通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法
2023-05-09 03:34:51 2
通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法
【專利摘要】本發明提供一種採用分批濃縮模式，通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法，所述模式具有第一恆定進料速率步驟和第二受控進料速率步驟。
【專利說明】通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物科學領域，更具體地，本發明涉及抗體製備領域。特別是，本發明涉及一種通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法。用於本發明的方法能夠使抗體治療在環境溫度下達到高濃度製劑，例如超過100 g/L，優選超過200 g/L，特別優選超過250 g/L。
【背景技術】
[0002]持續需要用於皮下給予的抗體治療的高度濃縮的低體積製劑，尤其是在慢性病治療領域，通過提供門診治療，以改進患者方便性和順從性。
[0003]對於抗體藥品生產，超濾/滲濾(UF/DF)通常是最終的過程步驟。超濾為基於膜的分離過程，其基於尺寸分離溶液中的分子。滲濾為一種特定類型的超濾，其中將含水緩衝液加入到截留物質中。在該步驟中，將純化的藥品濃縮，並且經緩衝液更換(exchange)為藥品配製所需的蛋白質濃度和賦形劑組成。
[0004]用於超濾/滲濾(UF/DF)過程行業的主導技術為切向流過濾(TFF)形式(一般來說，參見Shiloach J.等人，1988,Van Reis R.等人,2001)。在該技術中，在壓力下,蛋白質溶液切向再循環至超濾膜。該TFF方法對於低至中等濃度下的藥品良好地起作用，並且在大多數情況下，對於一種抗體的UF/DF過程高度適應於另一抗體，具有極小變化。然而，在具有高蛋白質濃度的情況下，在過程性能方面存在一系列技術挑戰(一般來說，參見ShireSJ.等人，2004，Luo R.等人，2006，Shire SJ.，2009)。
[0005]通過TFF技術達到高濃度製劑可能困難，因為，高度濃縮的蛋白質溶液可導致由降低的通量所致的有限傳質和最終的膜汙染(參見例如，Suki A.等人，1984，1986，KimKJ.等人，1992)。雖然可通過提高膜表面積或更換膜而克服這一點，但是可導致較低的收率。另一個限制是高粘度可導致高進料壓力，在過程期間超過膜完整性的上限(參見例如，Turker M.等人，1987，Liu J.等人，2005)。雖然實施適當的製劑設計(例如提高離子強度或加入特定的化合物)可幫助降低粘度(參見例如，Liu J.等人，2006)，但是降低粘度同時確保穩定的製劑組合物可能是具有挑戰性的實踐。在需要粘度更大降低的情況下，通過在升高的溫度下處理可解決這一點(參見例如,Winter C.，2009)。然而，在這種情況下，由於長時間暴露於較高的溫度，可能損害蛋白質穩定性。因此，本發明要解決的問題是，提供一種通過操控其他處理參數的新處理方法以實現高蛋白質濃度。
[0006]引用列舉 專利文獻
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[0018]發明概述
在生產規模下，用於濃縮蛋白質的行業標準技術是通過切向流超濾。具有高最終濃度的產物的關鍵挑戰是防止膜汙染和克服高進料壓力。
[0019]總的來說，本公開描述成功濃縮蛋白質(例如抗體製備物、含有所述製備物的藥物製劑)的過程參數的具體操控及其在人類治療或動物治療中的用途。
[0020] 在實施方案中，本公開提供一種方法，其中進料流速保持在高流速直至優化的蛋白質濃度，隨後降低至較低的值以繼續進一步濃縮。例如，在等於或大於200 LMH的進料流速下進行濃縮，直至將截留物質溶液濃縮至蛋白質濃度大於200 g/L，其中進料壓力累積至超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%，隨後在等於或小於120 LMH的進料流速下繼續進一步濃縮。在操作限度內可達到的蛋白質濃度高於常規過程，其包含具有恆定進料流速的一步或包含對早期轉變具有逐步降低(step-down)進料流量控制的兩步。[0021]在實施方案中，本公開還提供了一種更優選的方法，其中進料流速保持儘可能高，直至濃縮過程結束。例如，進料流速採用一定的方式自動化控制，以在恆定進料流速下，一旦進料壓力達到超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%，保持進料壓力在超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%內。
