與大口黑鱸孵化率相關的分子標記及其應用的製作方法
2023-05-09 12:21:31 1
專利名稱：與大口黑鱸孵化率相關的分子標記及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於動物基因工程技術領域。具體涉及一種與大口黑鱸孵化率相關的分子標記及其在輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本上的應用。
背景技術：
大口黑S盧{Microp terus salmoides ),俗名加州S盧,原產於美國密西西比河流域，屬廣溫性魚類，具有生長快、病害少、耐低溫、肉質鮮美和容易起捕等特點，是我國重要的淡水養殖經濟品種之一。目前我國養殖的大口黑鱸是由野生引進種家養馴化而成的，且養殖20多年來，由於不注重親本留種需遵守的操作規程，缺乏定向人工選育，致使大口黑鱸種質的質量急劇下降，主要表現在餌料轉化率低、個體生長緩慢、苗種孵化率低等，大口黑鱸苗種的質量直接關係到大口黑鱸養殖經濟效益，在一定程度上影響大口黑鱸養殖業的健康穩定發展。魚苗孵化率高低是直接影響育苗場魚苗產量的一個重要因素。提高魚苗的孵化率在一定程度上降低孵化生產成本，提高養殖經濟效益。大口黑鱸魚卵的孵化率受繁殖親魚質量及外部環境條件等多種因素影響，其中提高大口黑鱸繁殖親本的質量來提高大口黑鱸魚苗孵化率是可控的重要方法之一。普通生產上提高魚苗孵化率往往是通過挑選個體大、身體健壯的成魚作為繁殖用親本，在專池中進行強化培育，採用投餵優質飼料，適時換水等手段促進親魚成熟，這種傳統方法僅從表型上去判斷親本的質量往往達不到理想的結果，無法從分子水平上剔除具有基因缺陷的親本，從根本上來保障親本的質量。隨著分子生物學和遺傳學的發展，DNA分子標記因其具有多態性高、遺傳穩定、檢測方便等優點日益成為遺傳育種研究中首選的遺傳標記。若將這些遺傳標記與生產性狀相關聯在一起，即可實現從DNA水平上進行選擇育種，克服了傳統方法受人為因素影響大的不足，提高了選擇的準確性。但是，現在仍未發現與大 口黑鱸孵化相關的分子標記，影響了大口黑鱸高孵化率親本的篩選效果。促生長激素釋放激素(growth hormone releasing hormone,GHRH)是由下丘腦分泌的一種胰高血糖素超家族多肽激素，其主要生物學功能是刺激垂體細胞合成、分泌生長激素。此外，其在胚胎期對細胞增殖分化，腦垂體形成等也有重要作用(Mayo et al.，1985 ;Mayo et al., 2000 ；Billestrup et al.,1986)。研究表明，GHRH及其受體的自然缺失或異常會導致諸如侏儒症，巨人症之類的現象(Desai et al.,2005 ；Sanno et al.，1997);通過外源適度增加GHRH的含量能夠促進動物的生長(Zhang et al.，2008)。由於GHRH與動物的生長性狀具有緊密的聯繫，使之成為理想的分子標記育種候選基因。
發明內容
本發明的目的在於提供一種與大口黑鱸孵化率相關的分子標記及其在輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本上的應用。本發明所採取的技術方案是:大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A，其位於大口黑鱸GHRH基因啟動子序列上的第97 162bp0所述大口黑鱸GHRH基因1啟動子序列如SEQ ID NO:1所示，其第97 162bp上的大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A的序列如SEQ ID N0:2所示。大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A作為分子標記在輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本上的應用。一種輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的方法，包括檢測大口黑鱸樣品的基因組DNA，篩選含有隱性缺失致死基因片段A的純合體即可。具體包括如下步驟:
1)根據權利要求1所述基因片段A的5』和3』側翼序列，設計併合成引物；
2)利用步驟I)的引物對大口黑鱸樣品的基因組DNA進行擴增；
3)根據擴增結果篩選親本:基因組DNA中含有基因片段A的純合體即為高孵化率大口黑鱸親本。作為其中一個優選方案，上述方法所用引物的序列如下所示:
Pl:GGCCCGGGCTGGTCTGTTAAATACA (SEQ ID NO:3)
P2:GCGCAACACAAGAGCACATTGCTT (SEQ ID NO:4)
當PCR產物為316bp的單一條帶時，該樣品為含有基因片段A的純合體，當PCR產物出現316bp和250bp兩種DNA條帶時，該樣品為含有基因片段A的雜合體。一種用於輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的PCR引物，是根據大口黑鱸GHRH基因啟動子序列(SEQ ID NO:1)第97 162bp上的大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A (SEQID N0:2)的5』和3』側翼序列設計併合成，其特徵在於，當大口黑鱸樣品基因型為含有基因片段A的純合體時，該引物的PCR產物為單一條帶；當樣品基因型為雜合體時，則該引物的PCR產物有兩條帶，其中一條比另一條長66bp。作為其中一個優選方案，所述引物的序列如下所示:
Pl:GGCCCGGGCTGGTCTGTTAAATACA (SEQ ID N0:3)；
P2:GCGCAACACAAGAGCACATTGCTT (SEQ ID NO:4)。一種用於輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的試劑盒，其含有上述用於輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的PCR引物。本發明的有益效果是:
