晶片表面toehold協助下增強的單鹼基突變檢測的製作方法

2023-04-27 22:11:16

晶片表面toehold協助下增強的單鹼基突變檢測的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種基於toehold協助下的晶片表面增強DNA鏈替換反應來檢測單鹼基突變的技術。該技術將雙鏈DNA(toehold交換探針)接枝到晶片表面，利用雙偏振幹涉測量技術(DPI)，根據toehold協助下的DNA鏈替換反應原理，實現在DPI上實時定量研究單鹼基突變進程。該技術大幅度提高了正確目標鏈DNA的替換效率同時又能很好的抑制有突變目標鏈DNA的替換效率，大大提高了單鹼基突變檢測的信號。
【專利說明】晶片表面toehold協助下增強的單鹼基突變檢測

【技術領域】
[0001]本發明涉及DNA分子檢測【技術領域】，具體涉及用於檢測單鹼基突變的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子，連接有所述分子的晶片，及其應用。

【背景技術】
[0002]單鹼基突變是一種普遍存在的基因變異種類，在人類基因組中幾乎有1%的等位基因會出現單鹼基突變。基因序列中的變異與人類遺傳病密切相關，對早期診斷，藥物響應測試，疾病預防，和特定遺傳疾病的治療至關重要，因此基因多態性的研究成為遺傳病學和預防醫學的研究重點。發明一種簡單，省時和高靈敏度的基因多樣性檢測方法非常有價值和必要。
[0003]目前為止，實現單鹼基突變檢測的方法有很多種，其中重要的方法有酶輔助方法以及DNA雜交的方法。酶輔助方法具有很高的靈敏度以及強的特異性，但是操作過程複雜，酶的不穩定性，價格昂貴和嚴格的實驗條件等固有的缺點，限制了其在複雜樣品檢測中的應用。另外一種方法，DNA雜交具有獨一無二的優勢，其中無需酶參與反應，有效克服了以上缺點，同時具備高靈敏度以及特異性，很好實現了的單鹼基突變檢測。
[0004]在DNA雜交檢測單鹼基突變的方法中主要有界面檢測方法和溶液檢測方法兩大類。其中，採用界面檢測方法的，主要集中於SNP基因分型的研究，藉助於toehold的調控，來實現單鹼基突變檢測，但是只能檢測toehold上的突變，無法實現DNA全序列不同位點和不同突變類型(SNP，插入和缺失)的單鹼基突變檢測。溶液檢測的方法由Zhang [ZhangDY.Nature Chemistry2012, 4, 208-214]等人提出，設計了新穎的雙鏈 DNA「toehold 交換探針」，該探針具有對檢測條件(PH，溫度和濃度)不敏感的優點，能進行不同突變點和突變類型的單鹼基突變檢測。但同時由於可逆反應的影響，存在著正確的DNA目標鏈替換效率低下的缺點。
[0005]因此，為了克服現有技術中在DNA單鹼基突變上檢測的困難，本發明人進行了深入研究。本發明採用DNA雜交的方法，整合界面檢測和溶液檢測的優勢，首次將雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子接枝到晶片表面，利用雙偏振幹涉技術(DPI)，藉助toehold的DNA鏈替換反應原理實現在晶片表面實時定量研究單鹼基突變進程。該發明不僅實現了DNA全序列不同位點的突變檢測，而且克服了溶液中正確的DNA目標鏈替換效率低的缺點，大幅度提高了正確的目標鏈DNA的替換效率(達到86.1% )同時又能很好的抑制有突變的目標鏈DNA的替換效率(約14% )，從而大大提高單鹼基檢測信號。同時，我們設計了一種簡單實用的DNA微陣列晶片，藉助普通螢光顯微鏡，在玻璃晶片表面實現了高通量的單鹼基突變檢測。


【發明內容】

[0006]為了解決上述問題，本發明提供用於檢測單鹼基突變的基於toehold的晶片。
[0007]具體地，本發明涉及以下各項:
[0008]1.一種配體修飾的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子，其特徵在於:所述分子由N端帶有配體的固定鏈和C端與固定鏈C端互補的互補鏈退火得到,從而固定鏈和互補鏈的互補區形成雙鏈DNA剛性端，所述雙鏈DNA剛性端靠近配體側具有自發解離端，互補鏈的N端非互補部分形成粘性toehold末端。
