一種鐵調素抑制劑及其應用的製作方法

2023-04-27 17:09:46

專利名稱：一種鐵調素抑制劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥領域，涉及鐵調素抑制，具體涉及當歸多糖(ASP)作為鐵調素(hepcidin)抑制劑及其應用。

背景技術：
人體存在著嚴格的鐵代謝調節機制，確保體內鐵始終處於正常水平。在人體，小腸是鐵吸收的唯一部位，肝臟和內皮系統(retoculoendothelial system，RE)是鐵儲存的主要部位，而骨髓是利用鐵的主要部位。機體鐵穩態關鍵依賴於小腸鐵吸收和機體鐵需要之間的平衡。機體缺鐵時，小腸鐵吸收增加，反則反之。最近研究顯示，鐵調素(Hepcidin)是一種控制小腸鐵吸收及調節體內鐵穩態的關鍵物質。它能在肝臟、小腸、網織紅細胞和RE系統之間傳遞有關鐵調節的信號，控制和調節這些組織鐵吸收或釋放蛋白的表達。當任何原因引起循環鐵增加時，肝細胞攝鐵也增加。這回導致肝細胞增加合成和分泌鐵調素進入血液，鐵調素經血流運輸到十二指腸隱窩細胞，促成隱窩細胞攝鐵量增加，隱窩細胞內鐵池增大進而抑制腸吸收上皮細胞四種鐵吸收蛋白表達下降，鐵吸收量因此下降。當循環鐵較低時，經肝細胞鐵攝取將會減少，肝臟合成分泌的鐵調素將會減少，這將引起隱窩細胞鐵池變小，腸吸收上皮相關蛋白表達增加，腸鐵吸收量增加，是鐵水平回復到正常。同時肝臟分泌的鐵調素也可經血液到達RE系統和骨髓，調節這些組織鐵代謝作相應變化。
鐵代謝及其在鐵調節中作用的認識是進入21世紀後鐵代謝領域中最重要的突破性進展。無論對臨床診斷還是治療各類貧血及高鐵負荷相關疾病，其意義均是巨大的。很多鐵代謝相關疾病是由於體內hepcidin的調節失調所導致，還有一些因為鐵吸收障礙而導致的鐵缺乏症都可以通過抑制hepcidin的表達來達到一定的預防以及治療效果。hepcidin基因的表達主要受機體鐵水平、炎症和感染、紅細胞生成活性等因素調節。機體鐵水平高時，血色病基因(hemochromatosis gene product，HFE)、血幼素(hemojuvelin，HJV)、轉鐵蛋白受體2(transferrin receptor 2，TfR2)等分子會增加hepcidin的表達；炎症和感染導致某些細胞因子如IL-6的分泌增加也會刺激hepcidin的表達；但是，機體紅細胞生成活性的增強卻會抑制hepcidin的表達，從而開放鐵釋放通道，促進腸道鐵吸收及巨噬細胞鐵釋放，有利於增加紅細胞對鐵的有效利用，因此能迅速改善機體鐵缺乏的貧血症狀。
傳統中藥當歸[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]是一味歷史悠久的傳統中藥，有補血活血、調經止痛的功效。現代研究證實，當歸的主要成分當歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)通過刺激造血細胞生長微環境的基質細胞分泌造血生長因子(如EPO、IL-2、GM-CSF等)，促進造血祖細胞和多能造血幹細胞增殖和分化。


