環酯肽類抗生素黑莫他丁的高產菌株及其構建方法
2023-05-09 12:47:21 2
環酯肽類抗生素黑莫他丁的高產菌株及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了環酯肽類抗生素黑莫他丁的高產菌株及其構建方法。黑莫他丁的高產菌株是將S.himastatinicus?sp.Nov的hmtA基因或者hmtB基因失活，由此獲得himastatin高產突變株S.himastatinicus?sp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。本發明通過失活S.himastatinicus?sp.Nov的環脂肽類抗生素himastatin的生物合成基因簇上遊的Mer家族轉錄調控基因hmtA和乙醯穀氨酸激酶基因hmtB而分別得到hmtA失活的突變株S.himastatinicus?sp.Nov?Ju2014和hmtB失活的突變株S.himastatinicus?sp.Nov?Ju2015。突變株S.himastatinicus?sp.Nov?Ju2014和Ju2015的himastatin的產量是野生型S.himastatinicus?sp.Nov的10倍以上。因此，該環脂肽類抗生素himastatin兩個高產突變株的成功構建為加速himastatin產業化進程帶來了可能與希望。
【專利說明】環酯肽類抗生素黑莫他丁的高產菌株及其構建方法
【技術領域】
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[0001]本發明屬於微生物基因工程和代謝工程領域，具體涉及環酯肽類抗生素黑莫他丁(himastatin)的高產菌株及其構建方法。
【背景技術】
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[0002]環肽類化合物是一類以醯胺鍵形成的環狀化合物，主要是由胺基酸、糖肽、脂肽和核苷肽經過一系列修飾後組合而成的複雜分子。該類化合物廣泛存在於無脊椎動物(海綿、海鞘、苔蘚蟲類等)、細菌、藍細菌、真菌和放線菌中，多數具有複雜新穎的結構特徵，其最突出的特點是環狀結構以及各種胺基酸衍生物結構單元。環狀結構賦予該類化合物一定的物理剛性以及對蛋白水解作用的耐受性，而不同的衍生結構更使得該類化合物具備各種生理生化特質。因其多數具有出色的生物學性能(抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、免疫抑制活性、抗蟲、抗瘧及生理生化調控作用等)，使得該類化合物已經成為了合成化學、藥物篩選和開發的重點關注對象。其中的一些化合物已經成功用於臨床疾病的治療。例如抗真菌作用短桿菌酪肽A(tyrocidine A)、用於器官移植抗排斥作用的環孢菌素A (cyclosporin A)、對甲氧西林耐藥的金葡菌具有良好活性的萬古黴素(Vancomycin)、對甲氧西林耐藥金葡菌和萬古黴素耐藥腸球菌均具有良好的抗菌活性的達託黴素(daptomycin)等，均是該類化合物用於臨床治療的成功典範。
[0003]但是，其中的一些環肽類化合物由於其水溶性較差、副作用較大或化合物的產量低等原因而退出了臨床試驗，但這也間接說明了對這些化合物進行結構改造和優化或提高其產量的必要性和迫切性。而且由於這些化合物多數具有複雜結構、眾多的手性中心及閉環位置的選擇嚴重製約著對這類化合物進行結構改造的效率或產業化的進程。針對傳統的天然產物篩選和研發手段的局限性，在二十世紀九十年代發展出一種以基因工程和酶學研究為基礎的生物合成技術-組合生物合成(combinatorial b1synthesis),不僅彌補了傳統研究方法的不足，而且為生物醫藥領域的進一步拓展提供了新的研究思路和研究方向。而且隨著基因組測序技術和基因重組技術等的飛速發展，組合生物合成已給生物學領域帶來了革命性的變化，同時也給化學學科創造新的化學結構和構建化合物庫帶來了新的方法和提供了有益的補充。此外，抗生素的生物合成基因通常在染色體或巨型質粒的一段連續區域成簇排列的特徵，(包括結構基因、自我抵抗基因、轉運基因和調控基因)為進一步開發和改造抗生素提供了新的契機。截至2006年，已有近300種微生物次級代謝產物的生物合成基因簇得到克隆和功能鑑定，為利用組合生物合成技術、代謝工程技術和體外酶學技術來創造或改造以得到新的化合物奠定了基礎。已經有諸多研究通過生物合成和組合生物合成技術成功完成了較多結構複雜的天然產物的結構修飾、改造或某些目標成分的定向積累，構建了一系列活性相當或活性較強的衍生物，或高產突變株，為鏈黴菌的基因工程改造提供了有益的方法學的借鑑樣本，為解決日益棘手的病原微生物的耐藥問題和腫瘤疾病的治療帶來了新希望。
[0004]環脂肽類抗生素黑莫他丁(himastatin)，其結構如圖1所示，體外活性分析顯示其對革蘭氏陽性菌有較好的抑菌活性，對P388細胞系和褪黑色素瘤B16細胞系有顯著的細胞毒活性。
【發明內容】
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[0005]本發明的目的是提供黑莫他丁(himastatin)高產突變株Streptomyceshimastatinicus sp.Nov0
