一種玉米赤黴烯酮降解酶與其編碼基因和應用的製作方法

2023-04-27 07:06:54 1

本發明屬於生物
技術領域：
，具體而言，涉及一種玉米赤黴烯酮降解酶及其編碼基因和應用。
背景技術：
：玉米赤黴烯酮首先是從玉米中分離出來的，是可以由許多鐮孢屬物種產生的一種非甾體雌激素黴菌毒素，作物在收穫前後都會產生。玉米赤黴烯酮總是在包括玉米、大麥、小麥等許多作物和穀類副產品中被發現，尤其是在適合真菌生長的環境中。玉米赤黴烯酮的衍生物有很多，例如玉米赤黴烯醇，它們會通過汙染的作物進入食物鏈並積累在人體和動物體內，對生物造成損害。玉米赤黴烯酮及其衍生物的化學結構類似於天然雌激素，因此它們能夠競爭性地結合雌激素受體，引起外部和內部生殖器改變和繁殖障礙，導致高雌性激素症和不孕症，此類毒素還會刺激乳腺癌細胞系的生長並在小鼠中致癌。鑑於此類毒素的危害，玉米赤黴烯酮等在穀物、食品和飼料中的含量必須低於一定標準。由於玉米赤黴烯酮等是極端穩定的，使用傳統的物理和化學方法去除此類毒素是低效的。為了解決這些問題，降低此類毒素汙染的一個有希望的策略是酶降解。酶降解不僅可以高效地將毒素轉化為無毒性產物，安全環保，而且酶催化反應專一性強、降解效率高，不會破壞穀物的營養物質。迄今為止，已經有一些對於玉米赤黴烯酮降解酶的研究，得到了一些可以降解玉米赤黴烯酮毒素的酶，它們能夠特異性地結合玉米赤黴烯酮並且降解它。但是，目前對篩選得到的微生物中與玉米赤黴烯酮降解相關的酶研究不多。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種玉米赤黴烯酮降解酶及其編碼基因，以及其在水解玉米赤黴烯酮及其衍生物中的應用。為了實現本發明的目的，發明人通過大量試驗研究並不懈努力，最終獲得了如下技術方案：一種玉米赤黴烯酮降解酶，該降解酶具有序列表中seqidno.1所示的胺基酸序列；或該降解酶是在seqidno.1所示的胺基酸序列基礎上缺失、替換、插入或/和添加一個至幾個胺基酸的保守性突變而獲得的保守性變異體。需要說明的是，本發明所提供的玉米赤黴烯酮降解酶是一種內酯水解酶。seqidno.1所示的胺基酸序列由266個胺基酸殘基組成。為了使上述降解酶蛋白質便於純化，可在上述的胺基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。表1標籤的序列標籤殘基胺基酸序列poly-arg5-6(通常為5個)rrrrrpoly-his2-10(通常為6個)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述降解酶蛋白質可以人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述中的蛋白質的編碼基因還可通過將seqidno.1所示的胺基酸序列中，缺失、置換、插入或添加一個至幾個並保持原有酶活性，或者連上表1所示的標籤的編碼序列得到。一種玉米赤黴烯酮降解酶的編碼基因，該基因編碼：(a)具有seqidno.1所示的胺基酸序列的蛋白質；或(b)具有衍生自缺失、置換、插入或/和添加一個至幾個胺基酸的seqidno.1所示的胺基酸序列並具有玉米赤黴烯酮及其衍生物降解活性的蛋白質。還需要說明的是，玉米赤黴烯酮及其衍生物降解活性是指可以切割底物的內酯鍵，隨後產生具有開放側鏈的二羥基苯基衍生物以及釋放二氧化碳，作用於玉米赤黴烯酮、α-玉米赤黴烯醇、β-玉米赤黴烯醇、α-玉米赤黴醇、β-玉米赤黴醇這幾種底物。進一步，所述玉米赤黴烯酮降解酶的編碼基因為(i)、(ii)或(iii)的dna分子：(i)具有seqidno.2所示的核苷酸序列的dna分子；(ii)在嚴格條件下與(i)所述的核苷酸序列雜交且編碼具有玉米赤黴烯酮及其幾種衍生物降解活性的蛋白質的dna分子；(iii)與(i)或(ii)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的dna分子。seqidno.2所示的核苷酸序列由801個核苷酸組成。進一步，所述嚴格條件為鈉離子濃度為50-300mm的溶液中，反應溫度為50-68℃。例如：在進行分子雜交的過程中，可以為在6×ssc、質量分數為0.5％的sds的溶液中，在65℃下雜交,然後用2×ssc，質量分數為0.1％的sds和1×ssc、質量分數為0.1％的sds各洗膜一次。其中sds的中文名稱為十二烷基硫酸鈉，1×ssc包括0.15mol/lnacl和0.015mol/l檸檬酸；sds以及不同濃度倍數的ssc均為本領域的常用試劑。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬於本發明的保護範圍。本發明提供一種重組載體，該重組載體包含上述的玉米赤黴烯酮降解酶的編碼基因。具體的，所述重組載體為將上述任一所述編碼基因插入出發載體(例如：pet28a)的多克隆位點得到的重組表達載體。