蛋白酶體激活性肽水解產物和含有其的組合物的製作方法

2023-04-27 17:09:01

專利名稱：蛋白酶體激活性肽水解產物和含有其的組合物的製作方法
蛋白酶體激活性肽水解產物和含有其的組合物本發明涉及抗老化活性成分及其用途的領域，特別是在化妝品中。更具體地，本發明涉及肽水解產物，其富集有生物活性肽，所述水解產物為蛋白酶激活劑，以及涉及其在化妝和/或製藥中的用途，其用於預防和/或糾正老化的影響和皮膚、指甲、毛髮的光老化，保護皮膚對抗UV輻射的侵襲。老化相當於一系列生理和心理過程，其從某一年齡起改變生物體的結構和功能。 老化可分為兩種類型一方面是內在性老化，另一方面是外在性老化。內在性老化是由於遺傳因素，以及由於在疲乏或有壓力時、或在諸如懷孕等激素改變進程期間發生的生化修飾。 外在性老化是由於生物體在生命中所暴露於環境因素，諸如汙染、陽光、疾病等。其是一個緩慢漸進的過程，在不同程度影響生物體所有細胞，並以不同方式自我顯現。作為例子，皮膚的外表被不同種類的內在或外在的侵襲所改變；皺紋和細紋，色素沉著過多或色素沉著過少的瑕疵、乾燥甚或皮膚脫水、表皮變薄、彈性組織變性、瑕疵、老年斑等可因此出現。所有這些改變不僅影響皮膚，也影響指甲和毛髮，諸如手指甲和頭髮。這些改變是由於細胞更新功能、細胞粘附、膠原蛋白合成、彈性蛋白合成和其它蛋白的合成的變化，並最終導致皮膚保護屏障質量的衰減和其美感外觀的降低。然而，對細胞老化負責的一個主要過程毫無疑問是在那些細胞中積累的受損蛋白。事實上，這些蛋白是各種異常翻譯後修飾的靶標，諸如氧化、糖化、與源自脂質過氧化作用物質的偶聯，或現象，其發生率隨年齡而大大增加。已知自由基在老化過程中起重要作用，更具體地是在氧化受損蛋白的形成中起重要作用° (Harman et al. "Aging :a theory based on free radical and radiation chemistry "J. Gerontol.，11，298-300)。受損蛋白的積累因此導致負責清除這些蛋白的蛋白水解系統效率的問題，尤其是蛋白酶體系統的效率，其不僅涉及清除改變的蛋白，特別通過氧化，而且也涉及細胞間蛋白的持續更新。泛素-蛋白酶體途徑在許多生物學過程中起基本作用。通過蛋白酶體的蛋白降解機制事實上涉及了主要的細胞機制，諸如DNA修復、基因表達控制、細胞周期調節、新合成蛋白質量的控制、凋亡或免疫應答(Glickman and Ciechanover，2002)。人細胞中存在的蛋白酶體是存在於細胞質和核中的大尺寸的多蛋白複合物。純化形式的蛋白酶體包含兩個主要亞基被稱為20S蛋白酶體的蛋白水解核；和19S調節複合物，其結合於 20S 蛋白酶體的兩端(Coux et al.，1996 ；Glickman and Coux，2001)。20S 蛋白酶體是中空圓柱體形式的顆粒，由觀個α和β亞基組成，分布於4個七元環中。肽酶活性存在於圓柱體內表面，具有變構影響。三種蛋白水解活性(胰蛋白酶、糜蛋白酶和半胱天冬蛋白酶樣)與20S蛋白酶體相關，並一起作用以將蛋白分解成含有3到20個胺基酸的無活性肽。除20S蛋白酶體外，26S蛋白酶體包含由大約20個亞基構成的0. 7MDa的19S複合物。最近的免疫純化研究顯示，其它蛋白可能與20S蛋白酶體和19S蛋白酶體相關(例如IlS調節複合物)。近年進行的研究將老化與蛋白酶體活性相關聯。雖然被氧化的蛋白積累隨年齡增加，但觀察到了蛋白酶體系統效率的衰減(Petropoulos et al.，J. Gerontol. A. Biol. Sci. 2000, 55A :B220-7)。這一蛋白酶體系統效率的衰減事實上是源於蛋白酶體質量的降
4低。這些結果由那些通過關於比較百歲老人和年輕個體細胞內蛋白酶體質量和活性的研究所證實(Chondrogianni et al.，Exp. Gerontol. 2000 ；35 :721-8)。這些和其它許多研究清楚地顯示了老化和蛋白酶體活性間的聯繫，並可以推斷，誘導皮膚或指甲或毛髮細胞中蛋白酶體的表達，可能對老化有正面影響或甚至可將其延緩。出於預防或延緩老化的目的，提出了基於自然提取物的化妝組合物一個例子是專利FR 2 822 701，其公開了基於褐指藻屬藻類提取物的組合物用於促進蛋白酶體活性。 此外，專利申請FR 2 898 808描述了包含微藻類和精氨酸阿魏酸鹽提取物的組合物的用途，也是激活蛋白酶體。其它組合物包含化學化合物，其能夠調控蛋白酶體的活性以具有抗老化效果。