發明內容
本發明的目的在於提供一種鐵調素抑制劑，使其具有抑制hepcidin表達的作用。同時，本發明還提供了該鐵調素抑制劑在治療hepcidin表達過量引起的疾病中的應用，即通過抑制hepcidin調節機體血鐵水平從而治療鐵代謝相關疾病。
實現本發明的具體技術方案是 本發明提供的這種鐵調素抑制劑是當歸多糖。
本發明揭示當歸多糖能夠抑制正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠hepcidin的表達，從而增加小腸對鐵的吸收以及網狀內皮系統的對鐵的釋放，改善機體鐵缺乏症狀。
當歸多糖的提取與純化方法如下 1.水提醇沉法製備當歸粗多糖當歸飲片100g加入蒸餾水1000ml，煮沸1h，過濾。藥渣加入蒸餾水1000ml，煮沸1h，過濾，合併濾液。濾液減壓濃縮至較小體積後，加入氫氧化鈣調pH至鹼性，靜置過夜後過濾，濾液中加入硫酸調pH至酸性，過濾，取濾液醇沉，醇沉物冷凍乾燥，得14.176g棕黃色粉末當歸粗多糖，見圖1。以苯酚-硫酸法測定糖含量，總糖含量為70.88％。[硫酸苯酚法參考吳立軍.天然藥物化學.人民衛生出版社，第78頁] 2.凝膠柱法製備精製當歸多糖將當歸粗多糖配成30mg/ml的水溶液，過濾後，取5ml上Sephadex G-50凝膠柱(35cm×2.5cm)，以蒸餾水洗脫，流速7ml/min，每5ml收集一管，共收集50管。從這50管中每管取1ml以苯酚-硫酸法於490nm處測定吸光度，以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標繪製洗脫曲線，見圖3。該圖顯示洗脫曲線有兩個洗脫峰，分別在第10～12管與第24～27管，洗脫峰處的洗脫液為含糖液。因此，分別收集第10～12管，第24～27管，合併兩部分收集液於50℃減壓濃縮後冷凍乾燥，得到4.152mg淡黃色粉末即為精製當歸多糖，以苯酚-硫酸法測定糖含量為96.5％，見圖2。
本發明實驗中稱取精製當歸多糖40g，溶於200ml蒸餾水中配製成0.2g/ml的當歸多糖溶液，大鼠灌胃給藥後，測定大鼠血清hepcidin的表達情況，發現當歸多糖對正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠hepcidin的表達有良好的抑制效果。
我們將大鼠灌胃給藥當歸多糖溶液後，Elisa試劑盒法測定hepcidin的表達情況，結果顯示正常大鼠體內hepcidin血清濃度在末次給藥後12h時開始降低，於48h降到最低值；缺鐵性貧血大鼠ASP給藥組在末次給藥後24h時，其Hepcidin下降到最低值，與末次給藥後1h時比，下降率為21％。說明當歸多糖能夠抑制正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠hepcidin的表達。Hepcidin是一種控制小腸鐵吸收及調節體內鐵穩態的關鍵物質。它能在肝臟、小腸、網織紅細胞和RE系統之間傳遞有關鐵調節的信號，控制和調節這些組織鐵吸收或釋放蛋白的表達。當任何原因引起循環鐵增加時，肝細胞就會增加合成和分泌鐵調素，鐵調素經血流運輸到十二指腸隱窩細胞，促成隱窩細胞攝鐵量增加，隱窩細胞內鐵池增大進而抑制腸吸收上皮細胞四種鐵吸收蛋白表達下降，鐵吸收量因此下降參見1.郭曉強.海帕西啶與鐵代謝.基礎醫學與臨床，794-797；2.LydieViatte，SophieVaulont.Hepcidin，theironwatcher.Biochimie，1223-1228.。因此當歸多糖可通過抑制hepcidin的表達增加小腸對鐵的吸收以及網狀內皮系統的對鐵的釋放，改善機體鐵缺乏症狀。本發明揭示當歸多糖能夠抑制正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠hepcidin的表達，從而增加小腸對鐵的吸收以及網狀內皮系統的對鐵的釋放，改善機體鐵缺乏症狀。
當歸多糖是天然產物，製備工藝簡單，產率高，汙染小，成本低，無毒副作用，適合作為hepcidin抑制劑，可用於輔助鐵製劑治療鐵代謝相關性疾病。



圖1是經過水提醇沉法製備的當歸粗多糖，為棕黃色粉末。
圖2是當歸粗多糖經過Sephadex G-50凝膠柱後製備的精緻當歸多糖，為淡黃色粉末。
圖3是以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標繪製的當歸多糖洗脫曲線，從曲線可以看出有兩個洗脫峰，分別位於第10～12管與第24～27管之間，收集洗脫峰處的洗脫液為含糖液。
圖4是rhEPO及ASP末次給藥後正常大鼠體內血清中hepcidin含量變化圖大鼠血清中hepcidin在最後一次給藥後12h時開始降低，於48h降到最低值，之後緩慢回升，說明當歸多糖可較長時間地抑制正常狀態下大鼠體內hepcidin的表達。
圖5是rhEPO及ASP末次給藥後IDA大鼠體內血清中hepcidin含量變化圖Hepcidin在給藥後24h時，下降到最低值，至給藥後48h仍略低於水平值，說明當歸多糖可較長時間地抑制IDA病理狀態下大鼠體內hepcidin的表達，並且抑制效果比rhEPO給藥組更顯著。

