一種發酵制檸檬酸的方法

2023-04-27 04:11:36

專利名稱：一種發酵制檸檬酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵制檸檬酸的方法。
背景技術：
檸檬酸是有機酸中第一大酸，由於物理、化學等方面的優異性能，廣泛應用於醫藥、化學、電子、紡織、石油、皮革、建築、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業領域。目前的檸檬酸發酵採取的主流技術是二級液體深層發酵技術，在發酵過程中需要通入較大量的壓縮空氣(O. 18-0. 3MPa)、種子罐和發酵罐的罐壓控制在0. 05-0. IMPa之間以供應黑麴黴種子的生長和發酵產酸。因黑麴黴在生長和產酸階段對氧氣較為敏感，在溶氧不足或缺氧的條件下，黑麴黴菌體的代謝途徑將發生改變，抑制而且是不可逆的影響產酸速率及產酸率。而檸檬酸發酵過程中由於檸檬酸發酵液的性質導致氧傳遞係數不高。因此在檸檬酸發酵過程中需要通入大量的壓縮空氣，以供應黑麴黴種子檸檬酸發酵生產檸檬酸。由此導致在檸檬酸發酵過程中因供氧而增加的能耗佔生產成本的很大比例，而發酵尾氣直接排放到空氣中也是一種能源浪費。因此，迫切需要開發一種能夠有效利用檸檬酸發酵過程中所產生的尾氣，並能夠降低檸檬酸生成成本的檸檬酸發酵的方法。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的發酵制檸檬酸的方法。採用本發明的方法不僅能夠有效利用檸檬酸發酵過程中所產生的尾氣，而且還大大降低了因供氧而增加檸檬酸發酵的能耗，從而降低檸檬酸的生產成本。本發明的發明人意外地發現，將檸檬酸種子培養過程中得到尾氣以及檸檬酸發酵培養過程中得到尾氣，替代檸檬酸發酵過程中通常使用的空氣，不僅不會對檸檬酸的發酵水平帶來不利的影響，反而有利於提高檸檬酸發酵的產酸率，從而完成本發明。即本發明提供一種發酵制檸檬酸的方法，該方法包括在通入第一氣體的條件下， 將檸檬酸發酵菌接入到種子罐內的種子培養基中進行種子培養後得到種子培養液和第一尾氣，在通入第二氣體的條件下，將種子培養液接入到發酵培養罐內的發酵培養基中進行發酵培養，得到檸檬酸發酵液和第二尾氣，其中，所述第一氣體為空氣，部分或全部所述第二氣體為所述第一尾氣和/或第二尾氣，且剩餘部分所述第二氣體為空氣。根據本發明的發酵制檸檬酸的方法，不僅能夠減少空氣的用量，解決尾氣的排放問題，而且由於上述尾氣壓力在0. 05-0. IMPa的範圍內，該尾氣還具有非常可觀的能量，被直接排放到空氣中是一種非常大的能量浪費，將其進行稍微的壓縮後，就可以達到發酵培養的壓力要求，因此與現有技術在檸檬酸發酵過程中使用空氣相比，還可以大大降低因壓縮氣體而增加的能耗。另外，通過使用該尾氣，還可以提高檸檬酸發酵的產酸率。
具體實施方式
本發明提供一種發酵制檸檬酸的方法，該方法包括在通入第一氣體的條件下，將檸檬酸發酵菌接入到種子罐內的種子培養基中進行種子培養後得到種子培養液和第一尾氣，在通入第二氣體的條件下，將種子培養液接入到發酵培養罐內的發酵培養基中進行發酵培養，得到檸檬酸發酵液和第二尾氣，其中，所述第一氣體為空氣，部分或全部所述第二氣體為所述第一尾氣和/或第二尾氣，且剩餘部分所述第二氣體為空氣。根據本發明的方法，所述部分或全部所述第二氣體為所述第一尾氣和/或第二尾氣，且剩餘部分所述第二氣體為空氣是指可以將第一尾氣和/或第二尾氣全部替代在發酵培養過程中需要通入的空氣進行發酵；也可以將第一尾氣和/或第二尾氣部分替代在發酵培養過程中不同階段需要通入的空氣進行發酵；還可以是將第一尾氣和/或第二尾氣和空氣進行混合後替代在發酵培養過程中需要通入的空氣進行發酵。