護理皮膚的化妝方法
2023-05-09 05:08:16
專利名稱：護理皮膚的化妝方法
技術領域：
本發明涉及改善皮膚健康狀況和皮膚外觀的化妝方法，本發明還涉及巖芹酸在製備用於改善皮膚健康狀況和皮膚外觀的局部施用組合物中的應用。
皮膚容易受下列多種因素影響而變壞皮膚學疾病、環境濫用(風、空調、集中採暖)或正常老化進程(即時間老化，其可因皮膚受陽光照射(光老化)而加速)。近來，非常需要開發化妝品組合物和化妝方法用於改善皮膚健康狀況和皮膚外觀。
消費者逐漸尋求能治療或延遲皮膚時間老化和光老化的可見跡象、例如皺紋、條紋、松垂、色素沉著過度和老年斑的「抗老化」化妝產品。
消費者還經常從化妝品中尋求除抗老化之外的其它好處。「敏感性皮膚」的概念也使消費者需要化妝品用於改善乾燥和／或薄而易剝落的敏感性皮膚的外觀和健康狀況以及用於緩和皮膚發紅和／或炎症。消費者還需要能夠處理皮膚斑點、丘疹和瑕疵等的化妝產品。
許多人關心皮膚的色素沉著程度。例如，具有老年斑或雀斑的人們希望這些色素斑能夠變淺些。還有一些人希望降低由陽光照射引起的皮膚發黑或減輕他們的自然皮膚顏色。為了滿足這些需要，已經進行了許多嘗試來開發能夠降低黑素細胞色素產生的產品。然而，迄今為止，已經鑑定的物質具有不需要的副作用例如皮膚發炎。
因此，這些物質不適合用於化妝，或者他們只能以使皮膚增白效果不能令人滿意的濃度應用。可以考慮把不同的增白皮膚物質組合來用於降低不利副作用，但這樣可能導致由於相容性作用而引起皮膚增白效果減弱。因此，需要改進化妝性增白皮膚產品的效果，特別是這些物質不刺激皮膚。
已知脂肪酸例如巖芹酸能夠用於處理頭髮的化妝品製劑。EP116439記載了生髮油含有脂肪酸(例如巖芹酸)來減輕頭皮屑和發癢以及用於刺激頭發生長。
EP-A 709084中描述了在化妝組合物中應用芫荽子油(富含巖芹酸甘油三酯)來溼潤乾燥的皮膚。
我們已經令人驚奇地發現巖芹酸還有一些未公開的特性，這些特性能在局部應用的皮膚化妝組合物中提供以前未公開的皮膚護理效果。
我們已經發現通過把含有巖芹酸或其衍生物的化妝組合物施用於皮膚，可以有效地處理和預防由時間老化或光老化引起的正常皮膚狀態例如皺紋、條紋、松垂、色素沉著過重和老年斑。我們還發現在化妝組合物中應用巖芹酸能夠有利地提供除抗老化之外的其它皮膚效應例如降低皮膚敏感性和／或發炎以及增白皮膚。
發明概述本發明的一個方面是提供化妝方法用於提供至少一種下列皮膚護理作用處理／預防起皺、松垂、老化和／或光損害皮膚；增加皮膚的膠原沉積；增加皮膚核心蛋白聚糖的產生；增強組織修復；增白皮膚；緩解皮膚炎症、發紅和／或過敏；改進皮膚紋理、光滑性和／或結實性；該方法包括把含有巖芹酸和／或其衍生物的局部用組合物施用於皮膚。
本發明還涉及巖芹酸和／或其衍生物在用於提供至少一種選自下列的皮膚護理效果的局部施用組合物中的應用處理／預防起皺、松垂、老化和／或光損害皮膚；增加皮膚膠原沉積、增加皮膚中核心蛋白聚糖的產生、增強組織修復；增白皮膚；增白皮膚；緩解皮膚炎症、發紅和／或過敏；改進皮膚紋理、光滑性和／或結實性。
本發明的方法和巖芹酸的應用提供抗老化效果，該效果使皮膚更光滑和更柔軟，彈性更好，皮膚起皺和皮膚老化減少或延遲，並改善皮膚顏色。在皮膚外觀、紋理和健康狀況特別是光亮性、清晰性和通常的年輕外觀方面，均可以達到通常的改進效果。本發明的方法和用途還有益於緩解和減輕皮膚的致敏和／或發炎。巖芹酸還可以局部用於人皮膚來降低黑色素產生從而增白其應用部位的皮膚。因此，本發明的方法有利地提供廣泛的皮膚護理作用。
術語「處理」在此包括減輕、延遲和／或防止上面描述的皮膚健康狀況例如起皺、老化、光損害和／或炎症，並通過防止或降低起皺和增強柔韌性、結實性、光滑性、柔軟性和彈性來通常增進皮膚質量和改善皮膚外觀。本發明化妝方法和，巖芹酸和／或其衍生物的用途可能用於處理起皺、老化、光損害和發炎的皮膚，或者用於治療年輕的皮膚以預防或降低前面提到的由於正常老化／光老化引起的皮膚惡化。