[0022]在實施方案中，本公開還提供在濃縮過程的中間插入的循環步驟的有效性。例如，在恆定進料流速下，一旦進料壓力達到超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%,插入在10-80 LMH的進料流速下的20分鐘循環。該循環步驟可減輕在隨後的超濾過程期間進料壓力累積。
[0023]概括地說，本發明的一個目標是提供以下[1]_[33]。
[0024][I] 一種通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟:
1)調節進料流速，使得施用於超濾膜的進料壓力的值提高至超濾膜的指定最大進料壓力的85-100% ;和
2)降低進料流速，以保持或降低在步驟(I)之後施用於超濾膜的進料壓力的值。
[0025][2] [I]的方法，其中抗體製備物在環境溫度下處理。
[0026][3] [I]的方法，其中抗體製備物在10_30°C溫度下處理。
[0027][4] [I]的方法，其中抗體製備物在15_30°C溫度下處理。
[0028][5] [I]的方法，其中所述高度濃縮的抗體具有超過100 g/L的高濃度或超過2mPa.s的粘度。
[0029][6] [I]的方法，其中所述高度濃縮的抗體具有超過200 g/L的高濃度或超過10mPa.s的粘度。
[0030][7] [I]的方法，其中所述高度濃縮的抗體具有超過250 g/L的高濃度或超過40mPa.s的粘度。
[0031][8] [I]的方法，其中在步驟⑴中所述進料流速保持在200 LMH (L/m2/h)或更聞。
[0032][9] [I]的方法，其中在步驟⑴中所述進料流速保持在250 LMH (L/m2/h)或更聞。
[0033][10] [I]、[8]和[9]的方法，其中在步驟(I)中所述進料流速保持在恆定速率。
[0034][11] [I]的方法，其中在步驟(I)中施用於超濾膜的進料壓力的最大值為2.0巴-4.0巴。
[0035][12] [I]的方法，其中在步驟(I)中施用於超濾膜的進料壓力的最大值為3.5巴。
[0036][13] [I]的方法，其中在步驟⑴中施用於超濾膜的進料壓力的最大值為超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%。
[0037][14] [I]的方法，其中當將截留物質溶液濃縮至大於200 g/L的蛋白質濃度時，步驟⑴轉變為步驟⑵。
[0038][15] [I]的方法，其中當將截留物質溶液濃縮至等於或大於220 g/L的蛋白質濃度時，步驟⑴轉變為步驟(2)。
[0039][16] [I]的方法，其中當將截留物質溶液濃縮至等於240 g/L的蛋白質濃度時，步驟⑴轉變為步驟⑵。[0040][17] [13]的方法，其中在步驟(2)中在進料壓力的值降低後，所述進料流速保持在恆定速率。
[0041][18] [13]或[17]的方法，其中在步驟(2)中在進料壓力的值降低後，所述進料流速保持在120 LMH (L/m2/h)或更低。
[0042][19] [13]或[17]的方法，其中在步驟(2)中在進料壓力的值降低後，所述進料流速保持在80 LMH (L/m2/h)或更低。
[0043][20] [I]的方法，其中在步驟(2)中施用於超濾膜的進料壓力的值保持在恆定值。
[0044][21] [I]的方法,其中通過緩慢降低(ramp down)進料流速,在步驟⑵中施用於超濾膜的進料壓力的值保持在超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%內。
[0045][22] [20]或[21]的方法，其中所述進料流速採用一定的方式自動化調節，以通過進料壓力和進料流速之間的反饋控制，保持進料壓力在超濾膜的指定最大進料壓力的85-100% 內。
[0046][23] [I]的方法，所述方法在步驟(I)和步驟(2)之間還包括以下步驟:
3)使抗體製備物再循環通過膜，其中滲透物閥關閉。
[0047][24] [23]方法，其中使抗體製備物再循環，其中截留物質壓力控制閥完全打開。
[0048][25] [23]方法，其中在步驟(3)中進料流速保持在5_120 LMH (L/m2/h)的恆定流速。
[0049][26] [23]方法，其中在步驟(3)中進料流速保持在10_80 LMH (L/m2/h)的恆定流速。
[0050][27] [I]的方法，其中抗體製備物的緩衝組合物為10-30 mmol/L組氨酸。
[0051][28] [I]的方法，其中抗體製備物的緩衝組合物為20 mmol/L組氨酸。
[0052][29] [I]的方法，其中抗體製備物的pH為pH 3.Ο-pH 10.0。