這些組合物在專利申請WO 2006/105811或WO 2005/061530中有描述。然而， 所提出的肽類型化合物很大，並難以在化妝領域以其自身來使用。因此有必要，尤其在化妝品產業中，從自然提取物中獲得有效的具有小型活性成分的新混合物，用於其作為具有抗老化效果的蛋白酶體激活劑的用途。因此，本申請人發現了肽水解產物，其富集有生物活性肽，能夠激活蛋白酶體，因此可用於預防和/或治療皮膚老化和光老化跡象以及由於UV輻射的侵襲。因而，本發明在第一方面提出了蛋白酶體激活劑肽水解產物，其富含生物活性肽， 所述生物活性肽有小於6kDa的分子量，含有3到5個胺基酸，每種生物活性肽包含至少一個天冬氨酸殘基、一個半胱氨酸殘基和一個精氨酸殘基。在第二方面，本發明提出了包含所述富集的肽水解產物作為活性成分的化妝組合物。另外，在第三方面，本發明提出了包含所述富集的肽水解產物的化妝組合物的用途，其用於預防和/或治療皮膚老化和光老化跡象，以及用於改善蛋白酶體對受損蛋白的降解。最後，在第四方面，本發明提出了用於對要治療的皮膚、指甲或毛髮進行化妝治療的方法，其使用包含所述富集的肽水解產物的組合物。附

圖1顯示了通過HPLC獲得的色譜圖的例子，鑑定出相應於玉米水解產物中的生物活性肽的峰。附圖2顯示了通過HPLC獲得的色譜圖的例子，鑑定出相應於豌豆水解產物中的生物活性肽的峰。附圖3顯示了通過HPLC獲得的色譜圖的例子，鑑定出相應於水稻水解產物中的生物活性肽的峰。附圖4顯示了通過HPLC獲得的色譜圖的例子，鑑定出相應於釀酒酵母水解產物中的生物活性肽的峰。在第一方面，本發明涉及蛋白酶體激活劑肽水解產物，其富集有多種生物活性肽， 所述生物活性肽有小於6kDa的分子量，含有3到5個胺基酸，每種生物活性肽包含至少一個天冬氨酸殘基、一個半胱氨酸殘基和一個精氨酸殘基。術語「肽水解產物」指的是主要由肽或寡肽所代表的化合物的混合物。術語「生物活性肽」指的是由經修飾或未修飾的肽鍵互相連接的至少3個胺基酸連接所組成的蛋白片段，且其具有作為蛋白酶體激活劑的活性。它們以非活性形式存在於蛋白中，並在那些蛋白水解後變成有活性。
本發明所述的富集的肽水解產物特徵在於，其是蛋白酶體激活劑。
肽水解產物(和/或生物活性肽)，其是「蛋白酶體激活劑，，表示任何肽水解產物或生物活性肽或衍生物，其能夠提高蛋白酶體的活性，或通過增加蛋白酶體亞基的蛋白合成(通過直接或間接調控基因表達)，或通過其它生物過程，如使構成蛋白酶體的亞基穩定或使RNA信使轉錄物穩定。本發明中富集的肽水解產物特徵在於，其能激活蛋白酶體對受損蛋白的降解。「損壞的蛋白」理解為是指因活性氧(自由基)而經氧化反應的蛋白、由脂質過氧化作用產生的產物所糖化或偶聯的蛋白等。優選地，肽水解產物富集有生物活性肽，其具有通式(I)X1- [Asp, Cys, Arg] -X2其中X1是天冬醯胺、賴氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、精氨酸或不存在；X2是組氨酸、賴氨酸、精氨酸或不存在。優選地，肽水解產物富含生物活性肽，具有下式(SEQ ID n°l) Arg-Asp-Cys-Arg-Arg(SEQ ID n02) Asn-Asp-Cys-Arg-Lys(SEQ ID n°3) Asp-Cys-Arg-Hi s(SEQ ID n°4) Val-Asp-Cys-Arg(SEQ ID n°5) Asp-Cys-Arg這些肽已被鑑定為特別具有作為蛋白酶體激活劑的活性，並由此作為增亮劑而受到特別關注。本發明的富集的肽水解產物可從各種蛋白來源獲得，不論動物或植物來源。根據第一個實施方案，富集的肽水解產物來自於植物的水解，所述植物選自玉米(Zea mayz L.)、豌豆(Pisum sativum)、或水稻(Oryza sativa L.)。優選所使用的植物此前未經發酵。在第二個實施方案中，富集的肽水解產物來自酵母屬(Saccharomyces)酵母的水解，更具體地是來自釀酒酵母種的水解。因此，本發明可通過使用來自玉蜀黍屬的多種植物中的一種的種子來進行，優選玉米。依照本發明，所使用的植物原料是種子，並且優選種子的外殼已經通過去殼步驟而去除。本發明也可通過使用豌豆科(豆科Fabaceae)的許多植物中的一種來進行。例如，可使用豌豆種的植物豌豆(Pisum sativum L)。術語豌豆也表示種子，其自身富含蛋白 (25% )。來自水稻科(禾本科Poaceae)、特別是來自稻屬(Oryza)、更優選的是水稻(Oryza sativa L)種的植物可被使用來實現本發明的水解產物。所使用的植物原料是種子，並且優選種子的外殼已經通過去殼步驟而去除。最後，本發明也可通過使用酵母屬的酵母來進行，並優選地是釀酒酵母種的酵母。任何本領域技術人員已知的用於提取或純化的方法，均可被使用以製備本發明的水解產物。在第一個步驟中，使用植物研磨機將種子或植物的特定部分(葉、塊莖、根等)研