[0006]本發明的himastatin 高產突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov,其是hmtA 基因或者 hmtB 基因失活的 Streptomyces himastatinicus sp.Nov,所述的 hmtA 基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示,所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0007]本發明還提供了himastatin 高產突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov的構建方法，其特徵在於，是將Streptomyces himastatinicus sp.Nov的hmtA基因或者hmtB 基因失活，由此獲得 himastatin 高產突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov,所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQID N0.3 所示。
[0008]本發明還提供了 hmtA基因或者hmtB基因在調控himastatin產量中的應用，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示。
[0009]本發明的原始菌株Streptomyces himastatinicus sp.Nov是一株陸源鏈黴菌，分別通過對其次級代謝產物的生物合成基因簇中的I個MerR家族轉錄調控基因、I個乙醯穀氨酸激酶基因的遺傳改造得到了 2株能高產himastatin的突變株Streptomyceshimastatinicus sp.Nov Ju2014和Ju2015。用himastatin的培養基發酵菌株，用乙酸乙酯萃取發酵液，經過HPLC-DAD-UV的分析其次級代謝產物。以HPLC程序進行程序分析，HPLC分析圖譜顯示，洗脫時間在17.45min處並有特徵紫外吸收值(λ _210，285)的流分，該流分應為himastatin。為了確保17.45 min處並有特徵紫外吸收值(λ _210，285)的流分為himastatin,故採用6L規模的發酵處理，隨後通過HPLC-UV分析得到化合物I的純品；經核磁共振分析，其ID (? 13C) NMR光譜學數據與文獻報導的himastatin的圖譜完全一致，即確定保留時間17.45 min處的化合物I是抗生素himastatin(其結構式如圖1所示)。
[0010]本發明還涉及到Streptomyces himastatinicus sp.Nov的全基因組掃描，和抗生素himastatin的生物合成基因簇的確認。為了找到抗生素himastatin生物合成的基因簇，我們採用了全基因組掃描的方法，利用Illumina’s Solexa測序技術,對Streptomyceshimastatinicus sp.Nov菌株的全基因組DNA進行序列測定,基因注釋的結果顯不一個大小為60 Kb的連續片段可能含有himastatin生物合成所必需的基因信息，進一步的生物信息學分析揭示20個開放閱讀框約45 Kb大小的DNA序列包含了抗生素himastatin生物合成中的調控、結構、自我抵抗、轉運及後修飾等基因的信息(見圖2)。基因簇的序列已經被EMBL資料庫收錄，序列號FR823394。
[0011]本發明涉及到himastatin生物合成基因簇中負責起轉錄調控作用的基因hmtA (核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼的蛋白HmtA的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所示)，乙醯穀氨酸激酶基因hmtB (核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，其編碼的蛋白HmtB的胺基酸序列如SEQ ID N0.4所示)，將其單獨進行置換突變後可得到高產抗生素himastatin的工程菌株。在himastatin生物合成基因簇的上遊，有個命名為hmtA的基因，它編碼一個有247個胺基酸的多肽，通過生物信息學分析鑑定該肽鏈屬於MerR家族轉錄調控子。為了驗證hmtA和hmtB基因編碼的蛋白質HmtA和HmtB在抗生素himastatin的生物合成中的具體作用，用一個具有阿普拉黴素抗性的DNA片段分別進行閱讀框內取代，使得hmtA和hmtB失活。將突變粘粒轉入到甲基化缺陷的E.coli ET12567/pUZ8002菌株中，與野生型
S.himastatinicus sp.Nov菌株進行種間接合轉移,得到一些接合子,分別各選取3個抗性表型(阿普拉耐受，卡那黴素敏感)和基因型均正確的突變株S.himastatinicus sp.NovJu2014,突變株 S.himastatinicus sp.Nov Ju2015,與野生型 S.himastatinicus sp.Nov 菌株同時同條件發酵，野生型菌株作為陽性對照。通過HPLC分析突變菌株AhmtA的發酵液乙酸乙酯萃取，結果表明二個突變株克隆子一致的高產himastatin,該目標產物的產量較野生型菌株高出了 10倍以上。這些數據證明了 HmtA和HmtB蛋白在himastatin的生物合成中具有負調控因子的作用。