發明詳述巖芹酸(下文稱「PA」)是單不飽和長鏈(C18)脂肪酸，化學式為CH3(CH2)10CH=CH(CH2)4COOH。
本發明還涉及含有巖芹酸部分的該游離酸衍生物。優選的衍生物包括那些羧基部分被取代的衍生物例如酯(如視黃基酯、甘油三酯、單甘油酯、甘油二酯、磷酸酯)、醯胺(例如神經醯胺衍生物)、鹽(例如鹼金屬和鹼土金屬鹽、銨鹽)；和／或那些來自於C18碳鏈部分被取代的衍生物例如α-羥基和／或β-羥基衍生物。
在甘油三酯衍生物中，包括所有在甘油骨架上PA取代的各種位置異構體。該甘油三酯必須含有至少一個PA部分。例如，在甘油骨架可酯化的三個位置中，位置1和2可以被PA酯化，在位置3被另一個脂類酯化；或者，該甘油骨架可以在位置1和3被PA酯化，在位置2被另一個脂類酯化。
因此，富含巖芹酸甘油三酯的油也適合用於本發明。這樣的油可以市售得到，包括洋芫荽子油、胡蘿蔔子油、小茴香油、歐洲蘿蔔子油、芫荽子油、雪維菜子油、藏茴香油和芹菜籽油。
當術語「巖芹酸」或「PA」用於本申請說明書時，應該明白還包括含有PA部分的衍生物。「PA」部分指PA衍生物的PA脂肪醯基部分。
根據本發明，在局部施用組合物中存在有效量的活性巖芹酸。通常地，為了以最小的代價取得最好的效果，按組合物的重量計，在組合物中活性成分的總含量為0．0001-50％重量、更優選0．01-10％重量和最優選0．1-5％重量。
皮膚學可接受載體本發明所用的組合物還含有皮膚學／化妝學上可接受的賦形劑作為活性成分PA的稀釋劑、分散劑或載體。這些賦形劑可以含有皮膚護理產品通常所用的物質例如水、液體或固體潤膚劑、矽油、乳化劑、溶劑、溼潤劑、增稠劑、粉末和推進劑等。
按組合物重量計，所述賦形劑在組合物中的含量通常為5-99．9％、優選25-80％，並可在缺乏其它化妝輔料的情況下用於平衡組合物。
任選的皮膚有益物質和化妝輔料除含有活性成分PA外，還可以含有其它特別對皮膚有益的活性物質例如防曬劑、其它皮膚增白劑和皮膚變褐劑。所述載體還進一步包括輔料例如香料、遮光劑、防腐劑、著色劑和緩衝劑。
產品的製備、劑型、用途和包裝為了製備本發明方法所用的局部施用組合物，可以採取製備皮膚護理產品的通常方式。通常是按常規方式將活性組分加到可皮膚用載體中。首先可以把活性成分在一部分水或加入到組合物中的其它溶劑或液體中溶解或分散。優選的組合物是水包油或油包水乳劑。
本組合物可以是常規皮膚護理產品劑型例如膏霜、凝膠或洗劑等。該組合物還可以是所謂的「洗去」產品例如沐浴膠或淋浴膠，可能含有用於在衝洗時促進皮膚粘附的活性成分釋放系統。最優選地，產品為「保留(leave-on)」產品在敷用於皮膚後無需故意的衝洗就能用於皮膚的產品。
該組合物可通過任意的合適方式包裝，例如以傳統的方式如廣口瓶、瓶子、管子或滾動條等。
可以每天1次或多次對需要處理的皮膚實施本發明的方法。通常在3-6個月後可以看出皮膚外觀的改進，具體時間取決於皮膚狀況、本發明方法所用活性成分的濃度、應用組合物的量及應用頻率。通常地，從合適的容器或塗藥器中把小量組合物例如0．1-5ml敷用於皮膚，然後用手或手指或合適的設備將其擴散和／或摩擦至皮膚。根據組合物是「保留」或「洗去」產品，可以選擇是否需要衝洗步驟。
為了使本發明可以更容易地被理解，列出下列實施例，它們僅僅用於舉例說明本發明。
實施例該實施例顯示巖芹酸的抗老化作用。
實施例1用於對比目的的局部巖芹酸處理後，體內皮膚中前膠原-I和核心蛋白聚糖增量調節的鑑定已知膠原(主要的基質皮膚蛋白)能賦予皮膚拉伸強度。核心蛋白聚糖是一種蛋白多糖，已知其對於控制和校正膠原在皮膚細胞外基質中沉積是非常重要的。本領域技術人員還知道隨著皮膚的老化和／或光損害，皮膚中膠原和核心蛋白聚糖的含量顯著降低。許多研究顯示隨著老化和／或光損害的增加，皮膚中I型膠原減少(例如Lavker，R．J．Inv．Derm．，(1979)，73，79-66；Griffiths等．N．Eng．J．Med．(1993)329，530-535)。對於核心蛋白聚糖，已經顯示在體外的光損害皮膚中，該蛋白多糖的mRNA表達和表達太太降低(Bernstein等．Lab．Invest．(1995)72，662-669)。因此，這些皮膚蛋白含量的降低同引起起皺和松馳的皮膚拉伸強度下降是相關的。