[0053][30] [I]的方法，其中抗體製備物的pH為pH 5.5-pH 6.5。
[0054][31] [I]的方法，其中抗體製備物的pH為pH 6.0。
[0055][32] [I]的方法，其中所述超濾膜的分子量截止值為50 kDa或更少。
[0056][33] [I]的方法，其中所述超濾膜的分子量截止值為30 kDa或更少。
[0057][34] [I]的方法，其中所述組合物包含高度濃縮的抗人白介素-6受體單克隆抗體。
[0058][35] [34]的方法,其中所述組合物包含高度濃縮的託珠單抗(tocilizumab)。
[0059][36] 一種液體組合物，所述組合物包含通過[I]的方法製備的高度濃縮的抗體。
[0060][37] 一種藥物液體組合物，所述組合物包含通過[I]的方法製備的高度濃縮的抗體和藥學上可接受的載體。
[0061][38] 一種通過超濾製備包含高度濃縮的蛋白質的組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟:
1)調節進料流速，使得施用於超濾膜的進料壓力的值提高至超濾膜的指定最大進料壓力的85-100% ;和
2)降低進料流速，以保持或降低在步驟(I)之後施用於超濾膜的進料壓力的值。
[0062]還應理解的是，前述發明概述和以下詳細說明是舉例說明的實施方案，而不是限制本發明或本發明的其它備選實施方案。當結合附圖和實施例閱讀以下詳細說明時，本發明的其它目的和特徵將更充分顯而易見。特別是，雖然本文參考多個具體實施方案描述了本發明，但應認識到，該描述為舉例說明本發明，並且不應看作是限制本發明。在不偏離本發明的精神和範圍下，本領域技術人員可以想到各種修改和應用，如在所附權利要求書中所描述的。同樣，由本概述和以下描述的某些實施方案，本發明的其它目的、特徵、益處和優點顯而易見，並且對於本領域技術人員來說將容易顯而易見。單獨地或考慮本文引用的參考文獻，結合所附實施例、數據、圖和由其引伸的所有合理的推斷，根據上文，這些目的、特徵、益處和優點將顯而易見。
[0063]附圖簡述
考慮以下附圖簡述和發明詳述及其優選的實施方案，本發明的各方面和應用對於技術人員來說將變得顯而易見，其中:
[圖1]圖1顯示在本公開的實施方案中，用於UF/DF過程的裝置。
[0064][圖2]圖2顯示在實驗室規模，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。在整個過程期間，進料流速設定為250 LMH (L/m2/h)的恆定速率。
[0065][圖3]圖3顯示在實驗室規模，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。當截留物質體積達到對應於100 g/L的蛋白質濃度值時，進料流速降低至 80 LMH。
[0066][圖4]圖4顯示在實驗室規模，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。當截留物質體積達到對應於200 g/L的蛋白質濃度值時，進料流速降低至 80 LMH。
[0067][圖5]圖5顯示在實驗室規模，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。當進料壓力超過3.5巴(其對應於240 g/L的蛋白質濃度)時，進料流速降低至80 LMH。
[0068][圖6]圖6顯示在實驗室規模，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。在250 LMH的恆定進料流速下，一旦進料壓力超過3.5巴，則進料流速設定為採用一定的方式自動化流動控制，以保持進料壓力為3.5巴。當進料流速降低至80 LMH時，終止操作。
[0069][圖7]圖7顯示在實驗室規模，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。一旦進料壓力超過3.5巴，流動路徑轉換為循環模式。在80 LMH的恆定進料流速下循環20分鐘後，在相同的進料流速下重新開始超濾。
[0070][圖8]圖8顯示在實驗室規模，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。在10 LMH的恆定進料流速下進行循環。
[0071][圖9]圖9匯總在本公開的實施方案中，在實驗室規模的回收池(recoveredpool)的蛋白質濃度。
[0072][圖10]圖10顯示在本公開的實施方案中，濃縮的人源化IL-6R單克隆抗體的粘度概況。
[0073][圖11]圖11顯示在中試規模，在UF1/DF/UF2步驟中，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP和截留物質體積隨著時間測量的過程值。