6磨。由此獲得的粉末可隨後使用常規的有機溶劑(例如酒精、己烷或丙酮)而進行去脂化。對酵母，在第一個步驟中，將酵母在適合於其發育的培養基中以常規方式培養，優選是有乳糖存在。酵母通過離心收穫，並接著懸浮於緩衝液中，優選磷酸鹽緩衝液。在第二個步驟中，用弗氏細胞壓碎器(French press)或球型研磨器來使細胞破裂，大部分不可溶的膜組分通過離心或過濾而除去。然後，依照修改過的常規方法(Osborne，1924)來提取蛋白；將植物研磨過的原料或酵母溶解產物懸浮於含有不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)類型(0.01-20%)吸附產物的鹼性溶液中；事實上，發現此方法可以促進隨後的水解和純化操作。特別是與蛋白相互作用的苯酚型物質的濃度顯著降低。在離心和過濾步驟之後，收集含有蛋白、碳水化合物和可能的脂類的可溶性部分。 隨後將此粗溶液在受控條件下水解以產生可溶性肽。水解被定義為涉及通過水切割分子的化學反應，此反應可在中性、酸性或鹼性介質中完成。依照本發明，水解是通過化學方式和/ 或有利地使用蛋白水解酶來進行。可引用的有使用植物來源的內切蛋白酶(木瓜蛋白酶、 波羅蛋白酶、無花果蛋白酶)和微生物(麴黴Aspergillus、根黴lihizopus、桿菌kicillus 等)。選擇水解條件，以促進生物活性肽的富集。基於上述同樣的原因，即消除多酚類物質，將一定量的聚乙烯聚吡咯烷酮在此受控的水解步驟中加入到反應介質中。過濾後，將酶和多聚物除去，獲得首份濾液。此階段獲得的水解產物可再次純化以選擇低分子量的部分，優選小於6kDa的部分，且肽依其性質而產生。為了特異地富集水解產物中的生物活性肽，可以通過在孔隙率遞減的過濾器中經連續的超濾步驟而有利地進行純化，這是通過保留每一步的濾液和/或通過色譜類型的方法。然後本發明在水中或任何含有水的混合物中的進行稀釋階段，並隨後通過超濾滅菌以獲得富集的肽水解產物，其特徵在於蛋白含量為0. 5至5. 5g/l。此富集的肽水解產物相應於本發明活性成分最純化的形式。依照本發明獲得的肽水解產物在高效液相色譜(HPLC)中進行定量和定性分析， 使得能夠分析分子量為0.2至25kDa的蛋白(依照合適的溶劑梯度)。隨後分析能被分離的不同肽部分的生物效能。接著通過質譜分析這些不同的部分，以特異地從每個峰鑑定肽的胺基酸含量。也進行了序列分析，以確定生物活性肽的肽序列。最後，所獲得的富集的肽水解產物由分子量小於6kDa的肽組成，並富含具有3到 5個胺基酸的生物活性肽，包含至少一個天冬氨酸殘基、一個半胱氨酸殘基和一個精氨酸殘基。本發明的此肽水解產物，富集有生物活性肽，也可被用作藥物。在第二方面，本發明涉及化妝組合物，其包含如前所述的富含生物活性肽的肽水解產物作為活性成分。優選地，本發明的組合物以包含化妝可接受介質的適於局部使用的形式存在。「化妝可接受」理解為是指介質適用於與皮膚或人的上皮附屬物接觸，沒有毒性、不相容性、不穩定性、過敏反應或其它副作用的風險。優選所述肽水解產物在組合物中以佔組合物總重量0. 0001%到20 %的量存在，優選以佔組合物總重量0. 05 %到5 %的量存在。在本發明的組合物中，將富含生物活性肽的肽水解產物溶解於一種或多種溶劑中，如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一縮二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、環多元醇、凡士林、植物油、或這些溶劑的任意混合物。按照另一有利的實施方案，將本發明的肽水解產物溶解在化妝或藥物載體如脂質體中，或將其吸附至粉末狀有機多聚物、礦物質支持物如華視和皂粘土上，而更常見的是溶解於或固定至任何生理可接受的載體。要應用於皮膚的組合物可以如下形式存在，水或水醇溶液、油包水乳劑或水包油乳劑、微乳劑、含水或無水凝膠、漿液、囊泡分散物、貼片、乳霜、噴霧、軟膏、潤髮油、洗劑、膠體、溶液、懸浮液或其它形式。組合物也可以洗髮劑、染髮劑或要用刷子或梳子應用的睫毛膏的形式而應用於上皮附屬物，尤其是睫毛、眉毛或毛髮上，或指甲的處理如指甲油。