本領域熟知的事實是視黃酸是強效的抗老化活性成分，能夠引起光損害的皮膚修復。已經顯示用視黃酸局部處理皮膚後，通過在皮膚中新的膠原沉積和合成，會引起皺紋的消除和皮膚的修復(例如，Griffiths等，N．Eng．J．med．(1993)329，530-535)。已經廣泛接受的事實是通過應用視黃酸增加膠原的含量從而加強皮膚基質來提供抗老化／皮膚修復效果。前膠原I是膠原的前體。由測試化合物引起前膠原I的升高是增加膠原含量的標誌。
選擇兩組女人進行試驗，她們在外側前臂表面均有相同程度或幾乎相同程度的輕度至中度光損害。用在溼潤基質中的0．5％視黃酸(Retinava)提供給她們，同時還提供感覺相似、顏色相同、不含有活性成分的溼潤膏霜(Dermacare)作為安慰劑對照組。對於兩組中的每個參加者，在其一個外側前臂上敷用Retinova，另一個外側前臂敷用Dermacare。對於第一組，在其外側前臂上每天應用產品共14周，第二組的外側前臂上應用產品28周。在研究結束時，從各個前臂的處理區域取出2個總厚度為4mm的鑽取活組織。對從參加者中取出的活組織進行免疫組化分析，鑑定視黃酸處理對皮膚細胞外基質成分核心蛋白聚糖和前膠原-I表達的作用，將其同安慰劑處理前臂進行比較。應用下列程序物質用於蠟切片的抗體稀釋緩衝液組成為Tris緩衝鹽水(TBS)、3％牛血清白蛋白(BSA)、0．05％TritonX-100和0．05％疊氮化鈉。前膠原-I(氨基末端)的初級抗體來自Chemicon International Inc．(cat# MAB1912，鼠IgG1)，當該部分被胰蛋白酶(0．5mg／ml，25分鐘，37℃)預處理後，把上述前膠原-I以1∶800的稀釋比例應用於蠟切片，在4℃的溫度下放置過夜。核心蛋白聚糖來自Biogensis(鼠多克隆)，將其以1∶800的稀釋比例應用於蠟切片，在4℃的溫度下放置過夜。把抗大鼠生物素基化次級抗體[來自DAKO(cat#E0468，兔多克隆)]以1∶400的稀釋比例應用於蠟切片。把抗兔生物素化次級抗體[來自Amersham(cat#RPN 1004，驢子多克隆)]以1∶400的稀釋比例應用於蠟切片。把鏈酶抗生物素蛋白結合的鹼磷酸酶[來自Zymed(cat#43-4322)]以1∶2500的濃度應用。固紅色原來自DAKO(cat#K597)。Gills #3蘇木清核復染劑[來自Sigma(cat#GHS-3)]過濾，在不稀釋的條件下應用。胰蛋白酶來自Sigma(cat#T-7186)，載玻片用來自DAKO的Glycergel(cat#C563)固定。
方法在塗有矽烷的載玻片上固定生物活組織的蠟切片在55℃燒烤18小時。用二甲苯和乙醇脫蠟，移至水中，然後轉移至TBS。應用DAKA鋼筆劃沿著這些切片劃圈。必要時，按照各個抗體的說明用胰蛋白酶處理該切片用於抗原提取。當需要抗原提取時，用0．5mg／ml的胰蛋白酶(Sigma Cat#T-7186)在35℃下培養載玻片25分鐘。然後用TBS洗掉蛋白酶(2×2分鐘)。抗原提取後，如果必要，或者直接在洗掉後，應用次級抗體宿主血清在TBS／0．5％BSA／0．1％疊氮化鈉中的5％溶液作為阻斷溶液來阻斷非特異性抗體結合，使該過程在溼潤的腔室中至少進行20分鐘。引出剩餘的阻斷溶液，但不讓這些切片乾燥。然後在溼潤腔室中，在4℃下用初級抗體(如上所述適當稀釋的)培養該切片過夜。然後從這些切片中倒掉抗體，不讓這些部分乾燥。然後用TBS洗滌載玻片以除去未結合的初級抗體(經1分鐘洗滌後再進行3次5分鐘洗滌)，然後在溼潤腔室中室溫下用合適的次級抗體(如上所述適當稀釋的)培養1小時。然後，不讓這些切片乾燥的情況下從載玻片上引出抗體溶液。為了除去未結合的次級抗體，在TBS中洗滌載玻片，經1分鐘洗滌後再進行4×5分鐘洗滌。對於生物素化的次級抗體，用鏈酶抗生物素蛋白結合物在37℃下培養這些切片45分鐘，然後在TBS中洗滌，以除掉未結合的鏈酶抗生物素蛋白結合物。加入色原，觀測顏色變化以避免過度著色。然後對這些切片進行復染色，再封固。