優選將第一尾氣和/ 或第二尾氣部分替代在發酵培養過程中不同階段需要通入的空氣進行發酵。即，在發酵培養的過程中的某一個或多個階段，將第一尾氣和/或第二尾氣替代在該階段需要通入的空氣。根據本發明的方法，以通入的第二氣體的總量為基準，所述第一尾氣和第二尾氣的總量為70-100體積％ ；優選所述第一尾氣和第二尾氣的總量為70-85體積％。根據本發明的方法，該方法可以有多種實施方式，例如可以是在經過種子培養、發酵培養得到檸檬酸發酵液的過程中，將種子培養得到第一尾氣以及發酵培養前期得到的第二尾氣用於發酵培養後期進行發酵。即通入第二氣體的一種實施方式為在發酵培養的前期，通入空氣，在發酵培養的後期，通入第一尾氣和/或第二尾氣。所述發酵培養前期、後期可以根據得到的第一尾氣和第二尾氣的量來適當地選擇。所述發酵培養的前期為從開始發酵到發酵培養tl時間之間的時間段，tl與發酵培養總時間t2的比例為1 3-7 ；優選tl 與發酵培養總時間t2的比例為1 3.5-6。所述發酵培養的後期為發酵培養tl時間到發酵培養結束之間的時間段。例如，所述發酵培養前期為8-16小時，發酵培養的總時間可以為50-65小時。另外，也可以是將種子培養得到第一尾氣以及發酵培養得到的第二尾氣收集後，替代下次檸檬酸發酵培養中需要通入的空氣。根據本發明的方法，一般情況下，所述第一尾氣和/或第二尾氣的氧氣的含量為 20. 6-20. 9體積％，所述第二氣體中的二氧化碳的含量為0. 035-0. 038體積％。優選的情況下，所述第二氣體中的二氧化碳的含量為0. 037-0. 038體積％。根據本發明的方法，由於種子培養得到的第一尾氣和發酵培養得到的第二尾氣中含有微量的菌體，為了降低尾氣中的菌體對壓縮機設備的傷害，優選將所述第一尾氣和/ 或第二尾氣中的菌體進行處理，以使所述第一尾氣和/或第二尾氣中的菌體的含量不超過 IOwppm0上述將所述第一尾氣和/或第二尾氣中的菌體進行處理的方法為本領域所公知， 只要能夠有效地除去所述第一尾氣和/或第二尾氣中的菌體即可。例如可以將所述第一尾氣和/或第二尾氣經過濾網後再經過過濾器後得到菌體的含量不超過IOwppm的第一尾氣和/或第二尾氣。所述濾網的孔徑可以為0. 5-2um，該濾網可以通過商購獲得。例如購於石家莊東力公司的濾網。所述過濾器為空氣過濾器，也可以通過商購獲得，例如購於上海環升公司的365型號的空氣過濾器。根據本發明的方法，該方法還包括將所述第一尾氣和/或第二尾氣經過二次壓縮後得到壓力為0. 18-0. 3MPa的壓縮氣體。由於所述第一尾氣和第二尾氣的壓力在 0. 05-0. IMI^a之間，將第一尾氣和/或第二尾氣壓縮到0. 18-0. 3ΜΙ^的能耗要遠遠低於將常壓空氣壓縮到0. 18-0.3ΜΙ^的能耗。因此，能夠大大降低因供氧而增加檸檬酸發酵的能耗。根據本發明的方法，發酵培養罐內的壓力可以為0.06-0. IMPa，所述第二氣體的通氣量可以為0. 1-0. 3體積(體積·分鐘)；優選的情況下，發酵培養罐內的壓力為 0. 08-0. IMPa，所述第二氣體的通氣量為0. 2-0. 3體積(體積·分鐘)。根據本發明的方法，所述種子罐內的壓力可以為0. 06-0. IMPa,所述第一氣體的通氣量可以為0. 2-0. 5體積(體積·分鐘)；優選的情況下，所述種子罐內的壓力為 0. 06-0. 08MPa,所述第一氣體的通氣量為0. 3-0. 4體積(體積·分鐘)。