分離Tr1細胞的新方法

2023-05-09 16:39:46

專利名稱：分離Tr1細胞的新方法
技術領域：
本發明涉及用於鑑別和/或分離Trl細胞、休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的方法，經過富集的Trl細胞、休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的群體，去除Trl細胞、休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的群體，以及用於診斷或治療慢性炎症性疾病、自身免疫疾病、過敏性疾病、癌症和器官移植病症的方法和試劑盒。
背景技術：
免疫系統的體內平衡依賴於針對入侵病原體的免疫應答與針對自身抗原的免疫耐受之間的平衡。中樞和外周耐受都是用於誘導和維持T細胞耐受的重要機制。在過去的十年裡，已經對在維持外周免疫耐受方面扮演重要角色的調節性T細胞(Treg)給予了眾多關注。現在已經公認Treg可以分成兩種不同的亞型天然Treg(nTreg)和誘導型Treg群體，例如TGF-β誘導的Treg細胞、Trl細胞或Th3細胞。因為這些Treg群體在外周免疫 耐受中扮演重要角色，所以能夠鑑別、分離或富集這些不同的Treg亞組以便促進對於免疫病症(例如慢性炎症性疾病、自身免疫疾病或過敏性疾病)的診斷、評估或治療已經變成一個關鍵議題。舉例來說，自nTreg被鑑別以來，其一直是通過⑶25的表達來進行鑑別。然而，⑶25也是常規T細胞(convT)的一種活化標誌物，因此不是Treg細胞所專有的。通過鑑別例如 Foxp3、CD127(W02007140472)、CD45RA(W02007/117602)、CD 134 (W02009/036521)和⑶49d(W02009/047003)等細胞表面或細胞內標誌物已經在人類nTreg的辨別方面取得了最新進展。關於Trl細胞，其特異性鑑別仍然存在困難且主要基於IL-10分泌辨別。因此需要提供用於更好地且更精確地辨別Trl細胞的方式。此外，Trl細胞已被證實可用於細胞療法中，Trl細胞注射入患有克羅恩病(Crohn’s disease)的患者體內以改善其狀況。鑑於Trl細胞在細胞療法中的用途，因此需要更精確地鑑別和分離Trl細胞。發明人已經發現可使用⑶127和⑶62L細胞表面標誌物特異性地鑑別Trl細胞。實際上，除⑶4標誌物和任選的⑶25標誌物以外，另外使用⑶127和⑶62L這兩種標誌物允許在常規的休眠和活化T細胞以及休眠和活化nTreg中辨別Trl細胞。

發明內容
本發明的一個目的是一種鑑別Trl細胞群體的方法，其包含檢測細胞群體上的⑶4、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達，其中表達-CD4 和-低水平的CD127，和-低水平的CD62L，的細胞是Trl細胞。本發明的另一個目的是一種鑑別休眠Trl細胞群體的方法，其包含檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、以及⑶127和⑶62L標誌物中至少一種的細胞表面表達，其中表達-CD4 和-低水平的⑶127和⑶62L中的至少一種，且不表達-CD25，的細胞是休眠Trl細胞。本發明的另一個目的是一種鑑別休眠Trl細胞群體的方法，其包含檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達，其中表達·
-CD4 和-低水平的CD 127，-低水平的CD62L，且不表達-CD25，的細胞是休眠Trl細胞。本發明的另一個目的是一種鑑別活化Trl細胞群體的方法，其包含檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達，其中表達-CD4，-CD25，-低水平的CD127，和-低水平的CD62L，的細胞是活化Trl細胞。本發明的另一個目的是一種用於分離休眠或活化Trl細胞群體的方法，其包含如上所述鑑別休眠Trl細胞群體或活化Trl細胞群體，和分離所述群體。本發明的另一個目的是一種分離的休眠Trl細胞或活化Trl細胞群體，其是通過如上所述的方法獲得。本發明的另一個目的是一種經過分離的Trl細胞群體，其是通過如上所述的方法獲得。本發明的另一個目的是一種經過分離的休眠Trl細胞群體，其是通過如上所述的
方法獲得。本發明的另一個目的是一種經過分離的活化Trl細胞群體，其是通過如上所述的
方法獲得。本發明的另一個目的是一種用於富集細胞群體中的Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4、低水平的⑶127和低水平的⑶62L的細胞，-選擇所述細胞，從而獲得Trl細胞被富集的細胞群體，其中Trl細胞的百分比是富集之前Trl細胞的百分比的至少兩倍。本發明的另一個目的是一種用於富集細胞群體中的休眠Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4以及低水平的⑶127和⑶62L中的至少一種，且不表達⑶25的細胞，-選擇所述細胞，從而獲得休眠Trl細胞被富集的細胞群體，其中休眠Trl細胞的百分比是富集之前休眠Trl細胞的百分比的至少兩倍。本發明的另一個目的是一種用於富集細胞群體中的活化Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4、⑶25且表達低水平的⑶127和低水平的⑶62L的細胞，-選擇所述細胞，
從而獲得活化Trl細胞被富集的細胞群體，其中活化Trl細胞的百分比是富集之前活化Trl細胞的百分比的至少兩倍。本發明的另一個目的是一種用於富集細胞群體中的休眠和/或活化Trl細胞的方法，其包含如上所述鑑別休眠和/或活化Trl細胞，和選擇所述細胞，從而獲得休眠和/或活化Trl細胞被富集的細胞群體，其中休眠和/或活化Trl細胞的百分比是富集之前休眠和/或活化Trl細胞的百分比的至少兩倍。本發明的另一個目的是一種經過富集的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞的群體，其是根據如上所述的方法獲得。本發明的另一個目的是一種用於去除細胞群體中的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞的方法，其包含-根據本發明鑑別Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞，-去除所述細胞，從而獲得Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞被去除的細胞群體，其中Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞的百分比是去除之前Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞的百分比的至多O. 5倍。本發明的另一個目的是一種用於去除細胞群體中的休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的方法，其包含如上文所定義那樣鑑別休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞，和去除所述細胞，從而獲得休眠和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體，其中休眠和/或活化Trl的百分比是去除之前休眠和/或活化Trl細胞的百分比的至多O. 75倍。本發明的另一個目的是一種休眠和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體，其是根據上述方法獲得。本發明的另一個目的是一種Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞被去除的細胞群體，其是根據上述方法獲得。本發明的另一個目的是一種用於鑑別或分離Trl細胞群體、休眠Trl細胞群體或活化Trl細胞群體的試劑盒，其包含用於檢測⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L的細胞表面表達的工具。本發明的另一個目的是一種醫藥組合物，其包含如上所述的經過分離的休眠和/或活化Trl細胞群體,或如上所述的經過富集的休眠和/或活化Trl細胞群體,或如上所述的休眠和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體。在一個實施方案中，包含如上所述的經過分離的休眠和/或活化Trl細胞群體或如上所述的經過富集的休眠和/或活化Trl細胞群體的醫藥組合物是用於預防或治療與感染或移植或過敏性疾病有關的免疫應答，或用於預防或治療炎症性病症或自身免疫病症。本發明的另一個目的是一種如上所述的經過分離和/或富集的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞,其用於預防或治療與感染或移植或過敏性疾病有關的免疫應答,或用於預防或治療炎症性病症或自身免疫病症。本發明的另一個目的是一種如上所述的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞被去除的細胞群體，其用於在有需要的受試對象中增加免疫應答。在一個實施方案中，所述細胞群體是腫瘤抗原特異性T細胞群體。在一個實施方案中，包含如上所述的休眠和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體的醫藥組合物是用於在有需要的受試對象中治療癌症。在另一個實施方案中，所述細胞群體是腫瘤抗原特異性T細胞群體。本發明的另一個目的是一種如上所述的去除方法，其用於在離體情況下從有需要 的受試對象的血液中去除Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞。本發明的另一個目的是一種醫藥組合物，其包含休眠Trl細胞與活化Trl細胞的混合物，其中所述混合物是通過活體外擴增根據如上所述的方法獲得的經過分離的休眠Trl細胞群體而獲得。在一個實施方案中，所述醫藥組合物是用於治療與感染或移植或過敏性疾病有關的免疫應答，或用於預防或治療炎症性病症或自身免疫病症。本發明的另一個目的是一種用於活體外監測受試對象中的治療效果的方法，其包含根據如上所述的方法在治療之前和之後鑑別從受試對象獲得的生物樣品中的休眠和/或活化Trl細胞群體,其中治療之後休眠和/或活化Trl細胞群體的增加對應於對治療的響答。