用光學顯微鏡觀察免疫組化著色切片，確定視黃酸(Retinova)和安慰劑(Dermacare)處理部位之間前膠原-I和核心蛋白聚糖表達上的區別。
分析顯示如下列表1所示，在光損害的皮膚中，局部應用視黃酸(Retinova)後，前膠原-I和核心蛋白聚糖明顯增量調節。
表1體內皮膚中用視黃酸處理對前膠原-I和核心蛋白聚糖表達的影響
因此，多餘的細胞基質組份前膠原1和核心蛋白聚糖是視黃酸誘導的皮膚修復的明顯識別標誌。
在人皮膚成纖維細胞中測定前膠原-I和核心蛋白聚糖合成的步驟皮膚成纖維細胞條件培養液的製備以1000細胞／cm2的密度把初級人包皮成纖維細胞第2代(P2)接種於12孔培養板中，在補充有10％胎牛血清的Dulbeccos改性Eagle培養基(DMEM)中並在5％二氧化碳和4％氧氣的氣氛下維持24小時。然後，用不含血清的DMEM洗滌細胞，再在不含血清的新鮮DMEM中培養60小時。再用不含血清的DMEM洗滌該成纖維單層細胞。在最終體積為0．4毫升／孔不含血清的新鮮DMEM中，以一式三份把試劑和載體對照加入到細胞中，再培養24小時。立即分析該成纖維細胞條件培養基或者將其在液氮中突然冷凍，在-70℃下儲存以便進一步分析。對細胞進行計數，然後把根據斑點印跡分析得到的數據標準化為細胞數目。
在皮膚成纖維條件培養基中對前膠原-I和核心蛋白聚糖的斑點印跡分析對於用載體(作為對照)或測試試劑處理的皮膚成纖維細胞條件培養基樣品，由用20mM二硫蘇糖醇(200mM儲存液的1∶10的稀釋液)和0．1％十二烷基硫酸鈉(10％儲存液的1∶100稀釋液)進行補充，充分混合，在75℃下培養2分鐘。分析標準是這樣生成的在175cm2燒瓶中以1000細胞／cm2的密度接種成纖維細胞，如上所述，將其在不含血清的DMEM中培養，將從中得到的純成纖維條件培養基進行系列稀釋。然後應用來自Bio-Rad的96孔Bio-Dot儀器，按照製造商的說明，一式三份地把分析樣品應用於Immobilon-P轉移膜的預溼潤片中。在每個孔中大約應用200μl培養基。然後將培養基在重力作用下透過膜(30分鐘)過濾，然後用PBS(200μl)洗滌膜兩次。把這些PBS洗滌物在重力作用下通過膜過濾(2×15分鐘)。再把Bio-Dot儀器連接到真空多支管中，在抽吸下用PBS進行第三次(最後一次)洗滌。拆開儀器，在4℃下，按照需要移開膜，並快速切開，置於封閉緩衝液中靜置過夜。對於用於核心蛋白聚糖分析製備的膜，用3％(w／v)BSA／0．1％(v／v)吐溫20的PBS液封閉該膜；而對於用於前膠原-I分析所用的膜，則用脫脂幹奶粉／0．05％吐溫20的PBS液封閉膜。次日，應用人前膠原-I(MAB1912；鼠單克隆；Chemicon Int．Inc．，Temecula，CA)的或者人核心蛋白聚糖的(鼠單克隆；Biogensis)的初級抗體的1∶1000稀釋液在室溫對該膜探測2小時。然後用TBS／0．05％吐溫20(3×5分鐘)對膜進行洗滌，然後在室溫下，將其置於125I-結合的抗大鼠或抗兔F(ab＇)2片斷(Amersham)的1∶1000稀釋液中培養1小時。然後，再次用TBS／吐溫20洗滌(3×5分鐘)該Immbilon條，再讓其在室溫下的空氣中乾燥。把乾燥膜包裹於玻璃紙中，將其置於分子動態儲存磷屏上16-18小時。最後，通過phosphorimager(Molecular DynamicsPhosphorimager SF)用ImagequantTM軟體掃描。通過電腦輔助成象分析應用ImageQuantTM的定量工具評價點強度，標準化至細胞數，把載體處理的對照值定為100任意單位，相對於該值來確定不同測試試劑對核心蛋白聚糖和前膠原-I合成的作用。