[0009]2.根據I所述的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子，其中所述配體選自由生物素，抗體，抗原組成的組。
[0010]3.根據I所述的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子，其中所述雙鏈DNA剛性端為10-50個鹼基對，優選20個鹼基對。
[0011]4.根據I所述的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子，所述自發解離端為2-20個鹼基對，優選5個鹼基對。
[0012]5.根據I所述的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子，所述粘性toehold末端為2-20個鹼基，優選6個鹼基。
[0013]6.一種DNA晶片，其特徵在於:所述晶片由1-5任一項所述的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子通過晶片表面的受體接枝於晶片表面形成。
[0014]7.根據6所述的DNA晶片,其中，所述受體選自由NeutrAvidin蛋白，抗原,抗體組成的組，所述晶片為微陣列晶片，其可以包含任意數量的反應池。
[0015]8.1-5任一項所述的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子和/或權利要求6-7任一項所述的晶片用於檢測單鹼基突變的用途。
[0016]9.一種檢測單鹼基突變的方法，其中包括以下步驟:
[0017]I)將不同種類待檢測目標鏈DNA，與如1-5任一項所述的或如6或7中所述的晶片上接枝的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子發生鏈替換反應；
[0018]2)進行定性和/或定量檢測。
[0019]10.根據9所述的方法，所述定性和/或定量檢測包括:
[0020]I)加入螢光基團標記的報告鏈DNA，用螢光顯微鏡定性檢測；其中所述螢光基團優選FAM ；
[0021]2)使用雙偏振幹涉技術(DPI)實時定量檢測。
[0022]發明詳述
[0023]以下對本發明的技術方案做進一步詳細闡述。應當指出，本發明的各實施方案可以根據需要以任何方式組合。
[0024]本發明的第一個方面是提供一種生物素修飾的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子以及基於其的DNA微陣列晶片。
[0025]在一個實施方案中，本發明提供一種配體修飾的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子，其特徵在於:所述雙鏈DNA由N端帶有配體的固定鏈(P)與其互補鏈(C)雜交退火得到，從而P鏈和C鏈的互補區形成雙鏈DNA剛性端，所述雙鏈DNA剛性端靠近配體側具有自發解離端，C鏈的N端非互補部分形成粘性toehold末端。如圖1所示為當配體為生物素(b1tin)時的分子結構。
[0026]在一個優選的實施方案中，所述雙鏈DNA剛性端為10-50個鹼基對，優選10_40個，更優選10-30個，還更優選10-20個鹼基對，最優選20個鹼基對。
[0027]在另一個優選的實施方案中，所述自發解離端為2-20個鹼基對，優選2-15個鹼基對，更優選2-10個鹼基對,還更優選2-5個鹼基對,最優選5個鹼基對。
[0028]在另一個優選的實施方案中，所述粘性toehold末端為2-20個鹼基，優選2-15個鹼基，更優選2-10個鹼基,還更優選2-6個鹼基,最優選6個鹼基。
[0029]在進一步優選的實施方案中，所述雙鏈DNA分子通過連於其上的配體與連於晶片表面的受體間的相互作用接枝到晶片表面。通過將雙鏈DNA「toehold交換探針」分子連接於晶片，一方面實現聞通量單喊基突變檢測，另一方面大幅度提聞正確DNA目標鏈的替換效率同時很好地抑制突變的DNA目標鏈的替換效率。