具體實施例方式Trl細胞是一種獨特的細胞群體，其可通過下文所述的特異性細胞因子分泌特徵進行表徵。Trl細胞是從已經遭遇抗原的原初⑶4+T細胞分化而來。Trl細胞因此可以兩種狀態在活體內發現活化和休眠。如上所述，使用表面標誌物辨別Trl細胞、尤其是休眠和活化Trl細胞當前不可行，因為針對這些群體的特異性表面表型無法獲得。發明人意外地發現，休眠Trl細胞呈現以下表型⑶4+⑶25_CD127W_CD62LW_，且活化Trl細胞呈現以下表型⑶4+⑶25+CD127wTD62Lw_。這尤其令人吃驚，因為所屬領域中眾所周知休眠T細胞典型地表達高水平的⑶62L。本發明提供用於鑑別、分離、富集和/或去除人類Trl細胞、尤其是人類休眠Trl細胞和人類活化Trl細胞的方法。本發明還提供獲得的Trl細胞、休眠Trl細胞和活化Trl細胞群體或組合物和使用方法。本發明的一個目的是一種鑑別Trl細胞群體的方法，其包含檢測細胞群體上的⑶4、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達，其中表達⑶4、低水平的⑶127和低水平的⑶62L的細胞是Trl細胞。本發明的另一個目的是一種鑑別休眠Trl細胞群體的方法，其包含檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、以及至少⑶127和⑶62L 二者之一的標誌物的細胞表面表達，其中表達⑶4、表達低水平的⑶127和⑶62L中的至少一種但不表達⑶25的細胞是休眠Trl細胞。本發明的另一個目的是一種鑑別活化Trl細胞群體的方法，其包含檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達，其中表達⑶4、⑶25、低水平的⑶127和低水平的⑶62L的細胞是活化Trl細胞。本發明的另一個目的是一種在常規的休眠和活化T細胞和天然調節性休眠和活化T細胞中鑑別休眠Trl細胞群體和/或活化Trl細胞群體的方法，其中休眠Trl細胞是CD4+CD25TD127WXD62LW-，活化 Trl 細胞是 CD4+CD25+CD127WTD62LW'發明人因此證明可使用⑶4、⑶127和⑶62L標誌物特異性地鑑別Trl細胞。更具體地說，發明人還證實可使用⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L標誌物區分休眠Trl細胞與活化Trl細胞。如本文所用，術語「標誌物」是指細胞表面上的可用於辨別細胞群體的蛋白質、碳水化合物或脂質。如本文所用，術語「表達」可互換地指代基因或基因產物(包括被編碼的多肽或蛋白質)的表達。基因產物的表達可以例如使用一種或一種以上與多肽結合的抗體通過免疫分析來確定。或者，基因的表達可以通過測量mRNA水平(例如通過RT_PCR、qPCR)來確定。術語「原初」在所屬領域中是眾所周知的，並且是指尚未遭遇任何特異性抗原的免疫細胞或細胞群體。原初T細胞是休眠細胞。術語「休眠」在所屬領域中是眾所周知的，並且是指未增殖、未產生細胞因子且未在表面上表達常規免疫細胞活化分子例如CD25的免疫細胞或細胞群體。休眠T細胞可能是原初T細胞或記憶T細胞。術語「活化」在所屬領域中是眾所周知的，並且是指發生增殖和/或產生細胞因子並在其表面上表達常規免疫細胞活化分子例如CD25的免疫細胞或細胞群體。特別是對於T淋巴細胞來說，從休眠到活化狀態的轉換是通過T細胞與其特異性抗原遭遇或通過用活化性細胞因子或有絲分裂原進行活化來調節的。關於CD127W_、CD62LW_或CD25LW_使用的術語「低」或「Ιο」或「lo/_」在所屬領域中是眾所周知的，且是指目的細胞標誌物的表達水平，也就是說細胞標誌物的表達水平與所述細胞標誌物在整體分析的細胞群體中的表達水平相比是較低的。更具體地說，術語「Ιο」是指一種獨特細胞群體的細胞標誌物的表達水平低於一種或一種以上其它獨特細胞群體。術語「高」或「hi」或「明亮」在所屬領域中是眾所周知的，且是指目的細胞標誌物的表達水平，也就是說細胞標誌物的表達水平與所述細胞標誌物在作為整體被分析的細胞群體中的表達水平相比是高的。術語「 + 」和「 」在所屬領域中是眾所周知的，且是指目的細胞標誌物的表達水平，也就是說對應於「 + 」的細胞標誌物的表達水平是較高或中等的，也稱為「+/_」，而對應於
的細胞標誌物的表達水平則是較低或沒有的。一般來說，在染色強度的前2%、3%、4%或5%範圍內的細胞被指定為「hi」，而落入群體的前50%範圍內的細胞被分類為「 + 」。低於螢光強度的50%以下的那些細胞被指定為「 Ιο」細胞，且小於5%的被指定為細胞。如本文所用，術語「⑶127」是指「白細胞介素-7受體」，其存在於Trl細胞表面上。IL-7受體α鏈在文獻中已有描述(例如Goodwin等人(1990)Cell 60:941-951)。IL-7R在文獻中也稱作⑶127。「⑶127+」是指在用針對⑶127的被標記的抗體處理時，中等或明亮染色的細胞。「CD127W_」是指當接觸被標記的CD127抗體時輕微/暗淡染色或完全不染色的一類細胞。一般來說，基於容易辨別的染色強度差異，根據細胞的CD127表達水平來區別細胞，這對於所屬領域的一般技術人員是眾所周知的。在一些實施方案中，可依據對於所有細胞所觀察到的螢光強度分 布來設定用於將細胞指定為CD127W_細胞的臨界值，其中降至螢光強度的50%、40%、30%或20%以下的細胞被指定為⑶127w_細胞。⑶127—細胞可被指定為螢光強度低於最低百分之十的細胞。在一些實施方案中，獲得所有細胞的CD127染色的頻率分布，並對較高染色群體和較低染色群體進行群體曲線擬合，以及根據各群體分布的統計分析，將細胞分配到在統計學上最可能屬於的群體。在一些實施方案中，001271/_細胞的染色強度比⑶127+細胞小兩到三倍。如本文所用，術語「⑶62L」是指L-選凝素(selectin)，其是用於淋巴細胞遷移的關鍵粘附分子。「⑶62L+」是指在用針對⑶62L的被標記的抗體處理時，中等或明亮染色的細胞。「⑶62LW_」是指當接觸被標記的⑶62L抗體時輕微/暗淡染色或完全不染色的一類細胞。一般來說，基於容易辨別的染色強度差異，根據細胞的CD62L表達水平來區別細胞，這對於所屬領域的一般技術人員是眾所周知的。在一些實施方案中，可依據對於所有細胞所觀察到的螢光強度分布來設定用於將細胞指定為CD62LW_細胞的臨界值，其中低於螢光強度的50%、40%、30%或20%的細胞被指定為⑶62LW_細胞。⑶62L—細胞可被指定為螢光強度低於最低百分之十以下的細胞。在一些實施方案中，獲得所有細胞的CD62L染色的頻率分布，並對較高染色群體和較低染色群體進行群體曲線擬合，以及根據各群體分布的統計分析，將細胞分配到在統計學上最可能屬於的群體。在一些實施方案中，CD62LW_細胞的染色強度比⑶62L+細胞小兩到三倍。如本文所用，術語「CD4」是指典型地在成熟輔助T細胞和不成熟胸腺細胞上以及在單核細胞和巨噬細胞上發現的細胞表面糖蛋白。在T細胞上，CD4是T細胞受體(TCR)的輔受體且募集酪氨酸激酶lck。⑶4通過其Dl部分可連接到II類MHC分子的β 2區域上。「⑶4+」是指在接觸被標記的抗⑶4抗體時明亮染色的細胞，且「⑶4_」是指在接觸被螢光標記的CD4抗體時染色明亮度最低、暗淡染色或完全不染色的一類細胞。一般來說，基於容易辨別的染色強度差異，根據細胞的CD4表達水平來區別細胞，因為CD4染色明顯是雙峰態的。在一些實施方案中，獲得所有細胞的CD4染色的頻率分布，並對較高染色群體和較低染色群體進行群體曲線擬合，以及根據各群體分布的統計分析，將細胞分配到在統計學上最可能屬於的群體。在一些實施方案中，CD4_細胞的染色強度比CD4+細胞小兩到三倍。如本文所用，術語「CD25」是指白細胞介素-2受體的α亞單位，它是分子量為55kD的單鏈糖蛋白。在存在單核因子白細胞介素-I的情況下用抗原或有絲分裂原活化T細胞之後，白細胞介素2(IL-2)被快速合成並且分泌。響應於這種情況，一種T細胞亞群表達針對IL-2的高親和力受體。這些細胞發生增殖，從而擴增能夠調節輔助、抑制和細胞毒性功能的T細胞群體。IL-2受體不是在T細胞中唯一發現的。「⑶25hi」是指在接觸被標記的抗CD25抗體時明亮染色的細胞，「CD25+」是指在接觸被標記的抗CD25抗體時染色明亮度較低的細胞，且「CD25W_」是指在接觸被標記的CD25抗體時染色明亮度最低、暗淡染色或不染色的一類細胞。一般來說，基於染色強度差異，根據細胞的CD25表達水平來區別細胞，這對於所屬領域的一般技術人員是眾所周知的。在一些實施方案中，可依據對於所有細胞所觀察到的螢光強度分布來設定用於將細胞指定為CD25表達類別hi、+、Io或-細胞的臨界值。一般來說，在染色強度的前或5%範圍內的細胞被指定為「hi」，而落入到群體的前50%範圍內的細胞被分類為「 + 」。低於螢光強度的50%的那些細胞被指定為⑶251°細胞，且低於5%的被指定為⑶25_細胞。如本文所用，術語「Foxp3」是指核蛋白Foxp3,其被認為用作轉錄因子(Hori等人，2003 ；Yasayko, J. E.等人，Nat. Genet. 27 :68-73(2001) ；Fontenot, J. D.等人，Nat.Immunol. 4 :330-336(2003) ；Khattri, R.等人，Nat. Immunol. 4 :337-342 (2003))。因為Foxp3位於細胞內，所以Foxp3表達可通過使用被標記的抗Foxp3抗體(eBioscience inc或BD biosciences)的胞內流式細胞術進行評估。根據本發明，Trl細胞在活化後能夠分泌高水平的IL-10和中等水平的TGF-β。