本發明篩選得到了位於大口黑鱸GHRH基因啟動子序列上的66bp隱性致死缺失基因片段。將GHRH啟動子具這66bp序列的基因型命名為A，將缺失突變的GHRH啟動子基因型命名為B。根據大口黑鱸GHRH啟動子序列設計引物，利用PCR擴增及凝膠電泳技術鑑定親本的基因型，將生產中AB基因型大口黑鱸親本去除，保留AA基因型大口黑鱸親本，以提高大口黑鱸卵的相對孵化率。本方法克服了傳統方法受人為因素影響大的不利因素，提高了親本選擇的準確性，且具有操作簡單、檢測快速、檢測成本低等優點，便於廣泛推廣使用。
圖1為大口黑鱸促生長激素釋放激素基因啟動子序列標示圖(下劃線為檢測引物設計區域，加框為B基因型缺失的序列)；圖2為GHRH基因在不同基因型個體中的表達水平。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。實施例1插入/缺失位點的篩查 1、實驗魚
2008年11月，從廣東省佛山市南海區九江鎮大口黑鱸養殖基地隨機採集樣本170尾用於基因突變位點篩選及生長性狀關聯分析。每尾大口黑鱸均測量體重，體長和體高等生長數據，同時尾靜脈活體取血，抗凝劑(Ara)與血液體積比為6:1，用Blood & Cell CultureDNA Kit (Clontech)提取 DNA。2、GHRH啟動子序列的擴增
將大口黑S盧促生長激素釋放激素(growth hormone releasing hormone, GHRH)基因cDNA序列(GenBank登錄號:HQ640678)與目前已知的魚類GHRH基因全序列比較，設計引物Pl 和 P2 (表 I),用於擴增 GHRH 的啟動子。按照 GenomeWalker Universal Kit (Clontech)試劑盒的操作，以本實驗室保存的大口黑鱸基因組DNA酶切連接文庫為模板(Li et al.，2008, Cloning and characterization of largemouth bass (Micropterus salmoides)myostatin encoding gene and its promoter),使用試劑盒提供的引物API與Pl引物進行 PCR 擴增，94°C，3 min，一個循環；94°C，30 s ；67°C,3 min，5 個循環；94°C，30 s ；63°C,30 s ；72°C,3 min，27個循環；72°C，5 min。取該PCR產物稀釋100倍後利用AP2和P2進行巢式擴增，程序同上。擴增產物經純化，克隆後送上海英俊生物技術有限公司測序。所得GHRH啟動子序列如SEQ ID NO:1所示。
權利要求
1.大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A，其位於大口黑鱸GHRH基因啟動子序列上的第97 162bp。
2.根據權利要求1所述的基因片段A，其特徵在於，所述大口黑鱸GHRH基因啟動子序列如SEQ ID NO:1所示，其第97 162bp上的大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A的序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.權利要求1所述的基因片段A作為分子標記在輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本上的應用。
4.一種輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的方法，包括檢測大口黑鱸樣品的基因組DNA，篩選含有權利要求1所述隱性缺失致死基因片段A的純合體即可。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，包括如下步驟: 1)根據權利要求1所述基因片段A的5』和3』側翼序列，設計併合成引物； 2)利用步驟I)的引物對大口黑鱸樣品的基因組DNA進行擴增； 3)根據擴增結果篩選親本:基因組DNA中含有基因片段A的純合體即為高孵化率大口黑鱸親本。
6.根據權利要求 5所述的方法，其特徵在於，所用引物的序列如下所示:Pl:GGCCCGGGCTGGTCTGTTAAATACA (SEQ ID NO:3)P2:GCGCAACACAAGAGCACATTGCTT (SEQ ID NO:4) 當PCR產物為316bp的單一條帶時，該樣品為含有基因片段A的純合體，當PCR產物出現316bp和250bp兩種DNA條帶時，該樣品為含有基因片段A的雜合體。
7.一種用於輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的PCR引物，是根據大口黑鱸GHRH基因啟動子序列(SEQ ID NO:1)第97 162bp上的大口黑鱸隱性缺失致死基因片段A (SEQ IDN0:2)的5』和3』側翼序列設計併合成，其特徵在於，當大口黑鱸樣品基因型為含有基因片段A的純合體時，該引物的PCR產物為單一條帶；當樣品基因型為雜合體時，則該引物的PCR產物有兩條帶，其中一條比另一條長66bp。
8.根據權利要求8所述的PCR引物，其特徵在於，所述引物的序列如下所示:Pl:GGCCCGGGCTGGTCTGTTAAATACA (SEQ ID N0:3)；P2:GCGCAACACAAGAGCACATTGCTT (SEQ ID NO:4)。
9.一種用於輔助篩選高孵化率大口黑鱸親本的試劑盒，其包括權利要求7或8所述的PCR引物。
全文摘要
本發明公開了與大口黑鱸孵化率相關的分子標記及其應用。所述與大口黑鱸孵化率相關的分子標記位於大口黑鱸GHRH基因啟動子序列上的第97～163bp。將GHRH啟動子具這66bp序列的基因型命名為A，將缺失突變的GHRH啟動子基因型命名為B。根據大口黑鱸GHRH啟動子序列設計引物，利用分子克隆方法鑑定親本的基因型，將生產中AB基因型大口黑鱸親本去除，保留AA基因型大口黑鱸親本，以提高親本的相對孵化率。本方法與傳統的方法相比，具有目的性強，作用效果直接的優點。且操作簡單、檢測快速、檢測成本低，便於廣泛推廣使用。
文檔編號C12Q1/68GK103103183SQ20131002607
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者李勝傑, 白俊傑, 韓林強, 馬冬梅, 葉星, 樊佳佳, 姜鵬, 全迎春, 於凌雲 申請人:中國水產科學研究院珠江水產研究所