[0030]因此，在該進一步實施方案中，提供一種用於檢測單鹼基突變的DNA微陣列晶片，如圖2所示，所述微陣列晶片為載玻片(75mm*25mm)通過一系列經表面化學處理過程得到的醛基表面，與含有12孔反應池的微陣列墊片對齊後加壓粘在一起形成，所述晶片的反應池中的表面連接有受體，所述受體與所述雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子上的配體相互作用，從而接枝所述雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子。
[0031]在一個優選的實施方案中，所述配體包括但不限於生物素，抗體，抗原，相應的，所述受體包括但不限於NeutrAvidin蛋白，抗原,抗體,本領域已知的相互結合的兩種分子均可以用於本發明。
[0032]在一個最優選的實施方案中，所述雙鏈DNA由25鹼基的5』端生物素修飾的固定鏈DNA和26個鹼基的互補鏈DNA雜交退火得到，其中含有P鏈的C端20個鹼基與C鏈的C端20個鹼基形成的雙鏈DNA剛性端以及6個鹼基的DNA鏈引發鏈替換反應的粘性toehold末端以及5個鹼基DNA鏈的自發解離端(被稱為6/5toehold方案)。雙鏈DNA分子通過生物素和NeutrAvidin蛋白特異性相互作用接枝到修飾NeutrAvidin蛋白後的晶片表面。該DNA分子通過粘性末端與多種待檢測目標鏈鹼基配對，發生鏈替換反應，實現單鹼基突變檢測。
[0033]本發明的第二個方面提供一種基於本發明的第一個方面的DNA微陣列晶片用於檢測單鹼基突變的方法。
[0034]在一個優選的實施方案中，所述方法使用突光基團的報告鏈DNA通過突光顯微鏡獲得定性結果，所述螢光基團優選FAM。
[0035]在一個更優選的實施方案中，所述方法中使用雙偏振幹涉技術(DPI)獲得定量結果O
[0036]在一個更優選的實施方案中，所述方法將所述雙鏈DNA 「toehold交換探針」接枝到晶片表面，利用雙偏振幹涉技術(DPI)和DNA微陣列技術，藉助toehold協助下的DNA鏈替換反應原理實現單鹼基突變在晶片表面的檢測。該光刻技術無需嚴格的操作條件，操作簡單。
[0037]本發明的單鹼基突變檢測方法中首次利用雙鏈DNA 「toehold交換探針」接枝到晶片表面，利用雙偏振幹涉技術(DPI)和DNA微陣列技術，藉助toehold協助下的DNA鏈替換反應原理，最終實現單鹼基突變在晶片表面的檢測。其原理見圖3，首先將NeutrAvidin蛋白接枝到醛基晶片表面。接著通過生物素與NeutrAvidin蛋白特異性相互作用，將生物素修飾的雙鏈DNA 「toehold交換探針」固定到表面。緊接著通入待檢測目標鏈(正確目標鏈或者突變目標鏈)與雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子發生鏈替換反應，實現在DPI上的實時定量研究單鹼基突變。在隨後的DNA微陣列實驗中，重複以上步驟，最後加入螢光修飾的DNA報告鏈，從而實現了螢光顯微鏡下的高通量單鹼基突變檢測。
[0038]在更優選的實施方案中，本發明的界面單鹼基突變檢測技術包括如下步驟:
[0039]I)根據被檢DNA寡核苷酸的實際長度設計所需要的各種單鏈DNA序列，所述單鏈DNA序列的設計按照實際的需要可以進行調整；
[0040]2)氨基晶片表面通入戊二醛溶液孵育，得到醛基晶片表面；
[0041]3)通入NeutrAvidin蛋白溶液孵育使蛋白接枝到醒基表面；
[0042]4)將退火後的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子固定到修飾了 NeutrAvidin蛋白的晶片表面；
[0043]5)通入待檢測目標鏈DNA (正確目標鏈DNA或突變目標鏈DNA)溶液，在toehold協助下，與雙鏈DNA發生鏈替換反應，實現在DPI上實時定量的研究單鹼基突變進程；
[0044]6)在食人魚洗液清洗後的玻璃表面進行氨基化修飾以及醛基化修飾；
[0045]7)將12孔反應池的微陣列墊片固定到醛基玻璃表面得到DNA微陣列；
[0046]8)在DNA微陣列晶片的12個反應池裡均加入NeutrAvidin蛋白溶液,使蛋白接枝到晶片表面；
[0047]9)在DNA微陣列晶片的12個反應池裡均加入生物素修飾的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子，使之固定到修飾了 NeutrAvidin蛋白的晶片表面；