可用現有的表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。使用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是atg起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。本發明還提供一種轉化體，該轉化體包含上述的重組載體。轉化體可以為重組菌，例如，將上述任一所述編碼基因插入出發載體(例如：pet28a載體)的多克隆位點得到的重組表達載體轉化至大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌。本發明還提供一種引物對，用於擴增上述的玉米赤黴烯酮降解酶的編碼基因全長及其任意片段。例如：引物對的序列如seqidno.3和seqidno.4所示。上述任一所述蛋白質、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組表達載體、所述表達盒、轉基因細胞系或重組菌中的任意一種在降解玉米赤黴烯酮、α-玉米赤黴烯醇、β-玉米赤黴烯醇、α-玉米赤黴醇、β-玉米赤黴醇這幾種底物的應用也屬於本發明的保護範圍。在具體應用的過程中，可以採用下面的方法：以玉米赤黴烯酮、α-玉米赤黴烯醇、β-玉米赤黴烯醇、α-玉米赤黴醇、β-玉米赤黴醇這幾種為底物，在偏鹼性ph條件，利用玉米赤黴烯酮降解酶對玉米赤黴烯酮、α-玉米赤黴烯醇、β-玉米赤黴烯醇、α-玉米赤黴醇、β-玉米赤黴醇進行酶解。所述的酶解條件包括：反應體系的溫度30-40℃，優選為40℃，反應體系的ph值為6.0-9.0，優選為8.0。本發明還提供了一種生產玉米赤黴烯酮降解酶的方法，該方法包括培養上述的轉化體並由培養產物中收集玉米赤黴烯酮降解酶。收集的玉米赤黴烯酮降解酶可以進一步進行純化。與現有技術相比，本發明提供的蛋白具有玉米赤黴烯酮及其幾種衍生物降解活性，屬於玉米赤黴烯酮降解酶。並且該蛋白與其他已表徵的玉米赤黴烯酮降解酶的胺基酸序列相比，相似性不大於65％，屬於一種全新的玉米赤黴烯酮降解酶，為人們降解玉米赤黴烯酮增加了一種新的選擇。本發明所述玉米赤黴烯酮降解酶最適天然底物為玉米赤黴烯酮，且具有在偏鹼性ph條件下活性較高的特性，同時其在不同ph下的穩定性較好。另外，本發明提供的玉米赤黴烯酮降解酶zhd518具有顯著的進步性，還主要體現在以下方面：(1)文獻報導，已經進行表徵的玉米赤黴烯酮降解酶是zhd101，另外兩種是zen-jjm和zlhy-6的玉米赤黴烯酮降解酶的胺基酸序列，其與zhd101的胺基酸一致性為99％和98％，性質基本一致。本發明中的zhd518與zhd101的胺基酸同源性只有65％，確定是一種新型的玉米赤黴烯酮降解酶。另外，已經表徵的玉米赤黴烯酮降解酶zhd101的最適反應溫度是37℃、最適ph為9.5。本發明中的zhd518的最適溫度為40℃、最適ph為8.0,使得它不要求鹼性高的環境。zhd518在溫度為30-40℃的範圍內依然具有60％的酶活，在ph為6.0-9.0的範圍內具有70％以上的酶活。這說明了本發明得到的zhd518具有顯著優勢。(2)本發明提供的玉米赤黴烯酮降解酶zhd518對zen及其四種衍生物都具有降解活性，但降解能力有所差別。結果如下：將稀釋酶液分別在相同濃度(反應體系中底物終濃度為20.0μg/ml)的不同底物條件下進行酶活測定。以玉米赤黴烯酮為底物測得酶活為參比(100％)，以α-玉米赤黴烯醇、β-玉米赤黴烯醇、α-玉米赤黴醇、β-玉米赤黴醇為底物所測相對酶活分別為6.6％、94.9％、32.6％、21.5％。因此，該酶對玉米赤黴烯酮和β-玉米赤黴烯醇的活性比較高，其他次之。附圖說明圖1為玉米赤黴烯酮降解酶zhd518蛋白純化前後的sds-page電泳圖。圖2為玉米赤黴烯酮降解酶zhd518的活性隨溫度的變化的結果。圖3為玉米赤黴烯酮降解酶zhd518的活性隨ph的變化的結果。圖4為玉米赤黴烯酮降解酶zhd518的活性在不同溫度下的穩定性。圖5為玉米赤黴烯酮降解酶zhd518的活性在不同ph下的穩定性。具體實施方式以下結合附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、蛋白及基因的製備與純化1、基因序列的人工合成seqidno.2所示的核苷酸序列委託武漢金開瑞生物工程有限公司按照本領域的常規技術進行基因人工合成，基因插入質粒載體puc57中，保存，備用。2、基因序列的擴增根據seqidno.2所示的核苷酸序列設計引物對如下：正向引物：5′-cgcggatccatggccgctacacgtacacgagg-3′，如seqidno.3所示；反向引物：5′-ccgctcgagctatttcaaatacttccgactcg-3′，如seqidno.4所示；正向引物的下劃線部分為bamhi的酶切位點，反向引物的下劃線部分為xhoi酶切位點。