Trl細胞部分地由其獨特的細胞因子特徵進行表徵其產生高水平的IL-10，中等水平的TGF-β和中等水平的IFN-Y，但產生很少的或不產生IL-4或IL-2。典型地在細胞培養物中，在用T淋巴細胞的多克隆活化物(例如抗CD3+抗CD28抗體或白細胞介素-2、PMA+離子黴素(ionomycin))活化之後對細胞因子的產生進行評估。或者，在細胞培養物中，在用 抗原呈遞細胞所呈遞的特異性T細胞抗原活化之後對細胞因子的產生進行評估。高水平的IL-10 對應於至少約 500pg/ml，典型地大於約 1000、2000、4000、6000、8000、10000、12000、14000、16000、18000或20000pg/ml或以上。中等水平的TGF-β對應於至少約100pg/ml，典型地大於約200、300、400、600、800或1000pg/ml或以上。中等水平的IFN-Y對應於介於0. lpg/ml與至少400pg/ml之間的濃度，典型地大於約600、800、1000、1200、1400、1600、1800或2000pg/ml或以上。很少的或無IL-4或IL-2對應於小於約500pg/ml，優選小於約250、100、75 或 50pg/ml 或以下。Trl細胞可以在操作上用細胞表面標誌物進行表徵。這些細胞表面標誌物可以用與細胞表面標誌物特異性地結合的試劑進行識別。舉例來說，Trl細胞表面上的蛋白質、碳水化合物或脂質可以用對特定蛋白質或碳水化合物具有特異性的抗體在免疫學上進行識別(關於針對標誌物的抗體的使用，請參見Harlow, Using Antibodies A LaboratoryManual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1999);也可參見實施例)。在Trl細胞表面上存在的和在這些細胞的表面上不存在的標誌物群集都是Trl細胞的特徵。因此，可以通過使用細胞表面標誌物進行陽性和陰性選擇來選擇Trl細胞。與Trl細胞所表達的細胞表面標誌物(「陽性標誌物」)結合的試劑可用於對Trl細胞進行陽性選擇(即保留對細胞表面標誌物進行表達的細胞)。相反地，陰性選擇依賴於某些細胞表面標誌物不被Trl細胞表達這一事實。因此，「陰性標誌物」(即不存在於Trl細胞的細胞表面上的標誌物)可用於消除群體中的不是Trl細胞的那些細胞，所述消除是通過除去與對陰性標誌物具有特異性的試劑結合的細胞來進行的。在一個實施方案中，基於檢測到的細胞表面標誌物的表達對細胞進行辨別是通過比較細胞表面標誌物的表達與對照細胞群體的平均表達實現。舉例來說，可將標誌物在Trl細胞上的表達與來源於和Trl細胞相同的樣品的其它細胞上相同標誌物的表達進行比較。通過標誌物表達來辨別細胞的其它方法包括使用試劑組合通過流式細胞術選擇細胞(參見 Givan A, Flow Cytometry First Principles, (ffiley-Liss, New York,1992) ；OwensM A&Loken M R. , Flow Cytometry-Principles for Clinical Laboratory Practice,(ffiley-Liss, New York,1995))。
「試劑組合」意思是至少兩種試劑，其結合於Trl細胞表面上存在(陽性標誌物)或不存在(陰性標誌物)的細胞表面標誌物，或結合於陽性和陰性標誌物的組合。舉例來說，使用對Trl細胞表面標誌物具有特異性的抗體的組合可以從多種樣品/組織中分離和/或富集Trl細胞。對在從樣品獲得的細胞針對表型特徵進行選擇，使用識別種特異性多種標誌物的抗體來富集和選擇Trl細胞。「經過富集的」(如用在經過富集的細胞群體中)的定義可基於,在經過分級的細胞組中具有特定標誌物的細胞的數目比在未經過分級的細胞組中具有所述標誌物的細胞的數目增加。在特定實施方案中，使用結合對Trl細胞具有特異性的細胞表面標誌物的試劑並使用細胞分選分析法(例如螢光活化細胞分選(FACS)、固相磁珠等)分離這些細胞，從而從細胞群體富集Trl細胞。在一些實施方案中，可使用分選細胞的方法的組合，例如先使用磁性選擇，後使用FACS。為了增強富集，使用細胞表面標誌物將陽性選擇與陰性選擇進行組合用於分離Trl細胞。預期使用細胞表面標誌物對Trl細胞的分離/富集可以任何次序進行。因此，陽性選擇步驟之後可緊跟陰性選擇步驟，或反之亦然。也預期可通過組合陽性選擇與陰性選擇步驟來進行分離/富集。因此，分離/富集是通過首 先進行所述方法的陽性選擇步驟，隨後進行所述方法的陰性選擇步驟來進行，或反之亦然。根據本發明的「抗X抗體」或「X抗體」是可特異性地結合到X上的抗體。舉例來說，抗CD127抗體或CD127抗體能夠結合CD127。根據本發明使用的抗體包括(但不限於)重組抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人類單克隆抗體、人源化或靈長類動物源化單克隆抗體和抗體片段。市場上可以購得眾多的淋巴細胞生物標誌物特異性抗體。這些抗體包括抗⑶127、抗⑶4、抗⑶62L和抗⑶25抗體。「抗體」是指包含來自免疫球蛋白基因的框架區的多肽或其片段，其特異性地結合抗原並識別抗原。公認的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、ε和μ恆定區基因，以及多種免疫球蛋白可變區基因。輕鏈被分類為K或λ。重鏈被分類為Y、μ、α、δ或ε ,這又分別定義免疫球蛋白類別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型地，抗體的抗原結合區對於結合特異性和親和力是最重要的。示例性免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈構成，每對具有一個「輕鏈」(約25kD)和一個「重鏈」(約50-70kD)。每個鏈的N末端界定約100到110或更多個胺基酸的可變區，其主要負責抗原識別。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別是指這些輕鏈和重鏈。抗體是例如作為完整免疫球蛋白存在，或作為通過用各種肽酶進行消化而產生的多個公認片段存在。因此，舉例來說，胃蛋白酶通過鉸鏈區中的二硫鍵消化抗體以便產生F(ab)丨2，這是一種Fab 二聚體，Fab自身為通過二硫鍵與VH-CHl結合的輕鏈。F(ab) ' 2可以在溫和條件下還原，以便破壞鉸鏈區中的二硫鍵，從而將F(ab) ' 2 二聚體轉化為Fab'單體。Fab'單體實質上就是具有部分鉸鏈區的Fab (參見FundamentalImmunology (Paul編輯,第3版1993))。雖然各種抗體片段是依據完整抗體的消化來定義，但所屬領域的技術人員將了解到，所述片段可以化學方法或通過使用重組DNA方法從頭合成。因此，如本文所用的術語抗體還包括通過修飾完全抗體而產生的抗體片段，或使用重組DNA方法從頭合成的抗體片段(例如單鏈Fv)，或使用噬菌體展示文庫鑑別的抗體片段(例如參見McCafferty等人,Nature 348 :552-554 (1990))。在一些實施方案中，祀標的高親和力配體可代替抗體使用。當涉及蛋白質或肽時，短語「與抗體特異性地(或選擇性地)結合」或「與......特異性地(或選擇性地)免疫反應」是指可確定蛋白質的存在的結合反應，通常用在異源蛋白質群體和其它生物製品中。在所述條件下與抗體的特異性結合需要基於針對特定蛋白質的特異性而被選擇的抗體。舉例來說，可以選擇多克隆抗體以便只獲得與被選擇的抗原特異性地免疫反應但不與其它蛋白質特異性地免疫反應的那些多克隆抗體。這種選擇可通過去掉與其它分子交叉反應的抗體來實現。優選地，「標記」或「可檢測部分」與抗體共價地或非共價地連接。標記可以通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、化學的手段或其它物理手段檢測。螢光染料是尤其有用的標記。將標記與抗體連接的方法對於所屬領域的一般技術人員是眾所周知的。尤其優選的標記是通過連接子與抗體連接的標記，所述連接子容易通過在生理條件下與預定酶接觸而被裂解或分揀或發生水解。抗體也可以與磁性粒子(例如順磁性微珠(MiltenyiBiotec, Germany))結合。被經過磁性標記的抗體結合的活化T細胞可使用包括(但不限於)磁性細胞分選的技術來分離。針對⑶127、⑶62L、⑶4和⑶25以及許多其它分化群(cluster of differentiation)的被適當標記的抗體可以在市場上購得,並且對於所屬領域的一般技術人員是已知的。抗體可以在接觸樣品之前或之後或者在接觸CD之前或之後進行標記。CD抗體可以通過接觸與CD抗體結合的被標記抗體來進行標記。如本文所用，術 語「CD」或「分化群」或「共同決定子」是指抗體所識別的細胞表面分子。根據本發明，Trl細胞群體可以通過檢測細胞群體上的⑶4、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達來鑑別表達⑶4 (即⑶4+)且表達低水平的⑶127和⑶62L (即⑶127w_和⑶62L1。勹的細胞對應於Trl細胞。根據本發明，休眠Trl細胞群體可以通過檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、以及至少⑶127和⑶62L 二者之一的標誌物的細胞表面表達來鑑別表達⑶4(即⑶4+)且表達低水平的⑶127和⑶62L二者中的至少一種(即⑶1271/_和/或⑶62L1。勹、優選低水平的⑶127和⑶62L，但不表達⑶25(即⑶25_)的細胞對應於休眠Trl細胞。在本發明的一個實施方案中，還評估了標誌物Foxp3，並且表達⑶4 (即⑶4+)且表達低水平的⑶127和⑶62L 二者中的至少一種(即⑶1271*和/或⑶62L1。勹、優選低水平的CD127和CD62L，但不表達CD25 (即CD25_)且另外不表達Foxp3 (即Foxp3_)的細胞對應於休眠Trl細胞。根據本發明，活化Trl細胞群體可以通過檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達來鑑別表達⑶4和⑶25(即⑶4+⑶25+)且表達低水平的CD 127和CD62L(即CD127lo/_和CD62L1,)的細胞為活化Trl細胞。