測試下表2顯示巖芹酸對人皮膚成纖維細胞的前膠原-I和核心蛋白聚糖合成的作用及其應用的數量。為了將這些結果標準化，以載體處理的對照值100任意單位作為基準來確定測試物質的作用。為了對比，還用視黃酸進行了試驗以確定其對人皮膚成纖維細胞中核心蛋白聚糖合成的作用。在試驗中所用試劑的濃度對細胞存活率沒有影響。
表2巖芹酸對前膠原-I和核心蛋白聚糖合成的作用處理 前膠原-I 核心蛋白聚糖對照組(載體) 100 100巖芹酸(10μM) 118．4±48．6 153．0±19．1(n=3)(p=0．01，n=4)表2的結果顯示同對照組相比，巖芹酸明顯增加人皮膚成纖維細胞中的前膠原-I和核心蛋白聚糖的合成。
在皮膚中，核心蛋白聚糖的含量同皮膚的健康狀況和外觀改善有關。增加皮膚中核心蛋白聚糖的含量對於控制和糾正皮膚膠原(皮膚膠原同許多皮膚效應例如皺紋消失和光損害皮膚的皮膚損傷有關)的沉積是非常重要的。
用視黃酸(1μm)的對比試驗顯示相對於100任意單位的載體處理的對照值相比，核心蛋白聚糖增量調節，其值為138±14．0(p=0．035，n=4)。令人驚奇地，這些數據還進一步表明在人皮膚成纖維細胞中，巖芹酸對核心蛋白聚糖合成增量調節的幅度超過了標準抗老化皮膚修復活性視黃酸的影響值。
實施例2本實施例測量巖芹酸的抗刺激功能。
角質形成細胞SDS生存能力測試方法學在96孔培養皿中用角質形成細胞生長培養基(KGM)培養角質形成細胞，培養至大約80％融合時，培養液用不含氫化可的松的KGM替換，培養24-28小時。然後，在巖芹酸的存在下或不存在下，應用能夠產生大約50％細胞存活能力濃度(2μ／ml)的十二烷基硫酸鈉(SDS)處理細胞。然後應用巖芹酸(濃度如表3所示)對細胞用藥。對照組不含有任何SDS或測試化合物。經培養24小時後，除去培養基，用中性紅方法確定存活能力。應用該方法，在含有25μg／ml的中性紅的KGM中培養該細胞3小時，然後除掉培養基，再用1ml 1％(v／v)乙酸、50％(v／v)乙醇提取細胞30分鐘。測定提取物在562nm處的吸收度，參照不含SDS並且不含測試化合物的對照孔評價生存能力。得到的結果如下表3所示表3處理組角質形成細胞的％存活性SDS(μg／ml) PA(μM)平均 SD n0 0 100 11．982 0 55．8 18．382 0．1 94．5 16．582 1． 0 84．1 16．882 1085．8 11．98通過1way ANOVA，應用Student-Neumann-Kuels多次對比檢驗，同單獨的2μg／ml SDS值相比，所有巖芹酸(PA)值顯示明顯增加的生存能力，p＜0．05。
該方法顯示刺激劑的角質形成細胞毒性同試劑在體內的刺激作用有關(Lawrence，JN，Starkey，S．，Dickson，FM ＆ Benford，DJ．)，應用人和大鼠角質形成細胞培養物以評價皮膚刺激能力。Toxitol． Invitro．10，331-340(1996)．)。因此，我們在此證明應用巖芹酸處理能夠顯著降低SDS對角質形成細胞的毒性作用，因此其具有抗刺激功能。
實施例3本實施例顯示巖芹酸能夠有效地降低由體外角質形成細胞分泌的PGE2(前列腺素E2)。
角質形成細胞PGE2分析在96孔培養皿中用角質形成細胞生長培養基(KGM)培養角質形成細胞，培養至大約80％融合時，培養液用不含氫化可的松的KGM替換，培養24-28小時。然後，對細胞給予巖芹酸，其量如表下表4所示。在對照組細胞中不加入巖芹酸。用巖芹酸(或者，對於對照組，不用巖芹酸)培養細胞24小時。在培養結束時，收集培養基，應用市售PGE2試劑盒(Amersham，Buckinghamshire，英國)通過酶聯免疫檢測檢測培養基中促炎因子PGE2的基本釋放。