[0048]10)在DNA微陣列晶片的12個反應池裡分別同時加入不同種類待檢測目標鏈DNA (正確目標鏈DNA和多種突變目標鏈DNA)溶液以及緩衝液對照組溶液，在toehold協助下，與雙鏈DNA發生鏈替換反應，替換掉大部分或極少量的互補鏈DNA(C)；
[0049]11)在DNA微陣列晶片的12個反應池裡均加入螢光素FAM修飾的報告鏈DNA，通過鹼基互補配對連接到固定鏈DNA上，最後用螢光顯微鏡進行拍照，最終實現在DNA微陣列上的高通量單鹼基突變檢測；
[0050]在一個優選的實施方案中，步驟中所述DNA濃度可根據實際要求在1nM-1 μ M進行調節。
[0051]在一個優選的實施方案中，步驟2)中所述氨基晶片通入戊二醛溶液孵育時間為6分鐘。
[0052]在一個優選的實施方案中，步驟3)中通入NeutrAvidin蛋白溶液孵育時間為6分鐘。
[0053]在一個優選的實施方案中，步驟4)中雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子固定到修飾了 NeutrAvidin蛋白的晶片表面反應時間為15分鐘。
[0054]在一個優選的實施方案中，步驟5)中通入待檢測的目標鏈DNA溶液孵育時間為15分鐘。
[0055]在一個優選的實施方案中，步驟6)中氨基化時間為2小時。
[0056]在一個優選的實施方案中，步驟6)中氨基化時間為4小時，然後放入120°C烘箱半小時。
[0057]在一個優選的實施方案中，步驟8)中涉及的NeutrAvidin蛋白接枝到醒基表面反應時間為I小時。
[0058]在一個優選的實施方案中，步驟9)中生物素修飾的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子與接枝了 NeutrAvidin蛋白的晶片表面的反應條件是室溫下孵育I小時。
[0059]在一個優選的實施方案中，步驟10)中同時分別加入的不同待檢測目標鏈DNA溶液和緩衝液對照組溶液孵育時間為I小時。
[0060]在一個優選的實施方案中，步驟11)中加入的螢光素FAM修飾的報告鏈DNA溶液孵育時間為I小時。
[0061]在一個最優選的實施方案中，步驟11)中不加入報告鏈DNA，從而通過DPI進行檢測，即用Farfield軟體和Oringinlab軟體進行數據分析處理,分析界面絕對質量的變化情況從而實現實時定量的研究單鹼基突變的進程。
[0062]本發明的第三個方面是提供一種基於本發明的第一個方面的DNA微陣列晶片，利用雙偏振幹涉技術(DPI)在檢測鹼基錯配、鹼基缺失或鹼基插入中的應用。
[0063]本發明的有益效果如下:
[0064]本發明提供了一種晶片表面toehold協助下的增強單鹼基突變檢測的方法。首次將雙鏈DNA「 toehold交換探針」接枝到晶片表面，利用雙偏振幹涉技術(DPI)，藉助toehold協助下的DNA鏈替換反應原理實現了在晶片表面實時定量的研究單鹼基突變進程。一方面，該發明不僅檢測種類全面的鹼基突變，包括了所有的鹼基突變形式:鹼基錯配、鹼基缺失以及鹼基插入，並且待檢測目標鏈DNA存在突變位置可以在任意位置。另一方面，克服了溶液中正確的目標鏈DNA替換效率低的缺點，大幅度提高了正確的目標單鏈DNA的替換效率(達到86.1% )同時又能很好的抑制有突變的目標單鏈DNA的替換效率(約14% )，大大提高了單鹼基突變檢測信號。同時，我們設計了一種簡單實用的DNA微陣列晶片，藉助普通螢光顯微鏡，在玻璃晶片表面實現了高通量的單鹼基突變檢測。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]圖1生物素修飾的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子結構圖。
[0066]圖2DNA微陣列晶片結構圖。
[0067]圖3 (a) DPI技術實時定量研究toehold協助下的晶片表面單鹼基突變進程的原理圖；(b)DNA微陣列技術實現在toehold協助下的晶片表面高通量單鹼基基突變檢測的原理圖。