[0012]本發明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法或包含本發明SEQ ID N0.1所示序列的第I~744位的DNA作為探針以Southern雜交等方法從其他生物體中得到與hmtA相似的基因。
[0013]包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被體內體外修飾或進行突變，包括插入、置換或缺失，聚合酶鏈式反應，錯誤介導聚合酶鏈式反應，位點特異性突變，不同序列的重新連接，序列的不同部分或與其他來源的同源序列進行定向進化，或通過紫外線或化學試劑誘變等。
[0014]包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適的表達體系在外源宿主中表達以得到相應的酶或其他更高的生物活性物質或產量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈黴菌、小單孢菌、假單孢菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動物等。
[0015]本發明所提供的胺基酸序列可以用來分離所需要的蛋白並可用於抗體的製備。
[0016]包含本發明所提供的胺基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些胺基酸之後仍有生物活性甚至有新的生物學活性，或者提高了產量或優化了蛋白動力學特徵或其他致力於得到的性質。
[0017]包含DNA片段或基因可以用來構建提高himastatin或其衍生物的產量的突變株，本發明提供了在基因工程微生物中提高產量的途徑。
[0018]本發明通過失活S.himastatinicus sp.Nov的環脂肽類抗生素himastatin的生物合成基因簇上遊的Mer家族轉錄調控基因hmtA和乙醯穀氨酸激酶基因hmtB而分別得到hmtA失活的突變株S.himastatinicus sp.Nov Ju2014和hmtB失活的突變株S.himastatinicus sp.Nov Ju2015。突變株 S.himastatinicus sp.Nov Ju2014 和 Ju2015的himastatin的產量是野生型S.himastatinicus sp.Nov的10倍以上。因此，該環脂肽類抗生素himastatin兩個高產突變株的成功構建為加速himastatin產業化進程帶來了可能與希望。
[0019]本發明的黑莫它丁鏈黴菌Streptomyces himastatinicus sp.Nov,購自於美國模式培養物集存庫(American type culture collect1n),編號為:ATCC53653,該菌株對外銷售，任何人都可以從該保藏庫購買到。【專利附圖】
【附圖說明】:
[0020]圖1是黑莫它丁(himastatin)的化學結構式。
[0021]圖 2 是鏈黴菌 Streptomyces himastatinicus sp.Nov 中 himastatin 生物合成基因簇組織結構圖。
[0022]圖 3 是hmtA 雙交換突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014 的構建不意圖，其中 Mutant Ju2014 表不突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014 ；
[0023]圖 4 是hmtA 雙交換突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014 的 PCR驗證圖，wt表不野生型Streptomyces himastatinicus sp.Nov，ΔhmtAl、ΔhmtA2、ΔhmtA3表不突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014 的三個克隆子；
[0024]圖 5 是hmtB雙交換突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015 的構建不意圖，其中 Mutant Ju2015 表不突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015 ；
[0025]圖 6 是hmtB 雙交換突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015 的 PCR驗證圖，其中 wt 表不野生型 Streptomyces himastatinicus sp.Nov，Δ hmtB K AhmtB2、Δ hmtB3 表不突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015 的三個克隆子；
[0026]圖 7 是 hmtA 雙交換突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014與野生型同等條件下分別發酵後的HPLC分析結果，其中wt表示野生型Streptomyceshimastatinicus sp.Nov，ΔhmtAlΛ AhmtA2、ΔhmtA3 表不突變株 Streptomyceshimastatinicus sp.Nov Ju2014 的三個克隆子，Δ hmtAl Λ AhmtA2、AhmtA3 是稀釋 10 倍後進樣後的HPLC結果。