pcr反應體系：10×緩衝液5μldntp4μlextaqdna聚合酶0.5μl正向引物1μl反向引物1μl模板0.5μl水38μlpcr反應條件：94℃預變性5min，然後94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環，最後72℃延伸10min。pcr產物用質量分數為0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測產量和特異性，並用dna純化試劑盒(超薄離心柱型，天根公司生產)純化。將純化的pcr產物進行測序，結果表明pcr產物的序列包括seqidno.2所示1-801位，並將其命名為zhd518dna片段。3、重組表達載體的構建1)將上述測序正確的pcr產物用bamhi和xhoi雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切產物。2)將質粒pet28a(cat.n069864-3,novogen)用bamhi和xhoi雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切產物。3)將步驟1)的酶切產物和步驟2)的酶切產物進行連接，連接產物電擊轉化大腸桿菌dh5α後塗布於含有50μg/ml卡那黴素的lb平板，37℃過夜培養，將得到的轉化子用上述的正向引物和反向引物進行菌落pcr，篩選到含有zhd518基因的重組菌，提取重組菌的質粒，進行測序驗證，結果表明，在pet28a的bamhi和xhoi酶切位點之間插入了zhd518dna片段，該片段包括seqidno.2的自5′端起第1至801位的核苷酸，插入方向正確，將該重組質粒命名為pet28a-zhd518。4、工程菌的製備將質粒pet28a-zhd518電擊轉化大腸桿菌bl21(de3)(cat.n0cd601,全式金公司)後塗布於含有50μg/ml卡那黴素的lb平板，37℃過夜培養，得到含有質粒pet28a-zhd518的工程菌，記作bl21/pet28a-zhd518。用pet28a代替pet28a-zhd518，轉化大腸桿菌bl21(de3)，步驟同上，得到含有pet28a的重組菌，作為對照菌。將轉入bl21(de3)的陽性重組菌記作bl21/pet28a。5、目標蛋白的表達和純化his60nisuperflowresin純化柱購自takara公司，產品目錄號為635660。gehitrapdesalting純化柱購自gehealthcare公司，產品目錄號分別為17-1408-01、17-5053-01。將上述步驟4製備的陽性重組菌bl21/pet28a-zhd518培養於含有50μg/ml卡那黴素的lb培養基中，37℃培養3h；od600＝0.7時，加入iptg至其在lb培養基中的終濃度0.8mm，轉至18℃繼續培養16h。在3800rpm、15min條件下離心收集菌體，懸浮於pbs溶液(50mmtris-hcl，ph7.4，0.5mnacl)中，於冰浴中超聲破碎(60w，10min；超聲1s，停止2s)，之後12000rpm離心10min除去細胞碎片，取上清液；將上清液過his60nisuperflowresin純化柱，用5ml超純水衝洗，再用10ml溶液a(50mmtris-hcl，ph8.0，25mm咪唑)漂洗，最後用5ml溶液b(50mmtris-hcl，ph8.0，500mm咪唑)洗脫，收集洗脫液。然後將洗脫液用脫鹽柱gehitrapdesalting進行脫鹽處理，用溶液c(50mmtris-hcl，ph8.0)進行洗脫，得到zhd518純酶液。將步驟4製備的對照菌採用相同的步驟進行培養和純化，得到的溶液作為對照酶液。sds-page電泳顯示純化的zhd518蛋白的分子量約為29kda，符合理論推斷的29.4kda。結果如圖1所示，圖1中，泳道m表示蛋白分子量標準(250,150，100,75,50,37,25kda)；泳道1表示大腸桿菌bl21/pet28a-zhd518破菌後的上清液；泳道2表示ni-nta柱純化後的zhd518蛋白；泳道3表示gedesalting脫鹽柱純化後的zhd518蛋白。可以看出已經獲得了zhd518蛋白。同時進行了對照組的實驗，但對照菌並沒有得到目的蛋白。實施例2、以玉米赤黴烯酮為底物驗證蛋白功能酶活單位定義為1min內降解1μg底物玉米赤黴烯酮所需要的酶量作為一個酶活單位u。(一)最適溫度用ph8.0的50mmtris-hcl緩衝液稀釋實施例1的步驟5中的zhd518純酶液，用稀釋後的酶液進行酶活測定。將稀釋後的酶液記作稀釋酶液。溶液a組成：由50mm，ph8.0tris-hcl緩衝液和玉米赤黴烯酮溶液組成；底物玉米赤黴烯酮在反應體系0.5ml中的終濃度為20.0μg/ml。實驗組：活性測定反應體系為0.5ml，由0.45ml溶液a和0.05ml稀釋酶液；反應體系的ph值為8.0；反應體系在特定溫度範圍(20-55℃)內溫育10min後，0.5ml色譜級甲醇終止反應，冷卻後使用高效液相色譜儀(hplc)測定底物降解量。