[0068]圖4DPI技術實時定量的研究toehold協助下的晶片表面單鹼基突變進程(曲線表示質量mass隨時間t的變化圖)。其中和「i」分別表示鹼基錯配、鹼基缺失以及鹼基插入等不同突變類型，比如mlT表示目標單鏈DNA分子I號位置發生鹼基錯配，錯配成T鹼基。illT表示目標單鏈DNA分子11號位置發生鹼基插入，插入的是T鹼基，以及dl9表示目標單鏈DNA分子19號位置發生鹼基缺失(其它以此類推)。a)表示晶片表面toehold協助下不同位置(mlT~ml9T)的單鹼基突變進程的定量研究；b)表示晶片表面toehold協助下11號位置不同突變類型(錯配，缺失和插入)的單鹼基突變進程定量研究；c)表示晶片表面toehold協助下19號位置不同突變類型的單鹼基突變進程定量研究；d)另一種toehold方案(6/6方案)下的單鹼基突變檢測研究。
[0069]圖OTNA微陣列技術實現在toehold協助下的晶片表面高通量單鹼基突變檢測的結果。

【具體實施方式】
[0070]以下結合附圖和具體實施例對本發明的具體技術方案進行具體說明。
[0071]本實例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了比較詳細的實施方式和過程。應理解，這些實施例是用於說明本發明而不限於本發明保護的範圍。實施例中採用的實施條件可以根據需要做進一步的調整，未註明的實驗條件通常按照常規實驗中的條件。
[0072]本實施例主要通過實驗驗證基於晶片表面toehold協助下的增強單鹼基突變檢測的可行性，並進一步在自行設計的簡易實用DNA微陣列上實現高通量單鹼基突變檢測。以下實例進一步驗證基於晶片表面toehold協助下的增強單鹼基突變檢測的可行性。
[0073]實施例1:
[0074]利用雙偏振幹涉技術(DPI)，在toehold協助下實時定量研究不同位置的單鹼基突變進程。
[0075]第一步，氨基晶片表面醒基化以及將NeutrAvidin蛋白(31000，Thermo FisherScientific, Massachusetts, USA)接枝到醒基表面:
[0076]在DPI 實驗中，氨基晶片(FBlOOAmine, FarfieldGroup, Ltd., Stockholm, Sweden)表面以25 μ L miiT1流速通入戊二醛溶液(4mg mL—1溶於PBS緩衝液)6分鐘，利用氨基與醛基的共價結合反應完成晶片表面醛基化過程。
[0077]將NeutrAvidin蛋白溶液(0.5mg ml/1溶於PBS緩衝液)以25 μ L mirf1流速通入到醛基化晶片表面6分鐘，利用NeutrAvidin蛋白上的氨基與醛基發生共價結合反應，從而將NeutrAvidin蛋白到固定醒基表面上。
[0078]第二步，將退火後的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子固定到修飾了 NeutrAvidin蛋白的晶片表面:
[0079]2 μ Μ5』生物素修飾的固定鏈DNA⑵與3 μ M互補鏈DNA(C)等體積混合得到600 μ L溶液後退火使其雜交，退火條件為95°C下保持10分鐘然後緩慢降溫到室溫，整個退火過程持續2.5-3小時，雜交過程中使用到的緩衝液為TE緩衝液(1mM Tris-HCl, 12.5mMMgC12, pH = 8)，雜交後得到的雙鏈DNA溶液濃度為I μ Μ。
[0080]a.將退火後的生物素修飾的雙鏈DNA溶液以1yL mirT1流速通入到接枝了NeutrAvidin蛋白的晶片表面室溫下孵育15分鐘,利用生物素與NeutrAvidin蛋白的特異性相互作用將雙鏈DNA固定到晶片表面。
[0081]b.以50 μ L mirT1流速通入TE緩衝液10分鐘，清洗掉未接枝到表面的多餘雙鏈DNA分子。
[0082]第三步，通入待檢測目標鏈DNA溶液，實現在DPI上實時定量的研究單鹼基突變進程:
[0083]I μ M的待檢測目標鏈以10 μ L mirT1流速通入到固定了雙鏈DNA分子的晶片表面15分鐘,在toehold協助下,與雙鏈DNA分子發生鏈替換反應,替換掉大部分或極少量的保護鏈DNA (C)，在DPI上實現了實時定量的研究單鹼基突變進程，其中待檢測目標鏈為正確目標鏈DNA或突變目標鏈DNA。
[0084]以50 μ L mirT1流速通入TE緩衝液10分鐘，清洗掉多餘的待檢測目標鏈DNA。
[0085]用Farfield軟體進行數據分析和處理。