[0027]圖 8 是 hmtB 雙交換突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015與野生型同等條件下分別發酵後的HPLC分析結果，其中wt表示野生型Streptomyceshimastatinicus sp.Nov，ΔhmtBK AhmtB2、ΔhmtB3 表不突變株 Streptomyceshimastatinicus sp.Nov Ju2015 的三個克隆子，Δ hmtB K AhmtB2、AhmtB3 是稀釋 10 倍後進樣後的HPLC結果。
[0028]圖9是活性化合物I的H譜。
【具體實施方式】
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[0029]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0030]實施例1:
[0031]1.S.himastatinicus sp.Nov的培養
[0032]在本發明的S.himastatinicus sp.Nov野生型菌株和突變菌株生長所使用的培養基，每升是這樣配製的:將魚粉10g、甘油20g、碳酸鈣5g和酵母提取物5g加入IL水中，pH為7.2-7.4之間，常規滅菌備用。其最適生長的溫度是在28°C -30°C。
[0033]2.鏈黴菌S.himastatinicus sp.Nov的次級代謝產物himastatin的分離純化及結構鑑定
[0034]首先，S.himastatinicus sp.Nov菌株在裝有50mL步驟I的培養基的250 mL三角瓶中發酵7天，溫度28~30°C，轉速200 rpm ;然後，發酵液用2倍體積的乙酸乙酯萃取，上層有機相50°C減壓蒸餾，用ImL甲醇溶解，得到粗提液，進行HPLC分析，根據紫外吸收特徵進行目標化合物的標定(210nm, 285nm)。接著利用同樣的發酵條件,對S.himastatinicussp.Nov進行4L規模發酵。對發酵產物的粗體物進行HPLC分析後進行目標化合物的分離。HPLC分析所用流動相的組成如下:A相，15%乙腈+85%水+0.1 %冰醋酸；B相，20%水+80%乙腈+0.1 %冰醋酸。HPLC程序為:0~20 min，B相O %~80 %梯度洗脫；21~23min，B相80%~100%梯度洗脫；24~30min，100% B相洗脫。UV檢測波長(210 nm，285nm,流速為I min/mL。在此程序中，目標化合物I的保留時間大約17.45min。對活性化合物I進行HR-ES1-MS，ID(1H, 13C)NMR(圖9)測試，綜合分析波譜數據，與文獻:J0HNE.LEET，DANIEL R.SCHROEDER, BALA S.KRISHNAN and JAMES A.MATSON, HIMASTATIN, A NEWANTITUMOR ANTIB1TIC FROM STREPT0MYCES HYGR0SC0PICUS
[0035]I1.1SOLAT1N AND CHARACTERIZAT1N, THE JOURNAL OF ANTIB1TICS, VOL.XL III N0.8，961~966，1990，8.中的himastatin的核磁數據進行對比，進行目標化合物I的確認，鑑定目標化合物I為himastatin,其結構式如圖1所示。
[0036]3.含有基因hmtA和hmtB的Cosmid 12H8的篩選
[0037]S.himastatinicus sp.Nov基因組文庫的構建:以SuperCos I為載體，具體過程參照SuperCos I Cosmid Vector Kit的操作手冊。操作過程可大致概述如下:從
S.himastatinicus sp.Nov菌絲體中提取基因組DNA,經Sau3AI部分酶解,用牛小腸磷酸酶去磷酸化，然後連接到已被XbaI和BamHI酶解處理的SuperCos I載體上,用PackageneLambda DNA包裝系統進行體外包裝,侵染大腸桿菌LE392,在LB+kanamycin (Kan,終濃度50 μ g/mL)平板上篩選。選取約1920個克隆子挑選到20塊96孔板中，培養12h後，每孔中加入等體積50%的甘油。-80°C保存。
[0038]S.himastati nicus sp.Nov的基因組測序交由華大公司完成。根據華大公司提供的序列。為了找到抗生素himastatin生物合成的基因簇，我們採用了全基因組掃描的方法，利用 Illumina』 s Solexa 測序技術，對 Streptomyces himastatinicus sp.Nov 菌株的全基因組DNA進行序列測定，基因注釋的結果顯示一個大小為60 Kb的連續片段可能含有himastatin生物合成所必需的基因信息，進一步的生物信息學分析揭示20個開放閱讀框約45 Kb大小的DNA序列包含了抗生素himastatin生物合成中的調控、結構、自我抵抗、轉運及後修飾等基因的信息，推測himastatin生物合成基因簇的組織結構如圖2所示。himastatin基因簇的序列已經被EMBL資料庫收錄，序列號FR823394。