在一個實施方案中，還評估了標誌物Foxp3，並且表達⑶4和⑶25 (即⑶4+⑶25+)且表達低水平的CD 127和CD62L(即CD Xltoh和/或CD62LW_)且表達Foxp3 (即Foxp3+)的細胞為活化Trl細胞。用於鑑別/選擇所述Trl細胞的與所述標誌物(CD4、CD25、CD127、CD62L和Foxp3)結合的優選試劑是抗體。在另一個實施方案中，抗體與螢光染料或磁性粒子結合。在另一個實施方案中，細胞選擇是通過流式細胞術、螢光活化細胞分選、磁性選擇、親和色譜或淘選或其組合來進行。本發明的另一個目的是一種經過分離的Trl細胞群體，其是通過如上所述的鑑別方法且隨後進行分離而獲得。本發明的另一個目的是一種經過分離的休眠Trl細胞群體，其是通過如上所述的鑑別方法且隨後進行分離而獲得。本發明的另一個目的是一種經過分離的活化Trl細胞群體，其是通過如上所述的鑑別方法且隨後進行分離而獲得。本發明的另一個目的是一種經過分離的休眠和活化Trl細胞群體，其是通過如上所述的鑑別方法且隨後進行分離而獲得。「經過分離的」是指細胞或細胞群體是從其天然環境(例如外周血)移出並且被分離或分揀的，其至少約75%、80%、85%和優選約90%、95%、96%、97%、98%、99%不含在天然條件下共存，但缺乏用於分離細胞的細胞表面標誌物的其它細胞。細胞群體的分離方法在所屬領域中是眾所周知的，且包括(但不限於)通過流式細胞術、磁性選擇、親和色譜、淘選或其組合進行的細胞分選。本發明的另一個目的是一種醫藥組合物，其包含如上所述的經過分離的休眠Trl 細胞和/或活化Trl細胞群體,或由如上所述的經過分離的休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞群體組成。在一個實施方案中，所述醫藥組合物包含藥學上可接受的載體。本文中可用的藥學上可接受的載體是常規載體。Remington』 s PharmaceuticalSciences，第16版，0sol，A.編· (1980)描述了適合於對本發明的組合物進行醫藥遞送的組合物和製劑。總的來說，載體的性質將取決於所用的給藥模式。舉例來說，腸胃外製劑通常包含可注射流體作為運載體，所述可注射流體包括藥學和生理學上可接受的流體，例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、芝麻油、甘油、乙醇、其組合等。載體和組合物可以是無菌的，且製劑適合於給藥模式。除生物中性載體以外，欲施用的醫藥組合物還含有少量的無毒輔助物質，例如潤溼劑或乳化劑、防腐劑和PH緩衝劑等，例如乙酸鈉或單月桂酸山梨醇酐酯。組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳液。本發明的另一個目的是一種用於富集細胞群體中的Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4和低水平的⑶127和⑶62L的細胞，-選擇所述細胞，-從而獲得Trl細胞被富集的細胞群體。本發明的另一個目的是一種用於富集細胞群體中的休眠Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4以及表達低水平的⑶127和⑶62L中的至少一種、優選低水平的⑶127和⑶62L，但不表達⑶25的細胞，-選擇所述細胞，-從而獲得休眠Trl細胞被富集的細胞群體。本發明的另一個目的是一種用於富集細胞群體中的活化Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4、⑶25和低水平的⑶127和⑶62L的細胞，-選擇所述細胞並進行分離，-從而獲得活化Trl細胞被富集的細胞群體。本發明的另一個目的是一種經過富集的Trl細胞群體，其是根據如上所述的方法獲得。
本發明的另一個目的是一種經過富集的休眠Trl細胞群體，其是根據如上所述的
方法獲得。本發明的另一個目的是一種經過富集的活化Trl細胞群體，其是根據如上所述的
方法獲得。用於選擇/富集所述細胞的與所述標誌物(⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L)結合的優選試劑是抗體。在另一個實施方案中，抗體與螢光染料或磁性粒子結合。在另一個實施方案中，細胞選擇是通過流式細胞術、突光活化細胞分選、磁性選擇、親和色譜或淘選或其組合來進行。Trl細胞被富集的組合物/群體是其中Trl細胞的百分比高於最初獲得的細胞群
體中Trl細胞的百分比的組合物/群體。雖然經過富集的Trl細胞群體可能含有同源Trl細胞群體，但這不是必需的。在特定實施方案中，組合物中所述細胞的至少約50%、約55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 98%或約 99%是Trl細胞。在另一個實施方案中，經過富集的組合物/群體中Trl細胞的百分比是富集之前Trl細胞的百分比的至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍。如本文所用，數字前面的術語「約」意思是比數字的值大或小10%。任何含有T細胞的細胞來源都可用於分離/富集Trl細胞。可用的來源包括(但不限於)外周血、滑液、脾、胸腺、淋巴結、骨髓、派伊爾斑和扁桃腺。基於與富集過程的每個步驟有關的富集水平，富集方法是可變的。Trl細胞的富集水平和百分比純度將取決於許多因素，包括(但不限於)供體、細胞/組織來源和供體的疾病狀態。在特定實施方案中，Trl細胞被富集至少約2倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約50倍、約55倍、約60倍、約65倍、約70倍、約75倍、約80倍、約85倍、約90倍、約95倍、約100倍、約105倍、約110倍、約115倍、約120倍、約130倍、約140倍、約150倍或約200倍。用於分揀、分離或選擇細胞的方法包括(但不限於)使用被抗體包被的磁珠的磁性分揀(Schwartz等人，美國專利第5，759，793號)，和使用附著到固體基質(例如平板)上的抗體的親和色譜或「淘選」。提供精確分揀的其它技術包括螢光活化細胞分選儀(FACS)，其可具有不同的複雜程度，例如具有多個彩色通道、低角度和遲鈍的光散射檢測通道或阻抗通道。死亡細胞可通過使用與死亡細胞相關的染料(例如碘化丙啶，LDS)進行選擇來消除。紅血球可通過例如淘析、溶血或Ficoll-Paque梯度來去除。對被選擇的細胞的活力不會過度有害的任何技術都可使用。適宜地，抗體可與標記進行結合用於多種不同目的例如磁珠，其用於使Trl細胞的分揀更容易；生物素，其以高親和力結合到抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素上；螢光染料，其可與螢光活化細胞分選儀一起使用；半抗原等。多色分析可與FACS—起使用，或與免疫磁性分揀和流式細胞術結合使用。多色分析是基於多種表面抗原用於分揀細胞而受到關注:例如非 CD4+免疫細胞標誌物(CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRy/δ 和血型糖蛋白(glycophorin)A)、CD4、CD25、CD127和CD62L。可用於多色分析中的螢光染料包括(但不限於)藻膽蛋白，例如藻紅蛋白和別藻藍蛋白；螢光素；和德克薩斯紅(Texas red)。磁性分揀是一種利用磁場梯度將磁性物質選擇性地保留在容器(例如離心管或柱)內的方法。可通過經由特異性相互作用(包括免疫親和相互作用)將磁性粒子結合到細胞表面上而對Trl細胞進行磁性標記。合適容器內的含有Trl細胞的懸浮液然後暴露於足夠強度的磁場梯度下，以便分開Trl細胞與懸浮液中的其它細胞。容器然後用合適流體洗滌以去除未標記的細胞，從而獲得經過純化的Trl細胞懸浮液。大部分磁性標記系統使用表面共價結合有單克隆抗體或抗生蛋白鏈菌素的超順磁粒子。在細胞分揀應用中，這些粒子可用於陽性選擇，其中對目的細胞進行磁性標記並將其保留，或用於陰性選擇，其中對大部分不想要的細胞進行磁性標記並將其保留。所用粒子的直徑相差很大，從MACS粒子(Miltenyi Biotec)和StemSep (TM)膠體(StemCellTechnologies)的約 50_100nm 到 EasySep (R) (StemCell Technologies)和 Imag 粒子(BDBiosciences)的 150_450nm 到 Dynabeads (Dynal Biotech)的 4·2μηι 不等。所用粒子的類型受用於分揀被標記細胞的磁體技術影響。存在兩類重要的磁性分揀技術，它們出於便利和實用原因皆使用永磁體而不是電磁體。第一類是基於柱的高梯度磁場分揀技術，其使用弱磁性小粒子標記目的靶標，並在填充有可磁化基質的柱中分揀這些靶標。當對柱施加磁場時，在緊靠基質元件表面的地方產 生極高的梯度。高梯度是分揀用這些相對弱磁性粒子標記的靶標所必需的。第二類是基於試管的技術，其使用磁性更強的粒子標記目的靶標。這些目的靶標然後在離心型試管內通過用試管外部的磁體產生的磁場梯度進行分揀。這種方法的優點是它不依賴於可磁化基質來產生梯度，因此不需要昂貴的一次性柱，或涉及不便的清潔和去汙程序的可再生柱。一旦放在磁體內，被靶向細胞就會朝著磁場強度最高的一個或一個以上區域遷移，並被保留在磁場內，而未標記的細胞則被排出。然後可在從磁場移出被靶向細胞之後收集被靶向細胞，並進行使用。在需要陰性選擇的情況下，未標記的細胞被保留並可用於多種應用。FACS允許基於細胞亞群通過雷射束時的光散射性質對其進行分揀。前向光散射(FALS)與細胞大小有關，且直角光散射(也稱為側向散射特徵(SSC))與細胞密度、細胞內容物和核-胞質比率(即細胞複雜度)有關。因為細胞可以用螢光結合抗體進行標記，所以所述細胞可進一步通過抗體(螢光)強度進行表徵。在特定實施方案中，使用免疫磁性色譜分離本發明的Trl細胞。舉例來說，將抗CD4抗體附著到磁珠上。這些經過抗體標記的磁珠是用作親和純化的基礎。將T細胞的經過抗體標記的部分施加到磁性親和柱上。不粘附的細胞被丟棄，粘附細胞通過移除磁場而從磁性柱上洗提。在另一個實施方案中，細胞首先用抗體(例如抗CD4)進行標記，然後用攜帶磁珠或磁球的二級抗體進行標記。在另一個實施方案中，可使用對Trl細胞具有免疫反應性的二級抗體對Trl細胞群體進行富集。二級抗體的使用在所屬領域中是通常已知的。典型地，二級抗體為對第一抗體的恆定區具有免疫反應性的抗體。優選的二級抗體包括抗兔、抗小鼠、抗大鼠、抗山羊和抗馬免疫球蛋白，且可以在市場上購得。在市場上可購得的試劑盒提供與標記試劑(例如但不限於磁性粒子和螢光染料)結合的二級抗體。在本發明的一個實施方案中，用於富集Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞群體的方法可包括-使細胞群體與結合於非CD4+細胞的標誌物的至少一種試劑接觸，從而去除非CD4+細胞，