術語「通氣量」一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積比來表示(ν/ν ·π η)，例如通氣比為1 0. 1-1，簡稱通氣量為0. 01-1體積(體積 分鐘)。在本發明中，所述種子培養基可以為本領域所公知的各種檸檬酸種子培養基。優選的情況下，使用澱粉質原料酶解液，以該澱粉質原料酶解液的總量為基準，澱粉質原料酶解液中的總糖為8-14重量％、以氮元素計，氮源為0. 1-0. 5重量％ ；優選地，該澱粉質原料酶解液中的總糖為9-12重量％、氮源為0. 1-0. 25重量％。根據需要，還可以向種子培養基中添加補充氮源。所述補充氮源的添加量可以為培養基總重量的0.01-0. 05重量％。所述補充氮源的種類為本領域技術人員所公知，例如，所述補充氮源可以為尿素、硫酸銨和硝酸銨等中的一種或多種。上述澱粉質原料酶解液可以通過將水、粉碎後的澱粉質原料以及澱粉酶混合酶解而得到。具體地，以每克粉碎後的澱粉質原料的乾重計，所述澱粉酶的用量為15-40個酶活力單位，所述水的用量為1-6克；優選地，所述澱粉酶的用量為20-30個酶活力單位，所述水的用量為2-5克。本發明所述酶的酶活力單位的定義為在ρΗ值為6. 0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將1毫克澱粉轉化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。所述酶解的溫度可以在很大範圍內改變，優選為70-115°C，更優選為90-95°C。所述酶解的時間理論上越長越好，考慮到設備利用率，優選所述酶解的時間為90-150分鐘， 更優選為100-120分鐘。所述酶解的ρΗ值可以在很大範圍內改變，優選為5. 0-7.0，更優選 PH 值為 5. 8-6. 2。澱粉酶是指能夠分解澱粉糖苷鍵的一類酶的總稱，所述澱粉酶一般包括α -澱粉酶、β-澱粉酶、糖化酶和異澱粉酶。α-澱粉酶又稱澱粉1，4_糊精酶，它能夠任意地、不規則地切開澱粉鏈內部的 α-1,4-糖苷鍵，將澱粉水解為麥芽糖、含有6個葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖。生產此酶的微生物主要有枯草桿菌、黑麴黴、米麴黴和根黴。β -澱粉酶又稱澱粉1，4-麥芽糖苷酶，能夠從澱粉分子非還原性末端切開1，4_糖苷鍵，生成麥芽糖。此酶作用於澱粉的產物是麥芽糖與極限糊精。此酶主要由麴黴、根黴和內孢黴產生。糖化酶又稱澱粉α-1，4-葡萄糖苷酶，此酶作用於澱粉分子的非還原性末端，以葡萄糖為單位，依次作用於澱粉分子中的α-1，4-糖苷鍵，生成葡萄糖。糖化酶作用於支鏈澱粉後的產物有葡萄糖和帶有α-1，6_糖苷鍵的寡糖；作用於直鏈澱粉後的產物幾乎全部是葡萄糖。此酶產生菌主要是黑麴黴(左美麴黴、泡盛麴黴)、根黴(雪白根酶、德氏根黴)、 擬內孢黴、紅麴黴。異澱粉酶又稱澱粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用於枝鏈澱粉分子分枝點處的α-1，6-糖苷鍵，將枝鏈澱粉的整個側鏈切下變成直鏈澱粉。此酶產生菌主要是嫌氣桿菌、芽孢桿菌及某些假單孢桿菌等細菌。根據本發明，優選使用α -澱粉酶和/或異澱粉酶。根據本發明，所述澱粉質原料可以為本領公知的各種可以用於酶解、發酵製備檸檬酸的含有澱粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或多種。優選地，所述含有澱粉的原料為玉米。 