其中基因簇中的hmtA基因(其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)編碼MerR家族轉錄調控因子；hmtB基因(其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示)編碼乙醯穀氨酸激酶。為了研究hmtA和hmtB基因在himastatin生物合成過程中的功能,我們對其分別進行基因的敲除。根據PCR-targeting操作要求，為了得到能夠對hmtA和hmtB進行敲除的粘粒，我們在hmtA序列附近設計了兩對引物，SAF(5' -CGCAGATCCACGCCGCACTC-3' ), SAR(5/ -AGT TCCGCGTGACGGAGGTG-3')和 SBF (5' -CGCCACCTGCTCGTCACCG-3' ) ,SBR(5/ -TCG GCG TAC AGC CAC AGC AG-3/ )。兩對引物PCR所得目的帶分別為622 bp和1679bp。分別利用這兩對引物，從構建的基因組文庫中利用PCR技術篩選陽性克隆。PCR程序如下:95°C5min ；95°C 45s, 58°C 45s, 72°C 90s,30個循環；72°C 1min0其中篩選到多個陽性克隆。我們選定第12塊96孔板對應(H，8)位置的陽性克隆，命名為Cosmid 12H8，其含有完整的hmtA和hmtB基因，進行下一步的hmtA和hmtB基因的敲除。
[0039]4.hmtA 基因缺失突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014 的構建
[0040]hmtA基因的閱讀框內失活是採用了 λ-RED介導的PCR-Targeting技術。包含有hmtA 基因的 Cosmid 12H8 被轉化入 E.coli BW25113/pIJ790 中，命名為 E.coli BW25113/PIJ790/12H8。以已被EcoRI和HindIII酶解過的pIJ773質粒為模板，用與hmtA基因分別具有 39bp 同源臂的敲除引物(hmtAdelF:5?-acgctcggcgcgacatacgcccggacccgacgacccgatATTCCGGGGATCCGT CGAC-3，, hmtAdelR:5，-tagccggtacccgacgtcgatggcctcgagcccgaggagTGTAGGCTGGAGCTGCT TC-3』下劃線部分代表與hmtA基因同源)進行具有Apr抗性的aac (3)IV-oriT抗性片段的PCR擴增反應。將擴增好的aac (3) IV-oriT抗性片段電轉化入E.coliBW25113/pIJ790/12H8感受態細胞中，通過λ -RED介導的同源重組得到改造後的重組cosmid，命名為重組 cosmid pju2014。用 hmtA 基因的 PCR 驗證引物(IDhmtAF: 5』-GAACCGATTCCGCCTGACC-3』，IDhmtAR: 3』 -ACATCGCCCTCGCCCTCAC-3』)進行擴增反應確定重組 cosmidpju2014 的正確性。隨後，重組 cosmid pju2014 被轉入 E.coli ET12567/pUZ8002 中，命名為 E.coli ET12567/pUZ8002/p Ju2014，其與野生型菌株S.himastatinicus sp.Nov進行接合轉移。
[0041]接合轉移的過程如下:將野生型S.himastatinicus sp.Nov的孢子在TSB培養液中，28 °C震蕩培養12-18小時，使其孢子萌發；E.coli ET12567/pUZ8002/pJu2014在加有卡那黴素(Kan,終濃度為50μ g/mL)、氨苄青黴素(Amp,終濃度為100 μ g/mL)、氯黴素(Cml,終濃度為25 μ g/mL)和阿伯拉黴素(Apm，終濃度為50 μ g/mL)的LB培養液中培養至光密度值OD = 0.6，離心收集細胞，用無菌的LB液體培養基洗滌兩次，然後與萌發好的野生型孢子混合，將混合液平鋪在加有1mM MgSO4的M-1SP4固體培養基上；在28°C生長23小時後，每個固體培養基平板上塗布800 μ L加有三甲氧苄胺嘧啶和阿普拉黴素的抗生素藥物的無菌水，其中含甲氧節氨嘧唳(Tmp, 50 mg/mL) 30 μ L,阿伯拉黴素(Apm, 50 mg/mL) 30 yL ;讓其在30°C培養箱下生長4-5天，直到接合子出現即為雙交換突變菌株，命名為Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014。該雙交換突變菌株通過其對抗生素的抗性表型(Kans&ApmK)及基因型而被篩選及鑑定出來，其中hmtA基因缺失的PCR驗證利用引物(IDhmtAF，IDhmtAR) 的進行PCR擴增反應得到證實。由此得到hmtA被敲除的突變株Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014o
[0042]hmtB基因缺失突變菌株的構建過程同hmtA基因敲除，但是hmtB的缺失引物如下hmtBdelF:5，_cttggcgtccggtacgaccgtggtgccggaccgctcgtcATTCCGGGGATCCGTCGAC_3，，hmtBdelR: 5』-gaggcgtcgttcgccgacgacgtcgtacggatgcaccggTGTAGGCTGGAGCTGCTTC_3』 下劃線部分代表與hmtB基因同源。hmtB基因的PCR驗證引物為:IDhmtBF:5』_aggctcgtgtcggaggtagt_3』，IDhmtBR: 5』-cggcgggacagaatcttg-3』 ?由此得到hmtB被敲除的突變株 Streptomyceshimastatinicus sp.Nov Ju2015o
