激因子或不明成分的添加劑；尤其適用於活化的人和鼠淋巴細胞第二信號系統的研究；另外，X-VIVO15TM經過優化使之適合於無血清條件下腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的增殖，其配方有助於外周血及人類腫瘤中分離純化的CD3+細胞的增殖。同時還用於維持人類單核細胞、巨噬細胞及細胞系、細胞和自然殺傷細胞（NK）的生長。作為優選，所述烏賊墨經過黑色素代謝酶處理。通過黑色素代寫酶的處理之後，烏賊墨中的黑色素就可以很好地被除去，從而在保證NK細胞正常分化增殖的情況下，又可以減少黑色素對NK細胞培養過程中的幹擾。一種NK細胞的培養方法，包括以下步驟：S1、採集健康人的外周血，並用稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入Ficoll，沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恆溫室中進行離心30min～45min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，並離心5min～7min後去除上清液，獲得潔淨的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉移到上述NK細胞培養基中，並將NK細胞培養液放置在培養箱中進行培養。作為優選，S1中外周血與稀釋液的體積比為1：2～3。作為優選，S2中的Ficol與稀釋血的體積比為1:2～4。作為優選，S3和S5的離心轉速為1500r/min～1800r/min。在該種離心轉速的離心下能夠快速地將所需要的細胞分離出來，從而大大提高了NK細胞提取的效率，並且在這個過程中又不容易造成NK細胞的破損。作為優選，S7中培養箱的溫度為2～8℃，且其的二氧化碳的濃度為5～6%。作為優選，S7中NK細胞的培養時間為13～15天。綜上所述，本發明具有以下有益效果：1.無血清基礎培養基、血漿、抗CD3單克隆抗體、類胰島素一號增長因子共同組成了NK細胞生存所需的人體骨髓的環境。2.烏賊墨、紅花多糖、大蒜素、苜蓿多糖和桂皮醛均有利於提高NK細胞的活性，從而增強了NK細胞的殺傷性；3.使用由黑色素代謝酶處理過的烏賊墨可以有效的降低黑色素對NK細胞培養過程中所造成的幹擾。附圖說明圖1是NK細胞的培養流程圖。具體實施方式以下結合附圖1對本發明作進一步詳細說明。實施例一：NK細胞培養基:無血清基礎培養基94g、血漿7g、抗CD3單克隆抗體0.6g、類胰島素一號增長因子2g、PBS緩衝液20g、烏賊墨1g、紅花多糖2g、大蒜素2.5g、苜蓿多糖1g和桂皮醛2g；NK細胞的培養：S1、採集健康人的10ml外周血，並用20ml稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入10mlFicoll，並沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恆溫室中以1500r/min轉速進行離心30min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，並以1500r/min離心5min後去除上清液，獲得潔淨的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉移到上述NK細胞培養基中，並將NK細胞培養液放置在溫度為2～8℃，且二氧化碳的濃度為5%的培養箱中進行培養13天。實施例二：NK細胞培養基:無血清基礎培養基98g、血漿10g、抗CD3單克隆抗體1.6g、類胰島素一號增長因子4g、PBS緩衝液30g、烏賊墨4g、紅花多糖6g、大蒜素4.5g、苜蓿多糖3g和桂皮醛4g；NK細胞的培養：S1、採集健康人的10ml外周血，並用30ml稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入7.5mlFicoll，並沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恆溫室中以1800r/min轉速進行離心45min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，並以1800r/min離心7min後去除上清液，獲得潔淨的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉移到上述NK細胞培養基中，並將NK細胞培養液放置在溫度為2～8℃，且二氧化碳的濃度為6%的培養箱中進行培養15天。實施例三：NK細胞培養基:無血清基礎培養基96g、血漿8.5g、抗CD3單克隆抗體1g、類胰島素一號增長因子3g、PBS緩衝液25g、烏賊墨2.5g、紅花多糖4g、大蒜素3.5g、苜蓿多糖2g和桂皮醛3g；NK細胞的培養：S1、採集健康人的10ml外周血，並用15ml稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入5mlFicoll，並沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恆溫室中以1670r/min轉速進行離心37min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，並以1650r/min離心6min後去除上清液，獲得潔淨的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉移到上述NK細胞培養基中，並將NK細胞培養液放置在溫度為2～8℃，且二氧化碳的濃度為5.5%的培養箱中進行培養14天。實施例四：NK細胞培養基:無血清基礎培養基98g、血漿8.5g、抗CD3單克隆抗體1.6g、類胰島素一號增長因子3g、PBS緩衝液25g、烏賊墨4g、紅花多糖4g、大蒜素4.5g、苜蓿多糖1g和桂皮醛2g；NK細胞的培養：S1、採集健康人的10ml外周血，並用20ml稀釋液對外周血進行稀釋，獲得稀釋血；S2、向離心管一中加入6.7mlFicoll，並沿傾斜的管壁緩慢加入稀釋血；S3、將離心管一放入到18℃的恆溫室中以1670r/min轉速進行離心30min；S4、用吸管輕輕吸取S3的離心管一中的PBMC層移入到離心管二中；S5、向離心管二中加入足量稀釋液進行洗滌，並以1800r/min離心6min後去除上清液，獲得潔淨的PBMC細胞；S6、將PBMC細胞進行磁珠分選，獲得NK細胞；S7、將獲得的NK細胞轉移到上述NK細胞培養基中，並將NK細胞培養液放置在溫度為2～8℃，且二氧化碳的濃度為5%的培養箱中進行培養14天。將實施例一至實施例四所獲得的帶有NK細胞的NK細胞培養基，加入到含有等量人體的腫瘤細胞的培養基中，並放置在37℃的環境下，培養6h，並每2h對含有人體的腫瘤細胞的培養基進行檢測，得到如下腫瘤細胞凋亡率的數據：時間/h0246實施例一0%45%82%95%實施例二0%52%89%98%實施例三0%47%8497%實施例四0%48%86%96%所以，本發明的實施例一至實施例四所培養出來的NK細胞具有很強的免疫活性，對腫瘤細胞具有很強的殺傷能力，適合用於各類腫瘤疾病的治療。本具體實施例僅僅是對本發明的解釋，其並不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求範圍內都受到專利法的保護。當前第1頁1 2 3