然後，按照上面實施例2描述的中性紅攝取方法，測試細胞的生存能力。通過應用測試濃度的巖芹酸處理，沒有發現對細胞存活能力有副作用。
通過測試化合物降低PEG2基本分泌的能力(同對照組相比)，確定測試化合物抗炎作用。應用Student’s t-檢驗，確定統計學有效性。得到的結果總結於下列表4。
表4處理 角質形成細胞PGE2含量(pg／孔)平均 SDn對照組 197．9 50．2 4PA 0．1μM 150．1 55．7 4PA 1μM117．8 22．6 4通過1way ANOVA，應用Student-Neumann-Kuels多次對比檢驗，統計分析顯示0．1μM和1μM的巖芹酸(PA)明顯(p＜0．05)降低未刺激角質形成細胞中PGE2的釋放。
PGE2是公知的皮膚炎症介質，參見Greaves等「Prostagludus，白三烯、磷酯酶、血小板活化因子和細胞因子人皮膚炎症的綜合治療途徑」Arch．Dermatol．Res．(1988)[增刊]533-541。
該結果顯示巖芹酸(PA)處理的角質形成細胞產生較少的促炎前列腺素PGE2，因此降低皮膚的發炎可能性。
實施例4本實施例測定巖芹酸對降低皮膚成纖維細胞炎症反應的作用。
成纖維細胞PGE2和ICAM測試人皮膚成纖維細胞中細胞間粘附分子(ICAM)和PEG2的產生可以通過炎症刺激劑PMA(佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯phorbal myristateacetate)來誘導。PMA代表外部應激物，其誘導細胞中的氧化應激和炎症反應。該模型通常用於體內炎症模型。
以1000細胞／孔的密度把初級人包皮成纖維細胞第2代(P2)接種於96孔培養皿中，在補充有10％胎牛血清的Dulbeccos改性Eagle培養基(DMEM)中並在5％二氧化碳和4％氧氣的氣體下維持24小時。一式三份把巖芹酸加入到新鮮細胞培養基(補充有10％胎牛血清的DMEM)的二甲基亞碸(DMSO，終濃度1％)液中，再培養24小時。把佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)(Sigma)加入到培養基中，繼續培養細胞24小時。對照組不含有測試化合物並且不含有任意PMA。然後，立即按照下面描述分析成纖維細胞／培養基，或者在液氮中突然冷凍，並在-70℃下儲存，用於以後分析。對細胞進行計數，然後把根據斑點印跡分析得到的數據標準化為細胞數目。
前列腺素E2(PGE2)分析輕輕搖蕩培養皿後，取50μl培養基進行PGE2分析。用Biotrak PGE2免疫分析試劑盒(Amersham，UK)測定培養基中PGE2含量。分析的基礎是對於限定量固定PGE2特異性抗體，樣品中未標記PEG2和固定量辣根過氧化物酶標記的PGE2之間的競爭。按照同一時間得到的標準曲線，確定未標記樣品PGE2的濃度。
ICAM-1分析棄去培養基，用DulbeccoPBS洗滌細胞。對於洗滌的細胞，以3分鐘時間把150μl 0．1％Triton X-100(Sigma)加入到細胞膜中的提取物ICAM中。把提取物轉移至Eppendoff離心管中，在1000g下離心2分鐘以除掉細胞碎片。取100μl上清液用於ICAM分析。應用市售免疫酶分析試劑盒(RD系統)分析可溶性ICAM-1。按照平行標準曲線確定樣品中ICAM-1的濃度。
從PGE2和ICAM分析得到的結果如下表5所示。
表5巖芹酸對人皮膚成纖維細胞中PMA-誘導的ICAM和PGE2產生的作用處理 N ICAM(ng／ml)PGE2(pg／ml)對照組 4 3．07+0．54 32±6PMA(10nM)-處理 4 14．42±1．86 2371±241PMA+PA(0．1μM) 4 8．64±0．89* 500±127*PMA+PA(1μM) 4 7．71±0．66* 486±93*PMA+PA(10μM)4 7．39±0．14* 233±139*PMA+PA(100μM) 4 6．68±1．35* 117±39**同PMA處理細胞得到的數值對比，p＜0．001。