[0043]具體的突變株Streptomyceshimastatinicus sp.Nov Ju2014 的構建不意圖如圖3 所不，突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014 的 PCR 驗證圖如圖 4 所不。
[0044]具體的突變株Streptomyceshimastatinicus sp.Nov Ju2015 的構建不意圖如圖5 所不，突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015 的 PCR 驗證圖如圖 6 所不。
[0045]5.野生型菌株與雙交換突變菌株hmtA被敲除的突變株Streptomyceshimastatinicus sp.Nov Ju2014 和 hmtB 被敲除的突變株 Streptomyces himastatinicussp.Nov Ju2015的發酵及其HPLC分析
[0046]野生型菌株和雙交換突變菌株分別在改良的ISP4(M_ISP4)固體培養基平板上30°C培養7天，挑取適量孢子接種於裝有50mL himastatin步驟I的培養基的三角瓶中，在28°C和200rpm轉速的搖床上培養7天。發酵液用2倍體積的乙酸乙酯萃取，有機相的萃取液經旋蒸儀蒸乾後溶於ImL甲醇中，12000rpm離心5min後，取上清液進行HPLC分析。HPLC分析結果見圖7和圖8。通過突變株和野生型菌株發酵產物的HPLC分析檢測及HPLC圖譜的積分比值計算出了 himastatin在突變株中產量提高的倍數。從圖7和圖8可以看出，野生型 Streptomyces himastatinicus sp.Nov、突變株Streptomyces himastatinicus sp.NovJu2014 和 hmtB 被敲除的突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015 在同等條件下發酵，與野生型比較，突變株Sti^ptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2014和hmtB被敲除的突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov Ju2015 的目標產物 himastatin 的產量較野生型菌株高出了 10倍以上。因此，該環脂肽類抗生素himastatin兩種高產突變株的成功構建為加速抗生素himastatin的產業化進程帶來了可能與希望。
[0047]M-1SP4培養基(改良的ISP4液體培養基):是在ISP4培養基的基礎上加入蛋白腖、酵母提取物和海鹽，使終質量分數分別為:0.1%、0.05%、3%。即M-1SP4培養基的配方為:每升M-1SP4培養基含有:可溶性澱粉10g，K2HPO4Ig, MgSO4.7H20 lg，NaCl lg，(NH4)2S042g, CaC032g, FeSO4.7H20 0.0Olg, MnCl2.4H20 0.0Olg, ZnSO4.7H20 0.0Olg、蛋白腖lg、 酵母提取物0.5g、粗海鹽30g，餘量為水，pH7.0~7.4。固體培養基是在液體培養基的基礎上加入1.5%的瓊脂。
【權利要求】
1.himastatin 高產突變株 Streptomyces himastatinicus sp.Nov,其特徵在於，其是hmtA 基因或者 hmtB 基因失活的 Streptomyces himastatinicus sp.Nov,所述的 hmtA 基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.一種權利要求1 所述的 himastatin 高產突變株 Streptomyces himastatinicussp.Nov 的構建方法，其特徵在於，是將 Streptomyces himastatinicus sp.Nov 的 hmtA 基因或者hmtB基因失活，由此獲得himastatin高產突變株Streptomyces himastatinicussp.Nov，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.hmtA基因或者hmtB基因在調控himastatin產量中的應用，所述的hmtA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述的hmtB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
【文檔編號】C12N1/21GK104164399SQ201410372728
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】鞠建華, 馬俊英, 張雲, 李青連, 黃洪波, 宋永相, 王博, 謝運昌 申請人:中國科學院南海海洋研究所