在特定實施方案中，本發明的組合物還含有促進所述富集的肽水解產物作用的至少一種其它活性成分。可以非限制性的方式引用的成分的例子有肽激活劑、其它植物提取物、修復劑、抗老化劑、抗皺紋劑、撫慰劑、自由基清除劑、UV遮蔽劑、促進皮膚大分子合成或能量代謝的物質、增溼劑、抗菌劑、抗真菌劑、抗炎性物質、麻醉劑、調節皮膚分化或色素沉著或皮膚脫色素的物質、和促進指甲或毛髮生長的物質等。優選使用具有抗皺紋活性的物質，諸如自由基清除劑或抗氧化劑，或促進皮膚大分子合成的物質、或促進能量代謝的物質。更特別地，活性成分選自維生素、植物留醇、類黃酮、DHEA和/或其一種前體或化學或生物學衍生物、金屬蛋白酶抑制劑、或類視黃醇。此外，添加劑諸如增稠劑、乳化劑、溼潤劑、 潤滑劑、芳香劑、抗氧化劑、成膜劑、螯合劑、多價螯合劑、包裝劑等可被添加到組合物中。在所有情況下，本領域技術人員會挑選這些佐劑以及它們的比例，以確保不會損害本發明組合物所期待的優勢特性。例如，這些佐劑可佔組合物總重量的0. 01%到20%。 當本發明的組合物是乳劑時，脂相可佔組合物總重量的5%到80%，優選佔組合物總重量的5%到50%。組合物中使用的乳化劑和輔-乳化劑可選自本領域中常規使用的那些。例如，它們可以組合物總重量的0. 3%到30%來使用。最後，本發明涉及組合物，其包含所述肽水解產物以增加蛋白酶體活性和改善蛋白酶體對受損蛋白的降解。在第三方面，本發明涉及涉及包含所述富集的肽水解產物和化妝可接受介質的化妝組合物的用途，其用於預防和/或治療皮膚老化和光老化跡象。「皮膚老化跡象」包括但不限於任何由老化導致的在皮膚可見的表現。這特別是指皺紋、深紋和粗紋、細紋、裂紋、皮膚和皮下組織的鬆弛、皮膚彈性和張力的喪失、緻密性和皮膚緊張性的喪失、以及真皮萎縮。另外，術語「皮膚老化跡象」指的是毛孔增大、瑕疵、變色、老年斑、角化病、膠原蛋白的喪失，和其它真皮和表皮的變化，還有因老化而對皮膚、指甲和毛髮外觀的任何改變，諸如例如角質層表面租糙，還有任何對皮膚的內在改變，其非全身性地導致改變的外觀，諸如皮膚變薄。術語「光老化」指的是累積地長時間暴露於太陽所導致的皮膚過早老化。因此本發明涉及組合物的用途，其用於治療或預防皺紋、深紋和粗紋、細紋、裂紋、 皮膚和皮下組織的鬆弛、皮膚彈性和張力的喪失、緻密性和皮膚緊張性的喪失、和真皮萎縮。另一方面，本發明涉及本發明的組合物用於保護皮膚對抗UV輻射侵襲的用途。最後，本發明涉及組合物的用途，其用於增加蛋白酶體的活性，並改善蛋白酶體對受損蛋白的降解。最後，本發明涉及化妝治療方法，其由如下所組成將包含有效量的本發明富集的肽水解產物的組合物局部應用到皮膚，以預防和/或治療皮膚老化或光老化跡象。此外，此化妝治療方法可在睡前應用，以在細胞更新循環期間清理皮膚細胞。事實上，在夜間，皮膚優先進行更新功能和代謝合成過程。因而，以尊重皮膚生物學節律的方式應用所要求保護的組合物意味著能獲得促進細胞再生的年輕化和再生效果。以下實施例描述並證明了本發明所述的肽化合物的有效性，但不應被理解為是對本發明的限制。實施例1 從玉米粉(Zea mays L.)中製備肽水解產物將玉米粉(Zea mays L.)溶解在10體積的含2% P0LYCLAR 10 (聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)的水中。混合物使用IM氫氧化鈉水溶液調節PH至6-8範圍內。調節pH後，將2%的木瓜蛋白酶加到反應介質中。在55°C攪拌2小時後完成水解。 然後，通過加熱溶液到80°C，2小時將酶滅活。離心後，回收上清的水溶液，相當於玉米粗水解產物。選擇特定的水解條件，以使得含有3到5個胺基酸包含至少一個天冬氨酸殘基、一個半胱氨酸殘基和一個精氨酸殘基的生物活性肽能夠富集。粗水解產物純化的方法始於使用孔隙率遞降(到0. 2 μ m)的kitz-Orion過濾板的成功過濾，以獲得透明澄清的黃色溶液，稱為水解產物1。在這一步，玉米水解產物1的特徵在於固體殘餘物含量測定為20-30g/kg，蛋白含量為20-25g/l和糖含量為2_5g/l。水解產物1的蛋白性質在NuPAGE Bis-1Tris預置聚丙烯醯胺凝膠(Invitrogen) 電泳分析後被鑑定。玉米蛋白水解產物在NuPAGE LDS樣品製備緩衝液的還原變性條件下被加熱到70°C，10分鐘。蛋白遷移在NuPAGE MES遷移緩衝液中使用keBlue Plus2 standard作為分子量標記來完成。蛋白染色使用Coomassie Blue R-250來完成。