上述結果顯示通過產生所測定的前列腺素E2(PGE2)，炎症刺激劑例如PMA(Phorbol myristyl acetate)攻擊細胞使炎症反應增加。巖芹酸，即使濃度在0．1μm時，也明顯降低通過測定PGE2產生所測得的炎症反應。這些結果表明巖芹酸具有良好的抗炎活性。
上述結果還顯示用PMA攻擊細胞引起ICAM產生增加。巖芹酸降低細胞間粘附分子(ICAM)(炎症的另一個指標)的產生。因此，這些結果進一步顯示巖芹酸具有良好的抗炎效應。
實施例5皮膚增白測定方法*細胞培養在75cm2的培養瓶中，應用補充L-穀氨醯胺(4mM)和10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基(ICN-Flow，cat．no．12-60-54)，在含5％CO2的空氣下，培養B16-F1小鼠黑素瘤細胞(美國典型物培養中心，Maryland，USA)。把細胞每周傳代兩次。
*色素沉著分析在96孔微量滴定培養皿中，以5000細胞／孔的密度接種subconfluent B16細胞，在含有10％胎牛血清和1％青黴素／鏈黴素但不含酚紅的DMEM中，在37℃和5％CO2的氣體下培養過夜。24小時後，培養基用含有測試物質或賦形劑對照物的新鮮培養基替換。將細胞培養72小時，此時可在對照組孔中看見黑色素。然後，把從每個孔中得到的含黑色素的培養基轉移到清潔的96孔培養皿中，通過應用微量培養板分光光度計(Dynatech MR5000)讀取其在530nm處的吸收度來定量分析，並校正新鮮培養基的基準吸收度。因為校正的吸收正比於黑色素濃度，因此皮膚增白試驗物質的色素沉著百分比可以按照下式計算％色素沉著=(OD530檢測／OD503參比)×100％其中OD530檢測和OD503參比分別表示從含有測試物質的孔中得到的培養基平均校正吸收度和從不含有測試物質的孔中得到的平均培養基校正吸收度。然後，由測試物質引起的百分比抑制值為100-％色素沉著*細胞存活測試抑制黑色素生成可以降低黑色素的產生，但黑色素的產生還受細胞毒性或細胞增生影響。為了測試其釋放出現，用中性紅染料吸附測試細胞存活能力。中性紅是水溶性染料，其能夠通過完整的血漿膜，並濃集於完整細胞的溶酶體中。中性紅染料的總攝取同培養物中生存細胞數成正比。
把用於黑色素分析的培養基從微量滴定孔中除去後，立即把200μl新鮮預熱的中性紅染料(ex．Sigma，UK，Cat．Nr 2889)的25μg/ml培養液應用於細胞，並培養3小時。通過反轉培養板除掉沒有被細胞吸收的染料，輕叩吸水紙。用200μl PBS洗滌細胞，然後除去洗滌液。加入100μl溶劑(50％H2O、49％EtOH、1％乙酸)。20分鐘後，在室溫下，在微滴培養皿搖蕩器上把每個培養皿搖動5秒鐘。如上所述，測定吸收度。
測試下表6顯示所測定皮膚增白測試物質及其用量。如上所述，由測試物質引起的黑色素生產百分比抑制反映於表中。
小於100％黑色素對照組的值顯示黑素生成的抑制。因此，下表3中的結果顯示PA抑制黑素的生成。
在試驗中，用DMEM稀釋測試物質，其量如下表5所示。
表6培養基中的黑色素 中性紅細胞存活能力處理 ％對照 S．D． t-測試 ％對照S．D． t-測試相對於對照相對於對照對照組 100 8．5 100．0 4．60．1％巖芹酸 19．3 1．2**(0．000)1．0 0．4**(0．000)0．04％巖芹酸 3．9 0．7**(0．000)69．98．8**(0．000)0．02％巖芹酸 55．3 18．2 **(0．000)103．1 3．9**(0．082)0．013％巖芹酸 40．4 10．7 **(0．000)105．2 4．1(0．006)0．01％巖芹酸 79．5 8．6**(0．000)104．8 3．9*(0．009)Student’s t-測試**p＜0．01；*p＜0．05(n=4)實施例6下列配方描述適合於本發明方法和用途的水包油膏霜。顯示的百分比是按組合物重量而計的。