結果如圖2所示。圖2表明，玉米赤黴烯酮降解酶具有降解玉米赤黴烯酮的活性。在40℃條件下，玉米赤黴烯酮降解酶具有最高的酶活性；將此溫度下的酶活反應體系的底物玉米赤黴烯酮降解量作為相對活性100％，其他溫度下酶活反應體系的底物玉米赤黴烯酮降解量與此最高酶活體系的底物玉米赤黴烯酮降解量的比值作為相對活性。在30-40℃條件下均具有60％以上的活性。對照組：以對照菌bl21/pet28a獲得的蛋白(記作對照酶液)進行上述實驗，結果不管在哪個溫度條件下，對照酶液都沒有降解玉米赤黴烯酮的活性。實驗設3次重複，結果一致。(二)最適ph如下各組中的稀釋酶液均是用各組中的緩衝液稀釋實施例1的步驟5中的zhd518純酶液得到的。實驗組：活性測定反應體系為0.5ml，分別由0.45ml溶液b(b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7、b8、b9、b10、b11、b12、b13、b14和b15)和0.05ml稀釋酶液組成，底物玉米赤黴烯酮在反應體系0.5ml中的終濃度為20.0μg/ml。溶液b1的組成：50mmglycine-hcl緩衝液和底物玉米赤黴烯酮組成；溶液b1的ph值為2.0。溶液b2的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為0.2mna2hpo4-檸檬酸緩衝液。溶液b2的ph值為3.0。溶液b3的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為0.2mna2hpo4-檸檬酸緩衝液。溶液b3的ph值為4.0。溶液b4的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為0.2mna2hpo4-檸檬酸緩衝液。溶液b4的ph值為5.0。溶液b5的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為0.2mna2hpo4-檸檬酸緩衝液。溶液b5的ph值為6.0。溶液b6的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為0.2mna2hpo4-檸檬酸緩衝液。溶液b6的ph值為7.0。溶液b7的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為0.2mna2hpo4-檸檬酸緩衝液。溶液b7的ph值為7.5。溶液b8的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為50mmtris-hcl緩衝液。溶液b8的ph值為7.5。溶液b9的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為50mmtris-hcl緩衝液。溶液b9的ph值為8.0。溶液b10的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為50mmtris-hcl緩衝液。溶液b10的ph值為8.5。溶液b11的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為50mmtris-hcl緩衝液。溶液b11的ph值為9.0。溶液b12的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為50mmglycine-naoh緩衝液。溶液b12的ph值為9.0。溶液b13的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為50mmglycine-naoh緩衝液。溶液b13的ph值為9.5。溶液b14的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為50mmglycine-naoh緩衝液。溶液b14的ph值為10.0。溶液b15的組成：與溶液b1的組成相同，不同的是將50mmglycine-hcl緩衝液替換為50mmglycine-naoh緩衝液。溶液b15的ph值為11.0。將反應體系在40℃溫育10min後，加入0.5ml色譜級甲醇終止反應，冷卻後使用高效液相色譜儀(hplc)測定底物降解量。實驗設三次重複。結果如圖3所示。玉米赤黴烯酮降解酶在ph為3.0至10.0之間的條件下均具有水解玉米赤黴烯酮的活性，即可以降解玉米赤黴烯酮。圖3表明玉米赤黴烯酮降解酶在ph8.0條件下具有最高酶活性。以此最高酶活性體系的底物玉米赤黴烯酮降解量作為相對活性100％，其它反應體系的底物玉米赤黴烯酮降解量與此最高酶活性體系的底物玉米赤黴烯酮降解量的比值作為各自的相對活性。在ph6.0-ph9.0條件下均具有70％以上的活性。對照組：以對照菌bl21/pet28a獲得的蛋白(記作對照酶液)進行上述實驗，結果不管在哪個ph條件下，對照酶液都沒有降解玉米赤黴烯酮的活性。