[0074][圖12]圖12顯示在中試規模，在UF3/UF4步驟中，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP和截留物質體積隨著時間測量的過程值。
[0075][圖13]圖13顯示在中試規模，在UF1/DF/UF2步驟中，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP和截留物質體積隨著時間測量的過程值。
[0076][圖14]圖14顯示在中試規模，在UF3/UF4步驟中，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP和截留物質體積隨著時間測量的過程值。
[0077][圖15]圖15顯示在生產規模，在UF1/DF/UF2步驟中，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP和截留物質體積隨著時間測量的過程值。
[0078][圖16]圖16顯示在生產規模，在UF3/UF4步驟中，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP和截留物質體積隨著時間測量的過程值。
[0079][圖17]圖17顯示在生產規模，在UF1/DF/UF2步驟中，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP和截留物質體積隨著時間測量的過程值。
[0080][圖18]圖18顯示在生產規模，在UF3/UF4步驟中，進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP和截留物質體積隨著時間測量的過程值。
[0081][圖19]圖19顯示進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。進料流速在250 LMH (L/m2/h)的恆定速率下操作，當截留物質體積達到對應於60 g/L的蛋白質濃度值時，隨後降低至80 LMH。
[0082][圖20]圖20顯示進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。當進料壓力超過3.5巴時，進料流速降低至80 LMH。此時截留物質體積值對應於145g/L的蛋白質濃度。
[0083][圖21]圖21顯示進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。在250 LMH的恆定進料流速下，一旦進料壓力超過3.5巴，則進料流速設定為採用一定的方式自動化流動控制，以保持進料壓力為3.5巴。當進料流速降低至80 LMH時，終止操作。
[0084]實施方案的描述
雖然與本文描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料可用於本發明實施方案的實踐或測試，但現在描述優選的方法。然而，在描述本發明的方法之前，應理解的是本發明不局限於本文描述的具體的大小、形狀、尺寸、材料、方法、方案等，由於這些可根據常規實驗和優化而變。還應理解的是，用於本說明書的術語僅為了描述具體的形式或實施方案的目的，並且不旨在限制本發明的範圍，本發明的範圍僅由所附權利要求書限定。
[0085]在本說明書中提及的每一個出版物、專利或專利申請的公開內容通過引用而全文結合到本文中。然而，絕不應解釋為承認，由於在先發明，本發明沒有資格早於這些公開內容。
[0086]除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義。在衝突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實施例僅為說明性的並且不旨在限制性的。
[0087]本發明涉及一種通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法。
[0088]本發明包含一種通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法，其中進料流速和施用於超濾膜的進料壓力可變並且在過濾過程期間變化。
[0089]以下闡述本發明的特別優選的實施方案。[0090]—種通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟:
1)調節進料流速，使得施用於超濾膜的進料壓力的值提高至超濾膜的指定最大進料壓力的85-100% ;和
2)降低進料流速，以保持或降低在步驟(I)之後施用於超濾膜的進料壓力的值。