-如上所述鑑別Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞並對其進行選擇和分離。結合於非⑶4+細胞的標誌物的實例包括(但不限於)⑶8、⑶14、⑶16、⑶19、⑶36、⑶56、⑶123和血型糖蛋白A。結合於所述標誌物的優選試劑為抗體。在另一個實施方案中，抗體與螢光染料或磁性粒子結合。在另一個實施方案中，細胞選擇是通過流式細胞術、螢光活化細胞分選、磁性選擇、親和色譜或淘選或其組合來進行。在本發明的一個實施方案中，根據本發明分離的Trl細胞可通過Wo2006/108882中描述的活體外方法進行進一步擴增。所述方法包括a)在低於35°C的溫度Tl下，在培養基Mf中培育飼養細胞，例如昆蟲飼養細胞，所述溫度Tl允許飼養細胞增殖且所述飼養細胞表達與以下細胞表面蛋白質相互作用的因子·
-CD3/TCR 複合物，-CD28 蛋白，-IL-2 受體，-CD2 蛋白，-IL-4 受體，b)使步驟a)中獲得的已清除或未清除培養基Mf的飼養細胞與培養基Mp中含有的Trl細胞群體接觸，其中所述培養基Mp最初不含步驟a)中所述的因子，以便獲得含有Trl細胞群體、飼養細胞和培養基Mp的混合物，c)在至少35°C的溫度T2下培育步驟b)中獲得的混合物，所述溫度被選擇成使得Trl細胞群體發生增殖且飼養細胞不發生增殖，d)回收經過如此擴增的Trl細胞群體。與上述細胞表面蛋白質相互作用的因子的實例包括-抗⑶3單克隆抗體或經過修飾的抗⑶3抗體，其中⑶3重鏈的抗⑶3胞漿內區域被跨膜區域替換，-抗⑶28抗體或其片段或⑶80或⑶86蛋白，-飼養細胞分泌的IL-2，-CD58 蛋白，-選自包括IL-4和IL-13的群組的白細胞介素。在本發明的一個實施方案中，如此獲得的Trl細胞可使用T細胞的常規克隆方法進行克隆。在本發明的一個實施方案中，如此獲得的Trl細胞或Trl細胞克隆可被冷凍儲存。本發明的另一個目的是一種用於去除細胞群體中的Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4和低水平的⑶127和⑶62L的細胞，-去除所述細胞，-從而獲得/分離Trl細胞被去除的細胞群體。本發明的另一個目的是一種用於去除細胞群體中的休眠Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4並表達低水平的⑶127和⑶62L中的至少一種、優選低水平的⑶127和⑶62L，但不表達⑶25的細胞，-去除所述細胞，-從而獲得/分離休眠Trl細胞被去除的細胞群體。本發明的另一個目的是一種用於去除細胞群體中的活化Trl細胞的方法，其包含-鑑別表達⑶4、⑶25和低水平的⑶127和⑶62L的細胞，-去除所述細胞，-從而獲得/分離活化Trl細胞被去除的細胞群體。
Trl細胞被去除的組合物/群體是其中Trl細胞的百分比低於最初獲得的細胞群體中Trl細胞的百分比的組合物/群體。本發明的另一個目的是一種Trl細胞被去除的細胞群體，其是根據如上所述的方
法獲得。本發明的另一個目的是一種休眠Trl細胞被去除的細胞群體，其是根據如上所述的方法獲得。本發明的另一個目的是一種活化Trl細胞被去除的細胞，其是根據如上所述的方
法獲得。如上文所解釋，用於分離細胞的方法包括(但不限於)使用被抗體包被的磁珠的磁性分揀、使用附著到固體基質(例如平板)上的抗體的親和色譜或「淘選」，和螢光活化細胞分選儀(FACS)。Trl細胞不是被選擇，而是被去除。在一個實施方案中，經過去除的組合物/群體中Trl細胞的百分比是去除之前Trl細胞的百分比的至多O. 75倍、O. 7倍、O. 6倍、O. 5倍、O. 4倍、O. 3倍、O. 25倍、O. 2倍、O. 15倍、O. I倍。本發明的另一個目的是一種醫藥組合物，其包含休眠和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體和藥學上可接受的載體，或由休眠和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體和藥學上可接受的載體組成。本發明的另一個目的是一種用於鑑別或分離Trl細胞群體、休眠Trl細胞群體或活化Trl細胞群體或用於富集或去除細胞群體中的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞的試劑盒，所述試劑盒包含用於檢測⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L的細胞表面表達的試劑。優選地，所述試劑為抗體。在另一個實施方案中，這些抗體與螢光染料或磁性粒子
彡口口 在另一個實施方案中，所述試劑盒進一步包含用於檢測Foxp3表達的試劑。優選地，所述試劑為抗體。更優選地，所述抗體與螢光染料結合。本發明的另一個目的是一種用於在有需要的受試對象中抑制免疫應答的方法，其包含對受試對象施用有效量的根據本發明的經過分離或富集的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞。另一個目的是一種用於在有需要的受試對象中抑制免疫應答的方法，其包含-根據如上所述的方法從生物樣品分離休眠Trl細胞，-擴增所述Trl細胞，-對受試對象施用經過擴增的Trl細胞。
因此，對受試對象施用的經過擴增的Trl細胞通過其抑制活性抑制不希望的免疫應答，從而對與不希望的免疫應答相關的病症進行治療。從細胞療法角度考慮，分離休眠Trl細胞的一個優點是打算施用的細胞群體是純的。使用休眠Trl細胞的另一個優點是其功效。實際上，所屬領域的技術人員已知，對已經活化的T細胞群體進行活化將誘導活體外細胞死亡，導致活體內效率較低。使用純Trl細胞群體的另一個優點是時間效率和成本效率。實際上，將這種群體活體外擴增到足夠用於細胞療法的數目僅需約2周。在本發明的一個實施方案中，休眠Trl細胞可從血液獲得，例如外周血或臍帶血，或從組織活檢獲得，例如淋巴結活檢、腸或滑液活檢或黏膜組織活檢，或從支氣管肺泡灌洗或腦脊髓液獲得。在另一個實施方案中，休眠Trl細胞是自體的或同種異體的。如本文所用的術語「同種異體細胞」是指從一個受試對象(供體)分離並注入另一個受試對象(受體或宿主)的細胞。如本文所用的術語「自體細胞」是指在同一個受試對象中分離並注射回的細胞。 用於擴增休眠Trl細胞群體的方法在所屬領域中是眾所周知的。在本發明的一個實施方案中，如W02006/108882中所述在活體外擴增休眠Trl細胞。所述方法包含a)在低於35°C的溫度Tl下，在培養基Mf中培育飼養細胞，例如昆蟲飼養細胞，所述溫度Tl允許飼養細胞增殖且所述飼養細胞表達與以下細胞表面蛋白質相互作用的因子-CD3/TCR 複合物，-CD28 蛋白，-IL-2 受體，-CD2 蛋白，-IL-4 受體，b)使步驟a)中獲得的已清除或未清除培養基Mf的飼養細胞與在培養基Mp中含有的Trl細胞群體接觸，以便獲得含有Trl細胞群體、飼養細胞和培養基Mp的混合物，其中所述培養基Mp最初不含步驟a)中所述的因子，c)在至少35°C的溫度T2下培育步驟b)中獲得的混合物，所述溫度被選擇成使得Trl細胞群體發生增殖且飼養細胞不發生增殖，d)回收經過如此擴增的Trl細胞群體。與上述細胞表面蛋白質相互作用的因子的實例包括-抗⑶3單克隆抗體或經過修飾的抗⑶3抗體，其中⑶3重鏈的抗⑶3胞漿內區域被跨膜區域替換，-CD80 或 CD86 蛋白，-飼養細胞分泌的IL-2，-CD58 蛋白，-選自包括IL-4和IL-13的群組的白細胞介素。抗⑶3單克隆抗體可用於通過TCR/⑶3複合物來活化T細胞群體，所述抗⑶3單克隆抗體有利地是經過修飾的抗CD3抗體，其中抗CD3抗體的修飾是用跨膜區域替換胞漿內區域，使得所述經過修飾的抗CD3抗體錨定到飼養細胞的細胞膜上並且與T細胞的CD3/TCR蛋白質複合物相互作用。與抗原特異性Trl細胞表面上存在的CD28蛋白相互作用且由飼養細胞表達的因子可以是能夠交聯CD28分子的抗CD28單克隆抗體或其片段；在這種情況下，可構想通過添加跨膜區域以便所述跨膜區域錨定到飼養細胞的細胞表面上來對抗CD28單克隆抗體進行修飾。優選地，使用CD28的天然配體代替抗CD28單克隆抗體，也就是說，例如B7蛋白質家族的成員，例如B7-l(⑶80)和B7-2(⑶86)蛋白質。由飼養細胞表達且與⑶2相互作用的因子可以是能夠交聯⑶2分子的抗⑶2單克隆抗體或其片段；可構想通過添加用於錨定到飼養細胞的細胞表面上的跨膜區域來對抗CD2單克隆抗體進行修飾。優選地，使用CD2的天然配體代替抗CD2單克隆抗體，也就是說CD58蛋白。除了錨定到飼養細胞的細胞膜上的因子以外，被分泌的因子(例如白細胞介素)也是抗原特異性Trl細胞群體的擴增所需要的。這些白細胞介素包括IL-2，其與抗原特異