在這些條件下，觀察到獲得的蛋白具有小於6kDa的分子量。水解產物1隨後通過Pellicon 2BiomaX 5kDa盒超離心來進行純化，以排除高分子量蛋白，僅保留小於5kDa的肽性質的化合物。在此最終純化後，完成稀釋階段以獲得肽水解產物，其特徵在於蛋白含量在3. 5 到5. 5g/l範圍內。此肽水解產物相當於本發明的活性成分。此肽水解產物隨後使用Chen^tation軟體控制輔助有HP 1100部件的高效液相色譜(HPLC)來進行分析。水解產物洗脫期間使用的柱子是Nucleosil 300-5 C4 MPN(125x4mm)柱，其允許分子量為0. 2到25kDa的蛋白在以下條件下被色譜分析-甲醇梯度-Uptisphere OPB 125x3mm 柱-溶劑A含有0. 1 %七氟丁酸(HFBA)的HPLC級水-溶劑B含有0. 1 %七氟丁酸(HFBA)的HPLC級甲醇-梯度35分鐘內溶劑A從100%到15%。通過HPLC(高效液相色譜)鑑定相當於生物活性肽峰的色譜例子在附圖1中給
出ο這些不同的部分隨後通過質譜進行分析，以特異地鑑定每個峰的肽的胺基酸含量。也進行了序列分析以確定生物活性肽的肽序列。
實施例2:從豌豆(Pisum sativum L.)中製備富含牛物活件肽的肽水解產物肽水解產物從豌豆種植物的提取物中獲得。顯然，提取物可以從至少任何一種屬於豌豆屬的眾多變種和種的植物中製備。第一步中，Ikg去殼的豌豆通過有機溶劑己烷的作用去脂。將如此獲得的豌豆粉溶解在10體積的含2% P0LYCLAR 10(聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)的水中。混合物使用IM氫氧化鈉水溶液調節PH在6-7範圍內。調節pH後，將2%的flavourzym 加到反應介質中。在50°C攪拌2小時後完成水解。然後，通過加熱溶液到80°C，2小時是酶滅活。從而獲得反應混合物相當於豌豆提取物。選擇特定的水解條件，以使得含有3到5個胺基酸包含至少一個天冬氨酸殘基、一個半胱氨酸殘基和一個精氨酸殘基的生物活性肽能夠富集。純化方法始於使用孔隙率遞降(到0. 2μπι)的kitz-Orion過濾板的成功過濾，以獲得透明澄清的溶液。在這一步，豌豆水解產物的特徵在於固體殘餘物含量測定在 70-80g/kg，蛋白含量為55-65g/l，糖含量為2_5g/l和多酚含量在l_3g/l。此水解產物的蛋白性質通過聚丙烯醯胺凝膠電泳來進行鑑定。對於此分析，使用 NuPAGE Bis-Tris預置聚丙烯醯胺凝膠(Invitrogen)。豌豆蛋白水解產物在NuPAGE LDS 樣品製備緩衝液的還原變性條件下被加熱到70°C，10分鐘。蛋白遷移在NuPAGE MES遷移緩衝液中使Plus2 standard作為分子量標記完成。蛋白染色使用Coomassie Blue R-250完成。在這些條件下，管產到2個大的蛋白家族第一個家族相當於分子量在 20到25kDa的蛋白，後一家族是分子量小於5kDa的蛋白。此溶液隨後使用正切流動過濾來純化，以排除分子量大於5kDa的蛋白。為了此目的，將豌豆水解產物在壓力下泵入有Pellicon 2 Biomax 30kDa盒的Pellicon 支持物。 此第一濾液被回收用於後繼通過另一 Pellicon 2BiomaX 5kDa盒的過濾。在此純化後， 獲得透明澄清的米黃色肽水解產物。其特徵在於固體殘餘物含量為50-55g/kg和蛋白含量為 5-52g/l。此溶液隨後使用Chen^tation軟體控制輔助有HP 1100部件的高效液相色譜(HPLC)來進行分析。豌豆提取物洗脫期間使用的柱子是Nucleosil 300-5 C4 MPN (125x4mm)柱。此柱能使分子量為0. 2到25kDa的蛋白被色譜分析(使用與實施例1中一致的合適溶劑梯度)。在這些層析分析條件下，幾個肽部分能得到分離。這些不同的部分隨後通過質譜進行分析，以特異地鑑定每個峰的肽的胺基酸含量。還進行了序列分析以確定生物活性肽的肽序列。通過HPLC(高效液相色譜)鑑定相當於生物活性肽峰的色譜例子在附圖2中給出。本發明的活性成分的胺基酸組成也被確定。它在酸水解後被完成並通過使用 PICT(異硫氰酸苯酯)柱前衍生化的高效液相色譜來鑑定。^MM 3 從釀酒酵母中泡丨備富含勿活+ 牛肽的flfak解產物肽水解產物能從釀酒酵母種的酵母提取物中獲得。將酵母培養在適合它們生長的培養基中，優選存在乳酸，隨後離心以回收生物質。將酵母生物質溶解在10體積的含2% P0LYCLAR 10(聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)和0. 2%活性炭的水中。混合物使用IM 氫氧化鈉水溶液調節PH在6-7. 5範圍內。調節pH後，將2%的木瓜蛋白酶加到反應介質中。在55°C攪拌2小時後完成水