具體實施例方式 下面通過具體的實施實例對本發明作進一步的詳細描述。
實施實例1 實驗方法稱取精製當歸多糖40g，溶於200ml蒸餾水中配製成0.2g/ml的當歸多糖溶液。實驗用健康SD大鼠共14隻，隨機分為兩組。第一組腹腔注射rhEPO 3天，第二組灌胃當歸多糖溶液每天一次，每次1ml，連續14天。在給藥前及末次給藥後各時間點取血，測定血清中hepcidin的含量。
實驗結果ASP與rhEPO體內給藥對hepcidin表達的抑制效果相似。大鼠體內hepcidin血清濃度在最後一次給藥後12h時開始降低，於48h降到最低值，與給藥1h所測值有顯著差異，之後緩慢回升，見表1和圖4。末次給藥後，比較rhEPO組及ASP組抑制hepcidin的持續時間得出ASP給藥後，大鼠體內hepcidin濃度可長時間維持在較低水平，正常大鼠體內hepcidin含量直至給藥後48h仍顯著低於給藥前。即當歸多糖可較長時間地抑制正常狀態下大鼠體內hepcidin的表達。
表1末次給藥後正常大鼠體內血清中hepcidin含量變化(ng/ml，

n＝7)
*表示與t＝1h時比有顯著性差異，p＜0.05；**表示與給藥前比有顯著性差異，p＜0.01 實施實例2 實驗方法 1.造模實驗用健康SD大鼠21隻，造模前取血測血液指標。造模期間飼餵低鐵飼料，並定期定量放血，每周取血測血液指標，直至各指標有顯著性差異，指示缺鐵性貧血造模成功，實驗過程中杜絕鐵汙染。
2.給藥及檢測造模後，模型大鼠隨機分成三組，第一組腹腔注射rhEPO 3天，第二組灌胃當歸多糖溶液每天一次，每次1ml，連續14天，第三組灌胃同等體積的生理鹽水作為模型對照組。在造模前，造模後給藥前及末次給藥後各時間點取血，採用ELISA測定血清中hepcidin的含量。
實驗結果 1.分別於造模前後採用血細胞自動分析儀測定大鼠血液中各指標，測定結果見表2，結果顯示與造模前相比，造模後大鼠Hb、HCT、MCV、MCH及MCHC均顯著下降，RDW增加，對實驗數據採用t檢驗，各項指標造模前後有極顯著性差異，表明造模組大鼠具有明顯的缺鐵性貧血症狀，缺鐵性貧血模型構建成功。
2.給藥後hepcidin檢測結果顯示ASP給藥組hepcidin的受抑制效果比rhEPO給藥組更顯著，ASP給藥組在末次給藥後24h時，其Hepcidin下降到最低值，與末次給藥後1h時比，下降率為21％，見表3和圖5。末次給藥後，比較rhEPO組及ASP組抑制hepcidin的持續時間得出ASP給藥後，大鼠體內hepcidin濃度在末次給藥後可長時間維持在較低水平，IDA大鼠體內hepcidin濃度在末次給藥後48h也仍略低於水平值。即當歸多糖可較長時間地抑制IDA病理狀態下大鼠體內hepcidin的表達。結果說明當歸多糖能夠抑制缺鐵性貧血大鼠(IDA)體內hepcidin的表達。
表2大鼠造模前後血常規變化(

n＝21)
表3末次給藥後IDA大鼠體內血清中hepcidin含量變化(ng/ml，

n＝7)
**表示與造模前比有顯著性差異，p＜0.01；*表示與t＝1h時比有顯著差異，p＜0.0權利要求
1.一種鐵調素抑制劑，其特徵在於，它是當歸多糖。
2.當歸多糖在製備鐵調素抑制劑中的應用。
3.當歸多糖在製備用於治療鐵調素表達過量所致疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種鐵調素抑制劑，該鐵調素抑制劑是當歸多糖。本發明提供的鐵調素抑制劑當歸多糖能夠抑制正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠鐵調素的表達，從而增加小腸對鐵的吸收以及網狀內皮系統的對鐵的釋放，改善機體鐵缺乏症狀。本發明鐵調素抑制劑是天然產物，其製備工藝簡單，產率高，汙染小，成本低，無毒副作用，適合製備用於治療鐵調素表達過量所致疾病藥物。
文檔編號A61K31/715GK101816674SQ201010174779
公開日2010年9月1日 申請日期2010年5月18日 優先權日2010年5月18日
發明者王凱平, 張玉, 汪繼紅, 胡明惠, 周漠炯 申請人:華中科技大學