wt％礦物油 4巖芹酸(三甘油酯) 1．15Brij 56* 4Alfol 16RD 4三乙醇胺 0．75丁烷-1，3-二醇 3黃原膠 0．3香料 適量丁化羥基甲苯 0．01水 加至100*Brij 56為十六烷醇POE(10)Alfol 16RD為十六烷醇實施例7下列製劑描述本發明的乳膏化學全名或CTFA名稱商品名 重量百分比PA甘油三酯 2．0EDTA二鈉 Sequesterne Na2 0．05矽酸鋁鎂 Veegum Ultra 0．6對羥基苯甲酸甲酯 Methyl Paraben0．15二甲基矽油DC Antifoam Emulsion 0．011，3-丁二醇 1，3-丁二醇 3．0羥乙基纖維素 Natrosol 250HHR 0．5甘油，USP 甘油USP 2．0黃原膠Keltrol 1000 0．2三乙醇胺 三乙醇胺(99％)1．2硬脂酸Pristerene 4911 3．0對羥基苯甲酸丙酯NFPropylparaben NF 0．1氫化硬脂酸甘油酯 Naturechem GMHS 1．5
十八烷醇 Lanette 18 DEO1．5棕櫚酸異十八烷基酯Protachem ISP 6．0C12-15醇辛酸酯Hetester FAO 3．0二甲聚矽氧烷 Silicone Fluid 200(50cts) 1．0膽固醇NF Cholesterol NF0．5硬脂酸脫水山梨糖醇酯 硬脂酸脫水山梨糖醇酯 1．0丁化羥基甲苯 Embanox BHT 0．05乙酸生育酚酯 維生素E乙酸酯 0．1PEG-100硬脂酸酯 Myrj 59 2．0硬脂醯基乳酸鈉Pationic SSL 0．5羥基辛酸 羥基辛酸 0．1棕櫚酸視黃酯 維生素A棕櫚酸酯 0．06α-紅沒藥醇 α-紅沒藥醇 0．2水，DI適量至100當用於經老化或光老化損害的皮膚時，上面實施例6和實施例7的局部用組合物均通過有效的化妝處理用於增白皮膚和／或改善起皺、老化、光損害和／或刺激性皮膚的外觀，當用於青年皮膚時，用於防止或延遲這種損害變化。這些組合物可以通過常規方式製備。
權利要求
1．提供至少一種選自下列皮膚護理效應的化妝方法，所述皮膚護理效應選自處理和／或預防起皺、松垂、老化和／或光損害皮膚；增加皮膚中膠原的沉積，促進皮膚中核心聚糖蛋白的生成，增強組織修復；增白皮膚；緩和皮膚的刺激、發紅和／或致敏，增強皮膚紋理、光滑性和／或結實性；該方法包括把含有巖芹酸和／或其衍生物的局部組合物應用於皮膚。
2．巖芹酸和／或其衍生物在局部組合物中的應用，所述的局部用組合物用於提供至少一種下列皮膚護理功能，選自處理和／或預防起皺、松垂、老化和／或光損害皮膚；增加皮膚中膠原的沉積，促進皮膚中核心聚糖蛋白的生成，增強組織修復；增白皮膚；緩和皮膚的刺激、發紅和／或致敏，增強皮膚紋理、光滑性和／或結實性。
全文摘要
通過把含有巖芹酸和/或其衍生物的組合物局部應用來提供一種用於治療老化、起皺和/或光損害皮膚的化妝方法。所述方法還降低皮膚刺激並且增白皮膚。
文檔編號A23D7/015GK1293566SQ99804114
公開日2001年5月2日 申請日期1999年3月8日 優先權日1998年3月16日
發明者S·阿拉盧夫, K·E·巴雷特, A·M·布林克, F·W·凱恩, M·R·格林, H·L·胡, K·伊瓦塔, T·E·亞努爾裡奧, K·A·奧特, L·R·帕蘭克爾, J·R·波維爾, A·V·羅林斯, J·S·羅傑斯, U·桑塔納姆, A·瓦特金森, R·L·溫考夫 申請人:尤尼利弗公司