[0091]在本發明內使用的術語"超濾"表示基於膜的分離過程，其基於尺寸分離溶液中的分子。術語"切向流過濾(TFF)"表示特定的過濾方法，其中流體相對於膜切向流動。在壓力下，通過沿著超濾膜的表面(即，與之切向)流動，濃縮含有蛋白質分子的溶液。超濾膜的孔尺寸具有某一截止值。在一個實施方案中，截止值為50 kDa或更少，優選30kD或更少。
[0092]術語〃進料流動〃表示流體從進料泵到膜的流動。術語〃進料流速〃表示溶液到膜的流動的體積速率。進料流速通常按每單位時間的體積給出，如升/分鐘，並且按每單位膜面積每單位時間的體積歸一化，如l/m2/h (LMH)。術語〃通量〃表示按每單位膜面積每單位時間的體積歸一化的通過膜的滲透物流，如l/m2/h (LMH)。
[0093]術語〃進料壓力〃表示施用於超濾膜入口的壓力。表述〃最大進料壓力〃表示由銷售商指定作為超濾膜的產品規格的進料壓力的可接受的最大值。術語"截留物質壓力"表示施用於超濾膜出口的壓力。術語"滲透物壓力"表示施用於超濾膜的滲透物側的壓力。術語〃跨膜壓力(TMP)"表示驅動流體穿過超濾膜而濾出的壓力。TMP的值可如下計算:
TMP= (P進料+P截麵質)/2-P滲透物
在TFF設備中的滲透物側打開的情況下，TMP為進料壓力和截留物質壓力的平均值。壓力值通常按〃巴〃或〃MPa〃或〃psi〃給出。
[0094]術語〃抗體〃指特異識別抗原的蛋白質。抗體可為單克隆或多克隆的。抗體可以多種形式存在，包括，例如，Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(scFv)或雙抗體。此外，抗體的任何片段或修飾(例如，嵌合抗體、人源化抗體等)可用於本發明的方法。製備這些種類的抗體的方法為本領域公知的，並且任何方法可用於本發明，以製備所述抗體及其片段。
[0095]用於本發明的單克隆抗體不僅包括衍生自動物(例如人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔子、綿羊、駱駝和猴子)的那些，而且包括人工修飾的基因重組抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體和雙特異性抗體。本發明的抗體還包括由人工修飾抗體恆定區得到的基因重組抗體，以改變抗體分子的物理性質(特別是，改變等電點(PD、改進對Fe受體的親和力等)，用於改進血液持續性和體內藥代動力學的目的。
[0096]用於本發明的免疫球蛋白類抗體沒有特別的限制；並且該類別可為任何類別，包括 IgG，例如 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4、IgA、IgD、IgE 和 IgM0 然而，優選 IgG 和 IgM0
[0097]用於本發明的抗體包括但不限於抗組織因子抗體、抗IL-6受體抗體、抗IL-6抗體、抗HMl.24抗原單克隆抗體、抗甲狀旁腺激素-相關的肽抗體(抗PTHrP抗體)、抗磷脂醯肌醇聚糖-3抗體、抗神經節苷脂GM3抗體、抗TPO受體激動劑抗體、作為凝血因子VIII的功能取代物的抗體、抗IL31受體抗體、抗HLA抗體、抗AXL抗體、抗CXCR4抗體、抗NRlO抗體和針對因子IX和因子X的雙特異性抗體。
[0098]用於本發明的優選的人源化抗體包括抗人源化白介素6 (IL-6)受體抗體(託珠單抗、hPM-Ι和MRA)(參見WO 92/19759)、人源化抗HMl.24抗原單克隆抗體(參見WO98/14580)、人源化抗甲狀旁腺激素-相關的肽抗體(抗PTHrP抗體)(參見WO 98/13388)、人源化抗組織因子抗體(參見WO 99/51743)、人源化抗磷脂醯肌醇聚糖-3 IgGl κ抗體(參見PCT/JP05/013103)和抗NRlO人源化抗體(參見W02009/072604)。用於本發明的特別優選的人源化抗體為人源化抗IL-6受體抗體。
[0099]優選的人IgM抗體包括重組人抗神經節苷脂GM3 IgM抗體(參見WO 05/05636)。
[0100]優選的微抗體(minibodies)包括抗TPO受體激動劑雙抗體(參見WO 02/33072)和抗CD47激動劑雙抗體(參見WO 01/66737)。
[0101]此外，具有改進的等電點的抗體包括例如Mabl，其為在WO 2011/090088中描述的抗IL-6受體抗體(其中的H鏈/SEQ ID NO:1;其中的L鏈/SEQ ID NO: 2)和完全人源化NS22抗體，其為抗NRlO人源化抗體，通過W02009/072604的實施例12中描述的方法生產。
[0102]本發明還涉及一種通過超濾製備包含非抗體的高度濃縮的蛋白質的組合物的方法。本發明包含一種通過超濾製備包含高度濃縮的蛋白質的組合物的方法，其中進料流速和施用於超濾膜的進料壓力可變，並且在過濾過程期間變化。用於本發明的蛋白質包括但不限於酶、細胞因子和肽適體。