性Trl細胞表面上存在的IL-2受體相互作用，或IL-4或IL-13，其與抗原特異性Trl細胞的IL-4受體相互作用。在本發明的另一個實施方案中，休眠Trl細胞是通過在存在例如IL-2、IL_4、IL-13和/或IL-15等細胞因子的情況下一起培養Trl細胞和抗⑶3/28珠來擴增。用於擴增休眠Trl細胞的所述試劑盒的一個實例為由Invitrogen商業化的Dynabeads 試劑盒(目錄號 111-41D)。在本發明的另一個實施方案中，休眠Trl細胞是通過在存在抗原的情況下一起培養Trl細胞和自體PBL、白細胞、PBMC、抗原呈遞細胞或表達II類MHC的人工抗原呈遞細胞(例如L細胞)來擴增。在本發明的另一個實施方案中，休眠Trl細胞是通過在存在例如IL-2等細胞因子的情況下一起培養Trl細胞和有絲分裂原(例如PHA)來擴增。在本發明的一個實施方案中，如此擴增的Trl細胞可使用T細胞的常規克隆方法進行克隆。在本發明的一個實施方案中，如此擴增的Trl細胞或Trl細胞克隆可被冷凍儲存。在本發明的一個實施方案中，經過擴增的Trl細胞對一種抗原具有特異性或對多種抗原具有特異性。經過擴增的Trl細胞可能具有的特異性的抗原的實例包括(但不限於)自體抗原；來自普通人類飲食的食物抗原；炎症抗原，例如多發性硬化的相關抗原或關節相關抗原；和過敏原。術語「來自普通人類飲食的食物抗原」是指來自人類普通食品的免疫原性肽，例如以下非限制性清單中的食物抗原牛抗原，例如脂質運載蛋白(Iipocalin)、鈣結合S100、α-乳清蛋白、乳球蛋白(例如β_乳球蛋白)、牛血清白蛋白、酪蛋白。食物抗原也可以是大西洋鮭(atlantic salmon)抗原,例如小白蛋白(parvalbumin);雞抗原,例如卵類粘蛋白(ovomucoid)、卵清蛋白、Ag22、伴白蛋白(conalbumin)、溶菌酶或雞血清白蛋白；花生、蟲下抗原，例如原肌球蛋白(tropomyosin);小麥抗原,例如凝集素(agglutinin)或麥醇溶蛋白(gliadin);芹菜抗原，例如芹菜抑絲蛋白(profilin);胡蘿蔔抗原，例如胡蘿蔔印絲蛋白；蘋果抗原，例如甜蛋白(thaumatin)、蘋果脂質轉移蛋白、蘋果抑絲蛋白；梨抗原，例如梨抑絲蛋白、異黃酮還原酶；鱷梨抗原，例如內切幾丁質酶(endochitinase);杏抗原,例如杏脂質轉移蛋白；桃抗原，例如桃脂質轉移蛋白或桃抑絲蛋白；大豆抗原，例如HPS、大豆抑絲蛋白或(SAM22)PR-IO蛋白。術語「自體抗原」是指從所述個體的蛋白質衍生的免疫原性肽。舉例來說，其可以是以下非限制性清單中的自體抗原乙醯膽鹼受體、肌動蛋白、腺嘌呤核苷酸轉運體(adenin nucleotide translocator)、腎上腺素受體、芳香族L-胺基酸脫羧酶、脫唾液酸糖蛋白受體、殺菌/滲透性增強蛋白(BPi)、鈣敏感受體、膽固醇側鏈裂解酶、IV型膠原蛋白鏈、細胞色素P4502D6、結蛋白(desmin)、橋粒芯糖蛋白-I (desmoglein-1)、橋粒芯糖蛋白-3、F-肌動蛋白、GM-神經節苷脂、穀氨酸脫羧酶、穀氨酸受體、H/K ATPase,17-羥化酶、21-羥化酶、IA-2(ICAS12)、胰島素、胰島素受體、I型內因子、白細胞功能抗原 I、髓鞘相關糖蛋白(myelin associated glycoprotein)、髓鞘鹼性蛋白(myelin basicprotein)、髓鞘少突膠質細胞蛋白(myelin oligodendrocyte protein)、肌球蛋白、P80-絲切蛋白(coilin)、丙酮酸脫氫酶複合物E2(PDC-E2)、鈉/碘同向轉運體(sodium iodidesymporter)、S0X-10、甲狀腺和眼睛肌肉共用蛋白(thyroid and eye muscle shared protein)、甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶、促甲狀腺激素受體、組織穀氨醯胺轉胺酶、轉錄輔活化因子P75、色氨酸羥化酶、酪氨酸酶、酪氨酸羥化酶、ACTH、氨醯基-tRNA-組氨醯合成酶、心磷脂(cardiolipin)、碳酸酐酶II、著絲粒相關蛋白、DNA依賴性核小體刺激性ATPase、纖維蛋白(fibrilIarin)、纖維粘連蛋白(fibronectin)、葡萄糖_6_磷酸異構酶、β-2_糖蛋白I、高爾基體蛋白(golgin) (95、97、160、180)、熱休克蛋白、半橋粒蛋白180、組蛋白H2A、組蛋白H2B、角蛋白、IgE受體、Ku-DNA蛋白激酶、Ku-核蛋白、La磷蛋白、髓過氧化物酶(myeloperoxydase)、蛋白酶3、RNA聚合酶1_111、信號識別蛋白、拓撲異構酶I、微管蛋白、波形蛋白(vimenscin)、髓鞘相關少突膠質細胞鹼性蛋白(MOBP)、蛋白脂質蛋白(proteolipid protein)、少突膠質細胞特異性蛋白(OSP/Claudin 11)、環核苷酸3'磷酸二酯酶(CNPase)、BP 抗原 I (BPAGl-e)、轉醛醇酶(transaldolase) (TAL)、人類線粒體自體抗原 PDC-E2 (Novo I 和 2)、0GDC-E2 (Novo 3)和 BC0ADC-E2 (Novo 4)、大皰性類天皰瘡(BP)180、層粘蛋白(Iaminin) 5 (LN5)、DEAD盒蛋白48 (DDX48)或胰島素瘤相關抗原_2。術語「多發性硬化的相關抗原」是指髓鞘鹼性蛋白(MBP)、髓鞘相關糖蛋白(MG)、髓鞘少突膠質細胞蛋白(MOG)、蛋白脂質蛋白(PLP)、少突膠質細胞髓鞘寡聚蛋白(OMGP)、髓鞘相關少突膠質細胞鹼性蛋白(MOBP)、少突膠質細胞特異性蛋白(OSP/Claudinl I)、熱休克蛋白、少突膠質細胞特異性蛋白(OSP)、NOGO A、糖蛋白Po、外周髓鞘蛋白22(PMP22)、2，3'-環核苷酸3"-磷酸二酯酶(CNPase)、其片段、變異體和混合物。術語「關節相關抗原」是指被瓜氨酸取代的環狀和線性絲聚蛋白(filaggrin)肽、II型膠原蛋白肽、人軟骨糖蛋白39(HCgp39)肽、HSP、異質核核糖核蛋白(heterogenousnuclear ribonucleoprotein) (hnRNP)A2 妝、hnRNP BI、hnRNP D、Ro60/52、HSP60、65、70和90、BiP、角蛋白、波形蛋白、纖維蛋白原、I型、III型、IV型和V型膠原蛋白肽、膜連蛋白V、葡萄糖-6-磷酸異構酶(GPI)、乙醯鈣蛋白酶抑制蛋白、丙酮酸脫氫酶(Η)Η)、醛縮酶、拓撲異構酶I、snRNP、PARP, Scl_70、Scl-100、磷脂抗原(包括陰離子性心磷脂和磷脂醯絲氨酸)、電中性磷脂醯乙醇胺和磷脂醯膽鹼、基質金屬蛋白酶、原纖維蛋白、聚集蛋白聚糖(aggreccan)。
術語「過敏原」是指吸入性過敏原、攝入性過敏原或接觸性過敏原。過敏原的實例包括(但不限於)來源於花粉(Cup、Jun)、屋塵蟎(Der、Gly、Tyr> Lep)、狗、貓和哨齒動物(Can、Fel、Mus、Rat)的吸入性過敏原。接觸性過敏原的實例包括(但不限於)重金屬(例如鎳、鉻、金)、乳膠、半抗原(例如氟燒(halothane)、肼苯咕嗪(hydralazine))。在本發明的一個實施方案中，可對經過擴增的Trl細胞進行配製以用於腸胃外、肌肉內、組織內、靜脈內或腹膜內注射、鼻內吸入、肺吸入、皮內或關節內注射。優選地，經過擴增的Trl細胞可通過肌肉內、腹膜內或靜脈內注射，或通過直接注入患者淋巴結，更優選地通過靜脈內注射來施用。本發明的另一個目的是一種醫藥組合物，其包含經過擴增的Trl細胞和藥學上可接受的載體或由經過擴增的Trl細胞和藥學上可接受的載體組成,這些Trl細胞是休眠Trl細胞與活化Trl細胞的混合物。本發明的另一個目的是一種醫藥組合物，其包含休眠Trl細胞與活化Trl細胞的·混合物，其中所述混合物是通過活體外擴增根據如上所述的方法獲得的經過分離的休眠Trl細胞群體而獲得。因此，醫藥組合物包含具有以下表型⑶4+^2510127^/106217,的休眠Trl細胞和具有以下表型⑶4+⑶25+⑶1的活化Trl細胞。打算施予有需要的受試對象的經過擴增的Trl細胞的表型可通過流式細胞術進行分析。在擴增步驟結束時，經過擴增的Trl細胞保持兩種狀態休眠狀態或活化狀態。不希望受理論束縛，發明人建議關注一種包含休眠Trl細胞與活化Trl細胞的混合物的組合物，因為活化Trl細胞在施用之後能夠立刻抑制炎症，而休眠Trl細胞則需要在原地活化以便發生活體內增殖並長期發揮其抑制活性。在一個實施方案中，受試對象已經接受或正在接受移植，例如骨髓移植或器官移植。在另一個實施方案中，受試對象發生感染，例如微生物感染、RSV感染、過敏症。本發明的另一個目的是一種用於在有需要的受試對象中預防或治療炎症性病症的方法，其包含對受試對象施用有效量的根據本發明的經過分離或富集的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞。本發明的另一個目的是一種用於在有需要的受試對象中預防或治療自身免疫病症的方法，其包含對受試對象施用有效量的根據本發明的經過分離或富集的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞。在本發明的一個實施方案中，細胞群體可以從隨後引入Trl細胞被富集的組合物的受試對象獲得。在本發明的一個實施方案中，受試對象可以是需要對免疫應答進行抑制的受試對象。在一個實施方案中，受試對象是受炎症性病症或疾病/病狀影響的人，例如包括(但不限於)以下各項的疾病/病狀中的任一種非自身免疫炎症性腸病、術後粘連、冠狀動脈疾病、肝纖維化、急性呼吸窘迫症候群、急性炎症性胰腺炎、內窺鏡逆行胰膽管造影術後胰腺炎、燒傷、冠狀動脈、腦動脈和外周動脈的動脈粥樣化、闌尾炎、膽囊炎、憩室炎、內臟纖維化病症、傷口癒合、皮膚結疤病症(瘢痕疙瘩、化膿性汗腺炎)、肉芽腫病症(結節病、原發性膽汁性肝硬化)、哮喘、壞疽性膿皮病、急性發熱性嗜中性皮膚病(Sweet, ssyndrome)、白塞病(Behcet' s disease)、原發性硬化性膽管炎和膿腫。在另一個實施方案中，受試對象是受包括(但不限於)以下各項的自身免疫病症或疾病/病狀影響的人紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、甲狀腺炎、血小板減少性紫癜、格雷夫斯病、糖尿病、幼年糖尿病、自發性自身免疫糖尿病、重症肌無力、愛迪生氏病(Addi son' sdisease)、關節炎性病症(例如類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、幼年特發性關節炎、牛皮癬性關節炎)、多發性硬化、牛皮癬、葡萄膜炎、自身免疫性溶血性貧血、硬皮病、炎症性腸病(例如自身免疫炎症性腸病、克羅恩病、結腸炎、與食物過敏有關的腸炎)、斯耶格倫氏症候群(Sjorgen, s disease)、橋本氏病(Hashimoto' s disease)、重症肌無力、自身免疫性多內分泌病症候群、I型糖尿病(TIDM)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜視網膜炎、多肌炎和甲狀腺炎，以及人類狼瘡作為代表的全身性自身免疫疾病。如本文所用的「自體抗原」或「自身抗原」是指哺乳動物天生具有且在所述哺乳動物疾病中具有免疫原性的抗原或表位。