10解。然後，通過加熱溶液到80°C，2小時將酶滅活。離心後，獲得反應混合物，相當於酵母提取物。選擇特定的水解條件，以使得含有3到5個胺基酸包含至少一個天冬氨酸殘基、一個半胱氨酸殘基和一個精氨酸殘基的生物活性肽能夠富集。純化方法始於使用孔隙率遞降(到0. 2 μ m)的kitz-Orion過濾板的成功過濾， 以獲得透明澄清的溶液。在這一步，酵母提取物的特徵在於固體殘餘物含量為25-35g/kg， 蛋白含量為10-15g/l和糖含量為5-10g/l。此提取物的蛋白性質通過聚丙烯醯胺凝膠電泳來鑑定。對於此分析，使用 NuPAGE Bis-Tris預置聚丙烯醯胺凝膠(Invitrogen)。肽水解產物在NuPAGE LDS樣品製備緩衝液的還原變性條件下被加熱到70°C，10分鐘。NuPAGE 抗氧化劑溶液被加到內室(負極)以防止電泳期間再氧化的還原蛋白。蛋白遷移在NuPAGE MES遷移緩衝液中使用keBlue Plus2 standard作為分子量標記來完成。蛋白染色使用Coomassie Blue R-250完成。在這些條件下，觀察到3個大的蛋白家族第個一家族相當於分子量大於75kDa 的蛋白，第二個家族相當於分子量在20到25kDa的蛋白，最後一家族是分子量小於5kDa的蛋白。此溶液隨後使用正切流動過濾來純化，以排除分子量大於5kDa的蛋白。為了此目的，將豌豆肽水解產物在壓力下泵入提供有Pellicon 2Biomax 50kDa盒的Pellicon 支持物。此第一濾液被回收用於後繼通過另一 PelliCon 2Biomax IOkDa盒的過濾。第二濾液隨後被回收，其再次通過Pellicon 2BiomaX 5kDa盒的洗脫。在此純化後，獲得透明澄清的米色酵母植物提取物。其特徵在於固體殘餘物含量為35-45g/kg和蛋白含量為 30-40g/lo此溶液隨後使用Chen^tation軟體控制輔助有HP 1100部件的高效液相色譜 (HPLC)來分析。酵母水解產物洗脫期間使用的柱子是Nucleosil 300-5C4 MPN(125x4mm) 柱。此柱能使分子量為0. 2到25kDa的蛋白被色譜分析(使用與實施例1中一致的適宜的溶劑梯度)。在這些層析分析條件下，幾個肽部分能被分離。這些不同的部分隨後通過質譜來分析，以特異地鑑定每個峰的肽的胺基酸含量。 還進行了序列分析以確定生物活性肽的肽序列。通過HPLC(高效液相色譜)鑑定相當於生物活性肽峰的色譜例子在附圖4中給出。本發明的活性成分的胺基酸組成也被確定。它在酸水解後被完成並通過使用 PICT(異硫氰酸苯酯)柱前衍生化的高效液相色譜來鑑定。實施例4 在培養的老齡角質化細胞中，鑑定實施例1的玉米肽水解產物對於20S 蛋白_體_活件的激活劑效應將培養15天的實驗性老齡角質化細胞用實施例1中產生的來自玉米的1 %的肽水解產物處理。然後，研究了 20S蛋白酶體的酶活性。20S蛋白酶體是負責酶水解的亞單位。 可研究三種酶活性胰蛋白酶樣、糜蛋白酶樣和肽穀氨酸-肽水解酶(PGPH)的活性。我們通過特異針對每一活性的酶測定進行了這些活性的研究。老齡的角質化細胞被培養15天。細胞通過直接在培養液中加入我們的肽水解產物的溶液來進行處理，其在整個試驗中每周更換3次。測定了每一種活性，使用標記有螢光化合物7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的特異底物。切割後，在440nm讀取AMC的螢光，其有350nm的激發波長。螢光強度與獲得的螢光染料的量成比例，因此，其量與水解的底物的量成比例。合成的肽Boc-Leu-Arg-Arg-AMC特異針對胰蛋白酶活性。合成的肽Suc-Leu-Leu-Val-Try-AMC特異針對糜蛋白酶活性。合成的肽Z-Leu-Leu-Glu-AMC特異針對肽穀氨酸-肽水解酶酶活性。這些肽由SIGMA ALDRICH, Saint-Louis, MI, USA 提供並標記。將細胞在提取緩衝液中從支持物解離。然後，將它們在4°C超聲處理1分鐘，隨後在4°C，15000g離心30分鐘。蛋白測定使用BCA試劑盒(Pierce)完成。