根據本發明，所述檸檬酸發酵菌可以為本領域所公知的檸檬酸發酵菌。具體地，可以為黑麴黴、酵母或細菌。優選地，所述檸檬酸發酵菌為黑麴黴。本發明發酵所使用的黑麴黴可以為商購的黑麴黴固體製劑或黑麴黴菌種，例如，黑麴黴Co827 (上海工業微生物研究所)和黑麴黴TOl (天津工業微生物所)。根據本發明，在被接種至所述發酵培養基中之前，將所述發酵菌經過種子培養處理，之後將得到的種子液加入到所述發酵培養基中。發酵菌種子培養的程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑麴黴的生長進行觀察，當pH在2. 0-2. 5、酸度 0. 5-2. 0%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時停止培養。上述種子培養的條件可以在很大範圍內改變，例如所述培養的條件還包括培養的溫度可以為30-45°C，pH值可以為2-6，培養的時間可以為20-40小時；更優選的情況下， 培養的溫度可以為34-38°C，pH值可以為2. 0-4. 5，所述培養的時間可以為22-30小時。在本發明的種子培養中，所述檸檬酸發酵菌的接種量可以在很大範圍內改變，優選情況下，以每毫升種子培養基為基準，發酵菌的接種量為1 XIO5 1 X IO6個菌落形成單位。所述菌落形成單位的定義為將稀釋後的一定量的菌液通過澆注或塗布的方法，讓其內的微生物單細胞一一分散在培養基平板上，待培養後，每一活細胞就形成一個菌落。即每毫升菌液中含有的單細胞的數目。所述菌落形成單位可以通過本領域公知的方法測定，例如，通過血球計數板計數。根據本發明，所述將檸檬酸發酵菌接種至所述發酵培養基中進行發酵的條件可以在很大範圍內改變，例如所發酵的條件可以包括培養的溫度可以為30_42°C，pH值可以為 1-6，培養的時間可以為50-65小時；更優選的情況下，所述培養的條件可以包括培養的溫度可以為；34-39°C，pH值可以為1.5-3.0，所述培養的時間可以為51-60小時。所述培養的設備為本領域技術人員所公知，例如，可以使用發酵罐進行培養。根據本發明，所述發酵培養基中各組分的含量可以在很大範圍內改變。優選地，所述發酵培養基中碳源(糖)含量為13-21重量％，氮源含量為0. 06-0. 14重量％，磷源含量為0. 005-0. 07重量％，無機鹽含量0. 1-2. 6重量％，水含量為77-86重量％。優選所述發酵培養基中總糖為13-18重量％，更優選發酵培養基中總糖為14-16 重量％。優選情況下，還可以根據需要向所述發酵培養基中添加補充氮源，所述補充氮源(如尿素)的添加量可以為發酵培養基總重量的0.01-0. 05重量％。根據本發明，所述補充氮源的種類為本領域技術人員所公知，例如，所述補充氮源可以為尿素、硫酸銨和硝酸銨等中的一種或多種。在本發明中的發酵培養中，所述檸檬酸發酵菌的接種量可以在很大範圍內改變， 優選情況下，以每毫升發酵培養基為基準，發酵菌的接種量為1XIO4-I X IO5個菌落形成單位。下面通過實施例對本發明進行進一步的說明，但本發明並不僅限於下述實施例。以下實施例中檸檬酸的酸度採用酸鹼中和的方法測定。以下實施例中所使用的空氣壓縮機購於MAN-Turbo公司的單軸壓縮機；以下實施例中所使用的濾網購於石家莊東力公司；以下實施例中所使用的過濾器購於上海環升公司的365型號。以下實施例中的玉米粉酶解液的製備方法為將55噸玉米進行粉碎，得到平均粒子直徑為400微米的粉碎產物。將粉碎後的產物與230m3自來水和澱粉酶(相當於每克粉碎的玉米使用25個酶活力單位的澱粉酶，諾維信公司，α-澱粉酶)混合均勻後，進入噴射器，在95°C、ρΗ為6. 