實驗設3次重複，結果一致。(三)酶熱穩定性用ph8.0的50mmtris-hcl緩衝液稀釋實施例1的步驟5中的zhd518純酶液，用稀釋後的酶液以玉米赤黴烯酮為底物進行酶活測定。將稀釋後的酶液記作稀釋酶液。將稀釋酶液分別在20℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃水浴放置10分鐘，測定酶的殘餘活性。結果顯示，酶在20℃至40℃穩定，在45℃處理10分鐘喪失80％活性。(四)ph耐受性將稀釋酶液分別在ph2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0條件下,溫度4.0℃條件下放置16h後，以玉米赤黴烯酮為底物測定殘餘酶活。結果顯示ph6.0-10.0條件下仍然殘留60％以上的相對酶活。說明該酶具有良好的ph耐受性。(五)底物特異性將稀釋酶液分別在相同濃度(反應體系中底物終濃度為20.0μg/ml)的不同底物條件下進行酶活測定，底物分別為玉米赤黴烯酮、α-玉米赤黴烯醇、β-玉米赤黴烯醇、α-玉米赤黴醇、β-玉米赤黴醇。以玉米赤黴烯酮為底物測得酶活為參比(100％)，以α-玉米赤黴烯醇、β-玉米赤黴烯醇、α-玉米赤黴醇、β-玉米赤黴醇為底物所測相對酶活分別為6.6％、94.9％、32.6％、21.5％。因此，該酶對玉米赤黴烯酮和β-玉米赤黴烯醇的活性比較高。實施例3、以β-玉米赤黴烯醇為底物驗證蛋白功能酶活單位定義為1min內降解1μg底物玉米赤黴烯酮所需要的酶量作為一個酶活單位u。如下所述的稀釋酶液是用50mmtris-hcl緩衝液稀釋實施例1的步驟5中的zhd518純酶液得到的。實驗組：以β-玉米赤黴烯醇為底物(底物在反應體系中的終濃度為20.0μg/ml),活性測定反應體系為0.5ml，由0.45ml底物溶液和0.05ml稀釋酶液；反應體系的ph值為8.0；反應體系在最適溫度40℃下反應10min後，0.5ml色譜級甲醇終止反應，冷卻後使用高效液相色譜儀(hplc)測定底物降解量。實驗設三次重複，結果一致。結果顯示在40℃、ph8.0條件下，以β-玉米赤黴烯醇為底物所測酶活為823u/mg。以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。sequencelisting湖北大學一種玉米赤黴烯酮降解酶與其編碼基因和應用4patentinversion3.51266prt人工序列1metalaalathrargthrargglytyrvalthrthrlysaspglyile151015lystrptyrtyrgluglngluglyserglyproaspvalvalleuile202530proaspglyleuglyglucysglnmetpheasplysprometserleu354045ilealaserasnglypheargvalthrthrpheaspmetproglymet505560serargserseraspalaproprogluthrtyrglnaspilethrgly65707580arglysleualaglytyrileilethrleuleuaspthrleuaspile859095lysilealaservaltrpglycysserserglyalaserthrvalleu100105110alaleucysserasptyrprogluargvalargasnglymetprohis115120125gluvalprothrgluasnproaspileleuleuhisilehisgluval130135140aspproalathrileserglnglumetalaalaasnserargalatyr145150155160serglyasnvalglualatrpaspalaleuglyprogluvalhisala165170175argleuhisaspasntyrproargtrpalatyrglytyrproargthr180185190ileproproseralaprovallysthrgluaspleuhislysvalpro195200205ileasptrpthrvalglyalaserthrprothrlysleuphepheglu210215220asnilevalilealaalaarggluglyileasnileglythrleupro225230235240glyasnhispheprotyrvalserhisproglugluphealalystyr245250255valvalgluthrserarglystyrleulys2602652801dna人工序列2atggccgctacacgtacacgaggatatgttaccactaaaga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