在將細胞裂解液與用於所研究活性的特異合成底物溫育後，使用Synergy分光光度計(BIOTEK，Vermont，USA) 在440nm讀取螢光值。MM對3種所研究的活性，我們觀察到，實施例1中的肽水解產物能增加20S蛋白酶體的酶活性。胰蛋白酶樣活性在使用活性成分處理期間增加了 155.3% ；糜蛋白酶樣活性增加了 130 %，記錄到肽穀氨酸-肽水解酶酶活性增加了 144. 6 %。Mrk將實施例ι中富含生物活性肽的肽水解產物，以的濃度實驗性地使用於培養的老齡角質化細胞中，能增加20S蛋白酶體的特異酶活性。本實驗進行了多次，可進行統計檢驗(Student t檢驗)。活性的增加在胰蛋白酶樣，糜蛋白酶樣活性的研究中有顯著性(分別為，P = 0.033和P = 0.0477)，對於肽穀氨酸-肽水解酶酶活性有高顯著性(P = 0. 00053)。實施例5 在培養的老齡角質化細胞中，鑑定實施例3中的酵母肽水解產物的抗老化效應通過在培養的實驗性老齡角質化細胞中評估β-半乳糖苷酶蛋白的表達來對酵母肽水解產物的抗老化效應進行研究。β -半乳糖苷酶活性已知存在於衰老的細胞中，而在衰老前體、休眠和永生化細胞中未發現有β-半乳糖苷酶活性。在LabecS孔板中培養實驗性老齡角質化細胞，並在存在和缺乏富含生物活性肽的酵母肽水解產物下維持20天。通過直接加樣到培養液中每周進行3次處理。未經處理的細胞在相同實驗期間被培養並作為對照。在標記日，清洗細胞，在2% 戊二醛-2%甲醛混合物中固定3分鐘。隨後清洗細胞，施用300μ 1 5-溴-4-氯-3吲哚-D-乳糖苷酶，通常被稱為X-gal ( β -半乳糖苷酶底物)。在(X)2培養箱中進行M小時溫育，隨後清洗細胞，將Labec板快速安置到合適的介質上。使用透射顯微鏡進行觀察。原理是簡單的當細胞衰老並含有β-半乳糖苷酶時，X-gal底物被切割成不溶的藍色物質。 β -半乳糖苷酶活性通過細胞的藍色染色來顯現。細胞的藍色越深，衰老細胞的數量越大。結果/結論我們發現在活性成分存在時，例如酵母肽水解產物，β -半乳糖苷酶活性在處理過的細胞中對比未處理的細胞大大降低了。因此，本發明的肽水解產物對培養了 20天的實驗性老齡角質化細胞有抗老化效應。
12
(UVB)平估蛋白的羰某化方案將培養的正常人成纖維細胞接種於直徑IOOmm的平皿。當細胞達到70%密度時， 用在培養液中稀釋到濃度的富含生物活性肽的水稻肽水解產物處理細胞48小時。細胞經lOOmJ/cm2的UVB照射，隨後被進一步置於活性成分存在下48小時。對照平皿的細胞未經活性成分處理，但被照射作為對照。清洗細胞，隨後從支持物上使用合適的提取緩衝液解離。提取的蛋白在使用PCA蛋白試劑盒(Pierce)檢測前在4°C，IOOOOrpm離心10分鐘。 蛋白羰基化使用基於與2，4_二硝基苯胼(DNP) (Sigma)衍生的羰基基團的免疫檢測的測試完成，依照反應蛋白-C= 0+H2N-NH-2. 4DNP —蛋白-C = N-NH2.4_DNP+H20簡而言之，將15μ1樣品與45μ1 DNP在室溫反應45分鐘。然後，5μ1混合物被稀釋到Iml磷酸鹽緩衝液中，200 μ 1的此稀釋液被放置到96孔板中，存在150 μ 1 BSA(fraction V)，4°C過夜。在磷酸鹽緩衝液(PBS)中清洗三次後，將兔抗二硝基苯生物素標記的抗體 (CALBI0CHEM)在存在0. 1 % Tween 20的0. 血清白蛋白緩衝液中稀釋到1/5000，在37°C 於微板中溫育1小時。3次清洗後，將稀釋到1/3000的鏈黴親和素-過氧化物酶(DAKO)絡合物在存在0. 1% Tween 20的0. 1 %血清白蛋白緩衝液中室溫溫育1小時。三次清洗後， 使用200 μ 1四甲基聯苯胺(TMB，SIGMA)於室溫25分鐘使其顯色。然後加入100 μ 1 2. 5Μ 的硫酸終止反應。在490nm被讀取OD值。為將獲得的OD值轉化成樣品中存在的羰基基團的數量，通過從0到100%改變氧化的BSA比例來制定校正曲線。結果在UVB存在下，未處理的細胞被強羰基化，相比未被照射的未處理細胞增加了 110%。在富含生物活性肽的水稻肽水解產物存在下，羰基化程度降低了 34%。實驗進行了多次，可進行統計檢驗(Student t檢驗)。羰基化的降低是顯著的，ρ = 0.(^98。綜上所述，本發明的活性成分能用於保護細胞抵抗UV的有害作用，例如，抵抗其氧化作用。水稻肽水解產物能用於降低大於34%的蛋白氧化。實施例7 臨床測驗臨床評估方案將安慰劑或實施例3的富含生物活性肽的酵母肽水解產物，以M小時內ang/cm2 的劑量應用到12名年齡從四到56歲的志願者，一天兩次，早和晚。結果的臨床評估使得能夠測量幾個皺紋和細紋的參數。皺紋和細紋的測量使用QUANTIRIDE完成，其是一種評估方法，能通過產生治療前後皮膚的複製物，使用矽酮聚合物，測量皺紋的數量，長度和深度。結果總結於下表皺紋定量結果