本發明的細胞還可用於預防或治療移植反應，例如移植物抗宿主疾病(GVHD)、造血幹細胞移植和移植物排斥。在另一個實施方案中，受試對象受過敏或哮喘病症影響。過敏或哮喘病症的實例包括(但不限於)哮喘、特應性皮炎、過敏性鼻炎、結膜炎、溼疹、接觸過敏、吸入性過敏、攝入性過敏和過敏性反應。Trl細胞是使用所屬領域中眾所周知的方法(例如過繼細胞轉移)引入到患者體內。簡言之，從目標供體提取混合細胞群體。取決於應用，細胞可以在好轉期內提取，或在疾病活動期間提取。典型地，這是通過抽取全血並利用白細胞去除術收穫粒細胞來進行的。舉例來說,大體積白細胞去除術(LVL)已被證實可最大化血液白細胞產量。收穫的淋巴細胞可使用基於Trl特異性細胞標誌物(例如本文所述者)的細胞分揀技術進行分揀，然後輸注到患者、典型地細胞供體(除了供體與受體不同的GVHD)中以用於過繼免疫抑制。將大約IO3到1011、優選地IO4到10'優選地IO5到109、優選地IO6到109、更優選地IO6到IO8個Trl細胞注入患者中。如本文所用的術語「有效量」意思是治療物質或組合物的量，所述量足以縮減(到任何程度)或改善病症或其一種或一種以上症狀的嚴重性和/或持續時間、預防病症進展、引起病症消退、預防與病症有關的一種或一種以上症狀的復發、發展、發生或進展、檢測病症或者促進或提高另一種療法(例如預防或治療藥劑)的預防或治療效果。有效量將隨著受試對象的年齡、性別、種族、物種、一般情況等、所治療病症的嚴重性、施予的特定藥劑、治療持續時間、任何並行治療的性質、所用的藥學上可接受的載體和在所屬領域的技術人員的知識和專門技能範圍內的類似因素而改變。適當時，在任何個別情形中的「有效量」可由所屬領域的一般技術人員通過參考有關教科書和文獻和/或通過使用常規實驗來確定(例如參見 Gennaro 等人編輯，Remington' s The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，(2000), Lippincott Williams and Wilkins, B altimore MD ;Braunwald 等人編輯,Harrison' s Principles of Internal Medicine,第 15 版，(2001),McGraw Hi 11,NY ；Berkow等人編輯，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992) ,Merck ResearchLaboratories, Rahway NJ)。術語「預防」在本文中是指因為施用療法(例如預防或治療藥劑)或施用組合療法(例如預防或治療藥劑的組合)而在受試對象中對病症的發展或發生進行抑制，或對病症的一種或一種以上症狀的復發、發生或發展進行預防。「治療」意思是與宿主病症有關的症狀至少得到改善，其中改善是在廣義上使用，指的是與所治療病症有關的參數(例如症狀)的量值至少得到減小。因此，治療還包括以下情形，其中病理病症或至少與其有關的症狀得到完全抑制，例如被防止發生或被停止(例如被終止)，使得宿主不再被病症折磨或至少不再被表徵病症的症狀折磨。如本文所用的術語「受試對象」是指動物，優選哺乳動物且最優選人。本發明的另一個目的是一種用於在有需要的受試對象中增加被移植的細胞群體的免疫應答的方法，其包含對所述受試對象施用有效量的如上文所述的Trl細胞、休眠Trl細胞或活化Trl細胞被去除的細胞群體。
本發明的另一個目的是一種用於在有需要的受試對象中增加被移植的細胞群體的免疫應答的方法，其包含對所述受試對象施用有效量的如上文所述的休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體。因此，在被移植的細胞群體中不存在Trl細胞可以增加期望的免疫應答，因為沒有Trl細胞發揮其抑制活性。在一個實施方案中，所述方法是用於治療正接受癌症治療的受試對象。在一個實施方案中，被移植的細胞群體是抗原特異性效應T細胞群體。優選地，所述T細胞群體對腫瘤抗原(例如黑素瘤的MART-I (Melan A)，或黑素瘤、甲狀腺髓樣癌、小細胞肺癌、結腸和/或支氣管鱗狀細胞癌的MAGE 1、2、3)具有特異性。在所述實施方案中，打算移植的細胞群體中的休眠和/或活化Trl細胞在施予欲治療的患者之前在活體外被去除。調節性T細胞的去除已被證實可增強癌症患者中的疫苗介導型免疫性(Dannull等人，2005，115(12) :3623-3633)。因此，在本發明的另一個實施方案中，提出了 Trl細胞、休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的去除可用在細胞療法中，以用於治療所述Trl細胞可能對於治療有咅或不利的癌症或傳染病。舉例來說，在癌症治療中，在疫苗接種/免疫治療方案之前對Trl細胞進行短暫去除可以值得關注，所述短暫去除是通過根據本發明的去除方法用一種裝置在離體情況下對患者血液去除Trl細胞並將血液立刻再注入患者體內來實現的。因此，在所述實施方案中，休眠和/或活化Trl細胞從患者血液中的去除是通過一種裝置在離體情況下進行。本發明的另一個目的是一種用於活體外監測受試對象中的治療效果的方法，其包含在治療之前和之後鑑別生物樣品中的休眠和/或活化Trl細胞群體，其中治療之後休眠和/或活化Trl細胞群體的增加對應於對治療的響答。在所屬領域中眾所周知，在罹患自身免疫或炎症性疾病(例如多發性硬化、哮喘、尋常性天皰瘡和類風溼性關節炎)的受試對象中，Trl細胞數量減少。因此，在治療後可觀察到休眠和/或活化Trl細胞群體增加的受試對象為對治療有應答的受試對象。根據本發明，如上文所述對休眠和/或活化Trl細胞群體進行鑑別。在一個實施方案中，生物樣品在治療之前從受試對象獲得，並且在治療之後在不同時間(例如治療期間每周或每月)從受試對象獲得。


圖I :人類nTreg和Trl細胞上⑶25和⑶127的表面表達和Foxp3的細胞內表達。結果表示為通過CD3和CD28分子的聯合進行刺激(Act)或在休眠狀態(Res)下進行培養的4種不同Trl和nTreg細胞群體上的表達細胞的平均值％。圖2 :人類nTreg和Trl細胞上⑶62L的表面表達。結果表示為通過⑶3和⑶28分子的聯合進行刺激(Act)或在休眠狀態(Res)下進行培養的4種不同Trl和nTreg細胞群體上的表達細胞的平均值％。圖3 :⑷人類nTreg和Trl細胞上CD62L、CD25和CD127的表面表達。結果表示為通過⑶3和⑶28分子的聯合進行刺激(Act)或在休眠狀態(Res)下進行培養的Trl和nTreg細胞群體的平均螢光強度(MFI)。(B)顯示人類nTreg和Trl細胞上⑶62L、⑶25和CD 127的流式細胞術染色的代表性直方圖。 圖4 :小鼠活化nTreg和Trl細胞上⑶62L的表面表達。結果表示為表達細胞的
平均值％。圖5 (A)CD4+CD25_CD127lQ細胞上CD62L的表面表達。⑶結果表示為^4+0025-^1271°群體中的⑶62L表達細胞的百分比。實施例實驗程序Trl細胞分離如Brun 等人(International Immunopharmacology, 2009)所述對TrI 細胞進行分離。簡言之，通過Ficoll密度離心來分揀外周血細胞，並在存在食物抗原的情況下以每毫升2X IO6個細胞進行培養，以便允許食物抗原特異性Trl細胞進行增殖。在培養13天後，通過極限稀釋法在3周內對細胞進行克隆。然後使用⑶3/⑶28刺激劑和細胞因子(IL-2和IL-4)使生長的克隆進行擴增。通過細胞的細胞因子產生特徵來評估克隆的Trl細胞身份，所述細胞因子產生特徵顯示高IL-IO產量、中等IFN- Y產量和低IL-4產量(參見Brun等人，International Immunopharmacology, 2009)。為了產生小鼠 Trl 細胞,在 7 天期間在存在IL-10、抗IL-12和抗IL-4的情況下用抗⑶3和抗⑶28單克隆抗體活化脾細胞。獲得的細胞群體在經過照射的同源脾細胞和抗CD3抗體上在3周內進行克隆。評估生長的克隆的細胞因子分泌特徵。顯示高IL-IO產量、中等IFN-Y產量和低IL-4產量的克隆被鑑別為Trl細胞。CD4+T淋巴細胞和Treg細胞分離通過基於Ficoll-Plaque PLUS梯度(GE healthcare)的密度沉降,從來源於健康志願者的全血的血沉棕黃層製劑中分離PBMC。從梯度界面回收的細胞在RPMI 1640培養基中洗滌兩次，計數，並立即用於MACS和染色。簡言之，使用CD4分離試劑盒(Dynal)從總PBMC陰性地選擇⑶4+T細胞，得到純度為92-98%的⑶4+細胞群體。如Battaglia等人(Thejournal of Immunology, 2006)所述,對純化的⑶4+Treg細胞進行活體外擴增。簡言之,用被抗⑶3/抗 Q)28Ab 包被的磁珠(Dynabeads Q)3/Q)28T 細胞擴增物，Dynal Invitrogen)對經過分離的CD4+T細胞進行活化。細胞在存在X-vivo 15培養基的情況下培養，所述培養基補充有5%混合的AB型人血清(Sigma)、I %青黴素/鏈黴素以及IOOnM雷帕黴素。進行3輪刺激，每輪7天，且從第2輪刺激開始添加IL-2 (100U/ml)。流式細胞術研究為了對人細胞進行流式細胞術研究，使用以下抗體被PE結合的抗CD127 (來自Beckman Coulter 的克隆 R34. 