[0103]在本申請內使用的表述"包含高度濃縮的抗體的組合物"表示含有高度濃縮的抗體的含水的緩衝溶液。在本申請內使用的術語"緩衝液"表示溶液，其中由於添加或釋放酸性或鹼性物質，PH變化被緩衝物質抵消。可使用導致該效果的任何緩衝物質。在一個實施方案中，使用藥學上可接受的緩衝物質，例如磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉或其鹽、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其鹽或三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)或其鹽。在一個優選的實施方案中，抗體製備物的緩衝組合物為10-30 mmol/L組氨酸。在更優選的實施方案中，抗體製備物的緩衝組合物為20 mmol/L組氨酸。
[0104]任選緩衝溶液可包含額外的鹽，例如，氯化鈉和/或硫酸鈉和/或氯化鉀和/或硫酸鉀和/或檸檬酸鈉和/或檸檬酸鉀。
[0105]在本發明的一個實施方案中，抗體製備物的pH為pH 3.Ο-pH 10.0，優選pH
5.5-pH 6.5，更優選 pH 6.0。
[0106]在本發明的一個實施方案中，抗體製備物在環境溫度下處理，優選在10_30°C溫度下，更優選在15-30°C溫度下。
[0107]在一個實施方案中，高度濃縮的抗體具有超過100 g/L的蛋白質濃度或超過2mPa.s的粘度。在一個優選的實施方案中，高度濃縮的抗體具有超過200 g/L的蛋白質濃度或超過10 mPa.s的粘度。在更優選實施方案中，高度濃縮的抗體具有超過250 g/L的蛋白質濃度或超過40 mPa.s的粘度。
[0108]在一個實施方案中，在步驟(I)中進料流速保持在200 LMH (L/m2/h)或更高。在一個優選的實施方案中，在步驟(I)中進料流速保持在250 LMH (L/m2/h)或更高。在這些實施方案中，在步驟(I)中進料流速優選保持在恆定速率。
[0109]在一個實施方案中，在步驟(I)中施用於超濾膜的進料壓力的最大值在超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%內。在一個優選的實施方案中，進料壓力的最大值為2.0巴-4.0巴。在一個更優選實施方案中，在步驟(I)中施用於超濾膜的進料壓力的最大值為
3.5 巴。[0110]在一個實施方案中，當將截留物質溶液濃縮至大於200 g/L的蛋白質濃度時，步驟
(1)轉變為步驟(2)。在一個優選的實施方案中，當將截留物質溶液濃縮至等於或大於220g/L的蛋白質濃度時，步驟(1)轉變為步驟(2)。在一個更優選實施方案中，當將截留物質溶液濃縮至等於240 g/L的蛋白質濃度時，步驟(1)轉變為步驟(2)。
[0111]在該實施方案中，在步驟(2)中在進料壓力的值降低後，進料流速保持在恆定速率，優選120 LMH (L/m2/h)或更低，或更優選80 LMH (L/m2/h)或更低。
[0112]在一個實施方案中，在步驟(2)中施用於超濾膜的進料壓力的值保持在恆定值。
[0113]在一個實施方案中，通過緩慢降低進料流速，在步驟(2)中施用於超濾膜的進料壓力的值保持在超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%內。
[0114]在一個實施方案中，進料流速採用一定的方式自動化調節，以通過進料壓力和進料流速之間的反饋控制，保持進料壓力在超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%內。
[0115]在一個實施方案中，根據本發明的生產方法在步驟(1)和步驟(2)之間還包括以下步驟:
3)使抗體製備物再循環通過膜，其中滲透物閥關閉。
[0116]在該實施方案中，使抗體製備物再循環，其中截留物質壓力控制閥完全打開。
[0117]在該實施方案中，在步驟(3)中進料流速優選保持在5-120 LMH (L/m2/h)的恆定流速，更優選 10-80 LMH (L/m2/h)。
[0118]本發明還涉及一種液體組合物，所述組合物包含通過本發明的方法製備的高度濃縮的抗體。
[0119]本發明還涉及藥物液體組合物。本發明的藥物液體組合物可包含藥學上可接受的載體。
[0120]在本發明中，藥物液體組合物通常指用於治療、預防、測試或診斷疾病的試劑。
[0121]本發明的藥物液體組合物可通過本領域技術人員已知的方法配製。例如，它們可腸胃外使用，以包括水或其它藥學上可接受的液體的無菌溶液劑或混懸劑的注射劑的形式。例如，所述液體組合物可通過以在通常批准的藥物生產實踐中所需的單位劑量形式混合而配製:通過與藥學上可接受的載體或介質適當合併，特別是與無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、矯味劑、賦形劑、媒介物、防腐劑、粘合劑等適當合併。在這樣的製劑中，調節活性成分的量，以得到在預定範圍的適當的量。