權利要求
1.蛋白酶體激活性肽水解產物，特徵在於所述水解產物富含多種生物活性肽，所述生物活性肽有小於6kDa的分子量，含有3到5個胺基酸，每個生物活性肽包含至少一個天冬氨酸殘基、一個半胱氨酸殘基和一個精氨酸殘基。
2.權利要求1的富集的肽水解產物，特徵在於所述生物活性肽是通式(I) X1-[Asp，Cys，Arg]-X2其中，X1是天冬醯胺、賴氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、精氨酸或不存在； X2是組氨酸、賴氨酸、精氨酸或不存在。
3.前述權利要求的富集的肽水解產物，特徵在於所述生物活性肽相應於下式中的一種(SEQ ID n0l)Arg-Asp-Cys-Arg-Arg (SEQ ID n02)Asn-Asp-Cys-Arg-Lys (SEQ ID n°3)Asp-Cys-Arg-His (SEQ ID n。4)Val-Asp-Cys-Arg (SEQ ID n°5) Asp-Cys-Arg
4.權利要求1至3之一的富集的肽水解產物，特徵在於其來自植物的水解，所述植物選自玉米(Zea may ζ L)、豌豆(Pisum sativum)、或水禾§ (Oryza sativa L)。
5.權利要求1至3之一的富集的肽水解產物，特徵在於其來自於酵母屬的酵母的水解， 更特別是釀酒酵母種的水解。
6.前述權利要求中任一項的富集的肽水解產物，特徵在於所述富集的肽水解產物含有 0. 5至5. 5g/l的肽性質的化合物。
7.前述權利要求中任一項的的肽水解產物，特徵在於其被用作藥物。
8.一種化妝組合物，其包含權利要求1至6之一所述的富集的肽水解產物作為活性成分。
9.權利要求8的化妝組合物，特徵在於其以包含化妝可接受介質的適於局部應用的形式存在。
10.權利要求8或9之一的組合物，特徵在於所述富集的肽水解產物在組合物中以佔總組合物重量的0. 0001 %至20%的量存在，並優選以佔總組合物重量0. 05%至5%的量存在。
11.權利要求8至10中任一項的組合物，特徵在於所述水解產物被溶解於一種或多種溶劑中，諸如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一縮二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、環多元醇、凡士林、植物油或這些溶劑的任意混合物。
12.權利要求8至11任一項的組合物，特徵在於所述組合物還含有促進所述富集的肽水解產物作用的至少一種活性成分。
13.權利要求12的組合物，其特徵在於所述活性成分是有抗皺紋活性的物質，諸如自由基清除劑或抗氧化劑，或者刺激皮膚大分子合成的物質或刺激能量代謝的物質。
14.包含權利要求1至6之一所定義的所述富集的肽水解產物和化妝可接受介質的化妝組合物的用途，其用於增加蛋白酶體活性和改善蛋白酶體對受損蛋白的降解。
15.包含權利要求1到6之一所定義的所述富集的肽水解產物和化妝可接受介質的化妝組合物的用途，其用於預防和/或治療皮膚老化和光老化跡象。
16.權利要求15的組合物的用途，特徵在於術語「皮膚老化跡象」指的是皺紋、深紋和粗紋、細紋、裂紋、皮膚和皮下組織的鬆弛、皮膚彈性和張力的喪失、緻密性和皮膚緊張性的喪失、和真皮萎縮。
17.權利要求15的用途，特徵在於所述組合物能保護皮膚抵抗UV輻射的侵襲。
18.化妝治療方法，特徵在於將包含有效量權利要求1至6之一所定義的富集的肽水解產物的組合物局部應用於皮膚、指甲或毛髮來預防和/或治療皮膚老化和光老化跡象。
全文摘要
本發明涉及富集生物活性肽的肽水解產物，所述水解產物是蛋白酶體激活劑。另外，本發明涉及化妝或製藥組合物，其包含在生理可接受介質中的所述水解產物，及其在預防或治療皮膚老化或光老化跡象和保護皮膚對抗UV輻射侵襲中的用途。最後，本發明涉及旨在預防和/或減輕皮膚老化和光老化跡象的化妝治療方法。
文檔編號C07K5/10GK102439027SQ201080028496
公開日2012年5月2日 申請日期2010年4月22日 優先權日2009年4月23日
發明者C·達爾法拉, J-M·博託, N·東洛熱 申請人:Isp投資公司