34)、被 FITC 標記的抗 CD4Ab (來自 Becton Dickinson,克隆#RP4-T4)、被PeCy5標記的抗CD62L (來自Becton Dickinson的克隆Dreg56)和被別藻藍蛋白結合的抗⑶25 (來自Becton Dickinson的克隆M-A251)。根據製造商說明書,使用被PE結合的抗Foxp3Ab (來自BD的克隆259D/C7)和胞漿內染色試劑盒(BD)對人Foxp3進行胞漿內染色。對於小鼠細胞的流式細胞術研究來說，使用的抗體為被PECy7結合的抗CD4(克隆RM4-15)、被APC結合的抗CD25 (克隆PC61)、被PE結合的FoxP3 (克隆MF23)和被PE結合的抗CD62L(克隆Mell4)。所有的抗小鼠抗體都購自Becton Dickinson。基因表達研究如Dayem等人(Comp Funct Genom, 2003)所述使用DNA微陣列分析來進行基因表達研究。為此，使細胞樣品裂解，並用Trizol試劑(Invitrogen)對RNA進行穩定。用購自Qiagen的RNeasy微型試劑盒純化RNA,並使用購自Ambion的DNAse (無DNA)去除殘餘量的剩餘 DNA。用 NanoDrop (Thermo)和 Agilent Bioanalyzer 2100 確定所分離的 RNA 的濃度和質量。使 RNA 雜交到人 Affymetrix 微陣列(Affymetrix-HuGene_l_0-st-vl)上。結果首先通過⑶25分子的組成型表達來描述天然⑶4+調節細胞(nTreg細胞)。此外，CD25也是所有類型的T細胞的活化標誌物，因此無法區別nTreg細胞與活化的常規T細胞(ConvT細胞)。同樣的規則也適用於主調節基因Foxp3的表達，Foxp3的表達在nTreg細胞上是組成型的並且在活化convT細胞上被上調。在發現Foxp3和⑶25作為Treg細胞的組成型標誌物之後的幾年裡，分子⑶127已經顯示在Treg細胞表面上組成型地低，但在所有常規T細胞的表面上組成型地高度表達，這提供了一種在這兩種群體被活化時仍對其進行區分的方法。O CD3+CD4+Foxp3+CD25+CDl271。= nTreg 細胞(休眠和活化)O CD3+CD4+Foxp3+CD25+CD 127hi =活化 conv T 細胞O CD3+CD4+Foxp3XD25TD 127hi =休眠 conv T 細胞除nTreg細胞外，免疫耐受中還涉及另一種充分研究的調節細胞群體。這種稱為Trl淋巴細胞的群體的表型也通過上述分子的表達來表徵。結果如下O CD3+CD4+FOXP3+CD25+CD1271。=活化 Trl 細胞O CD3+CD4+FOXP3XD25TD1271。=休眠 Trl 細胞這些結果證實休眠Trl細胞可通過⑶25和⑶127的表達或通過Foxp3、⑶25和⑶127的表達與nTreg細胞加以區分。然而，活化Trl細胞顯示與nTreg細胞相同的表型(圖 I)。為了測試另一種表面分子是否可以區分這兩種群體，我們測試了人nTreg和Trl細胞上的表達⑶62L的細胞的數目。大量的休眠和活化Treg細胞都表達⑶62L，而只有少量的休眠或活化Trl細胞表達⑶62L(圖2)。重要的是，⑶62L、⑶127和⑶25染色的平均螢光強度(MFI)顯示，如先前所報導，nTreg組成型地表達⑶62L。相比之下，Trl細胞中組成型地缺乏⑶62L(圖3)。因此，當納入以上標誌物小組中時，⑶62L表型可區別活化Trl細胞與nTreg細胞。對於所有四個細胞群體，⑶127染色的MFI都較低。⑶25染色的MFI在nTreg細胞上組成型地高，在活化Trl細胞上較高，且在休眠Trl細胞上被下調為低MFI。這一觀察也通過RT-PCR實驗得到證實(圖4)。O α)3+αΜ+Ροχρ3Χ025Τ01271α)62 7。=休眠 Trl 細胞O CDS+OM+FoxpS+CDSS+CDUTkCDeSL1。=活化 Trl 細胞O CD3+CD4+Foxp3+CD25+CD I27lt5CD62Lhi = nTreg 細胞圖4顯示表面⑶62L在區別活化Trl細胞與nTreg細胞方面的作用也適用於來源於小鼠的細胞群體。用經過螢光標記的⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L特異性抗體對來自兩個健康人類個 體的外周血白細胞進行染色。基於通過⑶4+⑶25101271°表型表徵的細胞亞組來確定表達⑶62L的細胞的百分比。圖5A和5B顯示，在CD4+CD25TD1271。群體中，標誌物CD62L允許區分CD62L1。群體與⑶62Lhi群體。因此，標誌物⑶4、⑶25和⑶127不足以辨別細胞群體中的休眠Trl細胞。總之，表I顯示如何依據所用的標誌物來辨別每種群體。
I休眠常規I活化常規I休眠和活I休眠Trl I活化Trl
__T細胞 T細胞化nTreg 細胞·__細月包_
CD4+++++
CD25-++-+
CD127++SSS
CD62L+-S^表IFoxp 3也可以任選地用於辨別細胞群體
休眠常規活化常規休眠和活休眠Trl 活化Trl T細胞 T細胞化nTreg 細胞細胞
FOXP3-++-+表權利要求
1.一種鑑別休眠Trl細胞群體的方法，其包括檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達，其中表達 -CD4 和 -低水平的CD 127， -低水平的⑶62L， 且不表達-CD25, 的細胞是休眠Trl細胞。
2.一種鑑別活化Trl細胞群體的方法，其包括檢測細胞群體上的⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L標誌物的細胞表面表達，其中表達-CD4，-CD25, -低水平的⑶127，和 -低水平的⑶62L， 的細胞是活化Trl細胞。
3.一種用於分離休眠Trl細胞群體或活化Trl細胞群體的方法,其包括 -根據權利要求I或2鑑別休眠Trl細胞群體或活化Trl細胞群體，和 -分離所述群體。
4.一種分離的休眠Trl細胞群體或活化Trl細胞群體，其是通過根據權利要求3所述的方法獲得的。
5.一種用於富集細胞群體中的休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的方法，其包括 -根據權利要求I或2鑑別休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞， -選擇所述細胞， 從而獲得休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞被富集的細胞群體，其中休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的百分比是富集之前休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的百分比的至少兩倍。
6.一種富集的休眠Trl細胞群體，其是根據權利要求5獲得的。
7.一種用於去除細胞群體中的休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的方法，其包括 -根據權利要求I鑑別休眠Trl細胞和/或根據權利要求2鑑別活化Trl細胞， -去除所述細胞， 從而獲得休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體，其中休眠Trl細胞和/或活化Trl的百分比是去除之前休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的百分比的至多O. 75倍。
8.—種休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體，其是根據權利要求6獲得的。
9.一種用於鑑別或分離休眠Trl細胞群體和/或活化Trl細胞群體的試劑盒，其包含用於檢測⑶4、⑶25、⑶127和⑶62L的細胞表面表達的工具。
10.一種醫藥組合物，其包含根據權利要求4所述的分離的休眠Trl細胞群體和/或活化Trl細胞群體,或根據權利要求6所述的富集的休眠Trl細胞群體和/或活化Trl細胞群體，或根據權利要求13所述的休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞被去除的細胞群體。
11.根據權利要求10所述的包含休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的醫藥組合物，其用於預防或治療與感染或移植或過敏性疾病有關的免疫應答，或用於預防或治療炎症性病症或自身免疫病症。
12.根據權利要求10所述的包含去除了休眠Trl細胞和/或活化Trl細胞的細胞群體的醫藥組合物，其用於在有需要的受試對象中治療癌症。
13.根據權利要求12所述的醫藥組合物，其中所述細胞群體是腫瘤抗原特異性T細胞群體。
14.一種醫藥組合物，其包含休眠Trl細胞與活化Trl細胞的混合物，其中所述混合物是通過體外擴增根據權利要求3獲得的分離的休眠Trl細胞群體而獲得的。
15.根據權利要求14所述的醫藥組合物，其用於治療與感染或移植或過敏性疾病有關的免疫應答，或用於預防或治療炎症性病症或自身免疫病症。
16.一種用於體外監測受試對象中的治療效果的方法，其包括根據權利要求I所述的方法在治療之前和之後鑑別從所述受試對象獲得的生物樣品中的休眠Trl細胞群體和/或活化Trl細胞群體，其中治療之後休眠Trl細胞群體和/或活化Trl細胞群體的增加對應於對治療的響答。
全文摘要
本發明涉及用於分離Tr1細胞、休眠Tr1細胞和/或活化Tr1細胞的方法，用於在細胞群體中富集或去除Tr1細胞、休眠Tr1細胞和/或活化Tr1細胞的方法，以及用於治療慢性炎症性疾病、自身免疫疾病、過敏性疾病、癌症和器官移植病症的方法和試劑盒。
文檔編號C12N5/0783GK102947702SQ201180029496
公開日2013年2月27日 申請日期2011年4月15日 優先權日2010年4月15日
發明者阿爾諾·福薩特, 瓦萊麗·布魯恩, 納薩莉·貝爾蒙特, 埃爾韋·巴斯蒂安, 布裡吉特·誇坦尼恩斯 申請人:特克賽爾公司