0的條件下酶解100分鐘後得到258m3酶解液。實施例11)向種子罐中投入^m3上述得到的酶解液後，對種子罐的種子培養基進行121°C 滅菌30分鐘，降溫到36°C接入黑麴黴種子，接種量為每毫升酶解液2X IO5個菌落形成單位，在溫度36°C、通氣量為0.3體積(體積 分鐘)的空氣(由第一壓縮機(空氣壓縮機) 提供，壓力0. 23MPa)，罐壓0. IMPa的條件下培養27小時，得到培養成熟的種子液和第一尾氣，將第一尾氣通過帶有濾網(濾網孔徑為Ium)的管網，再通過過濾器後進入第二壓縮機， 控制壓縮後尾氣的壓力為0. 23MPa，並將壓縮尾氣存於儲氣罐中。2)將上述得到的酶解液向發酵罐中投入20m3，其餘的210m3進行過濾後得到的 200m3酶解清液，將該酶解清液投入發酵罐中後，加入37. 5kg尿素。在80°C滅菌IOmin後降溫到38°C，開攪拌、通氣量為0.2體積(體積 分鐘)的空氣(所述空氣壓縮機提供，壓力 0. 23MPa)，接入上述培養成熟的種子液，罐壓控制在0. OSMPa進行發酵生產檸檬酸。來自發酵罐的第二尾氣被引入步驟1)的帶有濾網的管網中，通過過濾器後進入第二壓縮機，控制壓縮後尾氣的壓力為0. 23MPa，並將壓縮尾氣存於儲氣罐中。在發酵16小時時將發酵罐的進氣改為由第二壓縮機提供的壓縮尾氣，通氣量為0. 2體積(體積 分鐘)。發酵罐58小時糖耗盡停止發酵，得到檸檬酸發酵液，該檸檬酸發酵液的酸度、體積、壓縮機電耗見表1。對比例1採用實施例1的方法進行，不同的是在發酵16小時時繼續採用第一壓縮機提供空氣。發酵罐57小時糖耗盡停止發酵，得到檸檬酸發酵液和由第一尾氣和第二尾氣壓縮得到的壓縮尾氣，該檸檬酸發酵液的酸度、體積、壓縮機電耗(不包括壓縮尾氣所消耗的電能) 見表1。實施例21)向種子罐中投入^m3上述得到的酶解液後，對種子罐的種子培養基進行121°C 滅菌30分鐘，降溫到36°C接入黑麴黴種子，接種量為每毫升酶解液IO5個菌落形成單位，在溫度36°C、通氣量為0. 45體積(體積·分鐘)的空氣(由第一壓縮機(空氣壓縮機)提供，壓力0. 23MPa)，罐壓0. IMPa的條件下培養27小時，得到培養成熟的種子液和第一尾氣， 將第一尾氣通過帶有濾網(濾網孔徑為0.5um)的管網，再通過過濾器後進入第二壓縮機， 控制壓縮後尾氣的壓力為0. 23MPa，並將壓縮尾氣存於儲氣罐中。2)將上述得到的酶解液向發酵罐中投入20m3，其餘的210m3進行過濾後得到的 200m3酶解清液，將該酶解清液投入發酵罐中後，加入37. 5kg尿素。在80°C滅菌IOmin後降溫到38°C，開攪拌、通氣量為0. 25體積(體積·分鐘)的壓縮尾氣(該壓縮尾氣為對比例1中得到的壓縮尾氣以及步驟1)中得到的壓縮尾氣，壓力0. 23MPa)，接入培養成熟的種子液，罐壓控制在0. OSMI^a進行發酵生產檸檬酸。來自發酵罐的第二尾氣被引入帶有濾網(濾網孔徑為2um)的管網中，再通過過濾器後進入第二壓縮機，控制壓縮後尾氣的壓力為0.23MPa，並將壓縮尾氣存於儲氣罐中(用於下一次發酵培養)。發酵罐60小時糖耗盡停止發酵，得到檸檬酸發酵液，該檸檬酸發酵液的酸度、體積、壓縮機電耗(包括對比例中壓縮尾氣所消耗的電能)見表1。實施例3採用實施例2的方法進行，不同的是步驟2)中開始通入壓縮尾氣的時間為發酵10 小時時。發酵罐56小時糖耗盡停止發酵，得到檸檬酸發酵液，該檸檬酸發酵液的酸度、體積、壓縮機電耗(包括壓縮種子培養所產生尾氣所消耗的電能)見表1。實施例4採用實施例2的方法進行，不同的是步驟幻中通入的尾氣為發酵培養得到的第二尾氣。發酵罐59小時糖耗盡停止發酵，得到檸檬酸發酵液，該檸檬酸發酵液的酸度、體積、 壓縮機電耗(包括壓縮發酵培養所產生尾氣所消耗的電能)見表1。表 權利要求