[0122]根據標準配製實踐，使用媒介物(例如注射用蒸餾水)，可配製注射用無菌組合物。
[0123]注射用含水溶液包括例如，生理鹽水和含有葡萄糖或其它輔劑(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉)的等滲溶液。還可與適當的增溶劑組合使用，例如，醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子表面活性劑(聚山梨酯80(TM)、HC0-50等）。[0124]油包括芝麻油和大豆油。苯甲酸苄酯和/或苄醇可組合使用作為增溶劑。還可組合緩衝液(例如，磷酸鹽緩衝液和乙酸鈉緩衝液)、舒緩劑(例如，鹽酸普魯卡因)、穩定劑(例如，苄醇和苯酚)和/或抗氧化劑。適當的安瓿填充有製備的注射劑。
[0125]本發明的藥物液體組合物優選腸胃外給予。例如，液體組合物可為用於注射、經鼻給予、經肺給予或透皮給予的劑型。例如，它們可通過靜脈內注射、肌內注射、腹膜內注射、皮下注射等全身或局部給予。
[0126]考慮患者的年齡和症狀，可適當選擇給藥方法。對於每次給藥，含有抗原-結合分子的藥物液體組合物的劑量可為例如0.0001-1000 mg/kg。或者，劑量可為例如
0.001-100，000 mg/患者。然而，本發明不局限於上述數值。劑量和給藥方法根據患者的體重、年齡、症狀等而變。考慮上述因素，本領域技術人員可設定適當的劑量和給藥方法。
實施例
[0127]以下實施例用於更充分地描述使用上述公開的方式，以及闡述考慮用於實施本公開的各方面的最佳方式。應理解的是，這些實施例絕不用於限制本公開的真實範圍，而是用於舉例說明的目的而呈現。
[0128]比較實施例1
圖1說明用於進行超濾過程的裝置的主要部件。再循環槽含有初始材料和截留物質。混合裝置確保在經由轉運線加入的初始池和由超濾膜返回至再循環槽的截留物質之間的均勻混合。進料泵在膜之上產生切向流。在膜的入口測量進料壓力。在膜下遊的截留物質側上使用截留物質壓力控制閥，以調節截留物質壓力，例如在跨膜壓力(TMP)控制下。在膜和截留物質壓力控制閥之間，壓力傳感器測量截留物質壓力。在膜的滲透物側上，通過膜過濾的液體的壓力通過滲透物壓力傳感器監測。
[0129]對於實驗室規模超濾處理，使用自動化TFF系統AKTA錯流(GE Healthcare，US)。使用具有再生纖維素的Hydrosart膜的0.02 m2 Sartocon slice盒進行超濾過程,標稱分子量截止值為30 kDa，並且最大進料壓力規格為4.0巴(Sartorius，德國)。
[0130]在使用前，膜盒用I mol/L氫氧化鈉清潔，並用淨化水漂洗。測定歸一化通量，以確保可比的膜性質。在過程前，膜盒用30 mmol/L組氨酸緩衝液(pH 5.8)平衡。超濾在環境溫度下操作。
[0131]原料由人源化抗人白介素-6受體(IL-6R)單克隆抗體(託珠單抗(註冊商標:ACTEMRA, RoACTEMRA)，參見PCT公布號W092/19759，美國專利號5795965)的純化的池製備。將純化的的池濃縮至高達60 mg/mL,並且緩衝液更換至30 mmol/L組氨酸緩衝液(pH 5.8)中。
[0132]將緩衝液更換的池(DF池)裝載到TFF系統，具有625 g抗體/m2。在整個過程期間進料流速設定為250 LMH (L/m2/h)的恆定速率。TMP控制在1.0巴，直至截留物質壓力控制閥完全打開。操作超濾過程，其中滲透物側末端開口。當進料壓力超過3.5巴時，終止操作。在超濾處理後，將濃縮的溶液循環，其中在10 mL/分鐘的恆定截留物質流速下將滲透物側關閉15分鐘，隨後回收到量筒中。將回收池攪拌，直至在視覺上均質。
[0133]對於蛋白質濃度測量，使用通過密度計DMA 4500 (Anton Paar，奧地利)測量的密度值，通過重量分析稀釋回收池。使用UV/Vis分光光度計DU800 (Beckman Coulter, US)測量在280 nm下的UV吸光度。
[0134]圖2顯示進料流速、進料壓力、截留物質壓力、TMP隨著時間測量的過程值。表I顯示蛋白質濃度測量的結果。
[0135][表 I]
【權利要求】
1.一種通過超濾製備包含高度濃縮的抗體的組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟: 1)調節進料流速，使得施用於超濾膜的進料壓力的值提高至超濾膜的指定最大進料壓力的85-100% ;和 2)降低進料流速，以保持或降低在步驟(1)之後施用於超濾膜的進料壓力的值。
2.權利要求1的方法，其中抗體製備物在環境溫度下處理。
3.權利要求1的方法，其中抗體製備物在10-30°C溫度下處理。
4.權利要求1的方法，其中抗體製備物在15-30°C溫度下處理。
5.權利要求1的方法，其中所述高度濃縮的抗體具有超過100g/L的高濃度或超過2mPa.s的粘度。
6.權利要求1的方法，其中所述高度濃縮的抗體具有超過200g/L的高濃度或超過10mPa.s的粘度。
7.權利要求1的方法，其中所述高度濃縮的抗體具有超過250g/L的高濃度或超過40mPa.s的粘度。
8.權利要求1的方法，其中在步驟(1)中所述進料流速保持在200LMH (L/m2/h)或更聞。
9.權利要求1的方法，其中在步驟(1)中所述進料流速保持在250LMH (L/m2/h)或更聞。
10.權利要求1、8和9的方法，其中在步驟(1)中所述進料流速保持在恆定速率。
11.權利要求1的方法，其中在步驟(1)中施用於超濾膜的進料壓力的最大值為2.0巴-4.0巴。
12.權利要求1的方法，其中在步驟(1)中施用於超濾膜的進料壓力的最大值為3.5巴。
13.權利要求1的方法，其中在步驟(1)中施用於超濾膜的進料壓力的最大值為超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%。
14.權利要求1的方法，其中當將截留物質溶液濃縮至大於200g/L的蛋白質濃度時，步驟⑴轉變為步驟⑵。
15.權利要求1的方法，其中當將截留物質溶液濃縮至等於或大於220g/L的蛋白質濃度時，步驟⑴轉變為步驟(2)。
16.權利要求1的方法，其中當將截留物質溶液濃縮至等於240g/L的蛋白質濃度時，步驟⑴轉變為步驟⑵。
17.權利要求13的方法，其中在步驟(2)中在進料壓力的值降低後，所述進料流速保持在恆定速率。
18.權利要求13或17的方法，其中在步驟(2)中在進料壓力的值降低後，所述進料流速保持在120 LMH (L/m2/h)或更低。
19.權利要求13或17的方法，其中在步驟(2)中在進料壓力的值降低後，所述進料流速保持在80 LMH (L/m2/h)或 更低。
20.權利要求1的方法，其中在步驟(2)中施用於超濾膜的進料壓力的值保持在恆定值。
21.權利要求1的方法，其中通過降低進料流速，在步驟(2)中施用於超濾膜的進料壓力的值保持在超濾膜的指定最大進料壓力的85-100%內。
22.權利要求20或21的方法，其中所述進料流速採用一定的方式自動化調節，以通過進料壓力和進料流速之間的反饋控制，保持進料壓力在超濾膜的指定最大進料壓力的85-100% 內。
23.權利要求1的方法，所述方法在步驟(1)和步驟(2)之間還包括以下步驟: 3)使抗體製備物再循環通過膜，其中滲透物閥關閉。
24.權利要求23的方法，其中使抗體製備物再循環，其中截留物質壓力控制閥完全打開。
25.權利要求23的方法，其中在步驟(3)中進料流速保持在5-120LMH (L/m2/h)的恆定流速。
26.權利要求23的方法，其中在步驟(3)中進料流速保持在10-80LMH (L/m2/h)的恆定流速。
27.權利要求1的方法，其中抗體製備物的緩衝組合物為10-30mmol/L組氨酸。
28.權利要求1的方法，其中抗體製備物的緩衝組合物為20mmol/L組氨酸。
29.權利要求1的方法，其中抗體製備物的pH為pH3.Ο-pH 10.0。
30.權利要求1的方法，其中抗體製備物的pH為pH5.5-pH 6.5。
31.權利要求1的方法，其中抗體製備物的pH為pH6.0。
32.權利要求1的方法，其中所述超濾膜的分子量截止值為50kDa或更少。
33.權利要求1的方法，其中所述超濾膜的分子量截止值為30kDa或更少。
34.權利要求1的方法，其中所述組合物包含高度濃縮的抗人白介素-6受體單克隆抗體。
35.權利要求34的方法，其中所述組合物包含高度濃縮的託珠單抗。
36.一種液體組合物，所述組合物包含通過權利要求1的方法製備的高度濃縮的抗體。
37.一種藥物液體組合物，所述組合物包含通過權利要求1的方法製備的高度濃縮的抗體和藥學上可接受的載體。
38.一種通過超濾製備包含高度濃縮的蛋白質的組合物的方法，其中所述方法包括以下步驟: 1)調節進料流速，使得施用於超濾膜的進料壓力的值提高至超濾膜的指定最大進料壓力的85-100% ;和 2)降低進料流速，以保持或降低在步驟(1)之後施用於超濾膜的進料壓力的值。
【文檔編號】C07K1/34GK103889555SQ201280053636
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年8月31日 優先權日:2011年9月1日
【發明者】K.勞, J.本德, 田中佐伊子, 若山瑠美子, 山田秀成, 磯田知紀, 大枝匡義 申請人:中外製藥株式會社, 吉寧特有限公司