1.一種發酵制檸檬酸的方法，該方法包括在通入第一氣體的條件下，將檸檬酸發酵菌接入到種子罐內的種子培養基中進行種子培養後得到種子培養液和第一尾氣，在通入第二氣體的條件下，將種子培養液接入到發酵培養罐內的發酵培養基中進行發酵培養，得到檸檬酸發酵液和第二尾氣，其特徵在於，所述第一氣體為空氣，部分或全部所述第二氣體為所述第一尾氣和/或第二尾氣，且剩餘部分所述第二氣體為空氣。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，以通入的第二氣體的總量為基準，所述第一尾氣和第二尾氣的總量為70-100體積％。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中，通入第二氣體的方式為在發酵培養的前期， 通入空氣，在發酵培養的後期，通入第一尾氣和/或第二尾氣。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述發酵培養的前期為從開始發酵到發酵培養 tl時間之間的時間段，tl與發酵培養總時間t2的比例為1 3-7 ；所述發酵培養的後期為發酵培養tl時間到發酵培養結束之間的時間段。
5.根據權利要求1-4中任意一項所述的方法，其中，第一尾氣和/或第二尾氣中的菌體的含量不超過lOwppm。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的方法，其中，發酵培養罐內的壓力為 0. 06-0. IMPa，第二氣體的通氣量為0. 1-0. 3體積(體積·分鐘)。
7.根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其中，所述發酵培養的條件包括以每毫升發酵培養基為基準，發酵菌的接種量為1 X IO4 1 X IO5個菌落形成單位，培養的溫度為 30-42°C，pH值為1-6，培養的時間為50-65小時。
8.根據權利要求1所述的方法，其中，種子罐內的壓力為0.06-0. IMPa，第一氣體的通氣量為0. 2-0. 5體積(體積·分鐘)。
9.根據權利要求1或8所述的方法，其中，所述種子培養的條件包括以每毫升種子培養基為基準，發酵菌的接種量為1 X IO5 1 X IO6個菌落形成單位，培養的溫度為30-45°C， pH值為2-6，培養的時間為20-40小時。
全文摘要
本發明提供一種發酵制檸檬酸的方法，該方法包括在通入第一氣體的條件下，將檸檬酸發酵菌接入到種子罐內的種子培養基中進行種子培養後得到種子培養液和第一尾氣，在通入第二氣體的條件下，將種子培養液接入到發酵培養罐內的發酵培養基中進行發酵培養，得到檸檬酸發酵液和第二尾氣，其中，所述第一氣體為空氣，部分或全部所述第二氣體為所述第一尾氣和/或第二尾氣，且剩餘部分所述第二氣體為空氣。採用本發明的方法不僅能夠有效利用檸檬酸發酵過程中所產生的尾氣，而且還大大降低了因供氧而增加檸檬酸發酵的能耗，從而降低檸檬酸的生產成本。
文檔編號C12P7/48GK102373243SQ20111034992
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者盧宗梅, 楊儒文, 滿雲, 章輝平, 童麗 申請人:中糧生物化學(安徽)股份有限公司