[0086]生物素修飾固定鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0087]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0088]互補鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0089]ACXiTACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0090]正確目標鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0091]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0092]存在單鹼基突變目標鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0093]mlT: T ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:4)
[0094]m6T: CACTC T TTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO: 5)
[0095]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0096]ml6T: CACTCATTCAATACC T TACGT (SEQ ID NO:7)
[0097]m!9T:CACTCATTCAATACCCTA -T' GT(SEQ ID NO:8)
[0098]其中斜體並下劃線的部分為形成雙鏈DNA後的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發生單鹼基突變。通過Farfield軟體和originlab軟體數據處理可以得到驗證。如圖4a所示,通過本發明的方法可以清楚的區分待檢測目標單鏈是否發生了單鹼基突變，從而實現單鹼基突變檢測。
[0099]實施例2:
[0100]利用雙偏振幹涉技術(DPI)，在toehold協助下實時定量研究分支遷移端不同類型的單鹼基突變進程。
[0101]採用同實施例1相同的操作步驟，只是突變目標鏈DNA為分支遷移端11號位置存在鹼基突變(從左到右為5』 一3』)，同時考慮各種不同突變類型，包括鹼基錯配、鹼基缺失以及鹼基插入.
[0102]生物素修飾固定鏈的序列(從左到右為5』 一3』 )
[0103]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0104]互補鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0105]ACGTAG GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0106]正確目標鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0107]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0108]存在單鹼基突變目標鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0109]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0110]mlIG:CACTCATTCA G TACCCTACGT(SEQ ID NO:9)
[0111]mlIC:CACTCATTCA C TACCCTACGT(SEQ ID NO:10)
[0112]iIIA:CACTCATTCA A ATACCCTACGT(SEQ ID NO:11)
[0113]iIIT:CACTCATTCA T ATACCCTACGT(SEQ ID NO:12)
[0114]iIIG:CACTCATTCA G ATACCCTACGT(SEQ ID NO:13)
[0115]iIIC:CACTCATTCA C ATACCCTACGT(SEQ ID NO:14)
[0116]dll:CACTCATTCATACCCTACGT(SEQ ID NO:15)
[0117]其中斜體並下劃線的部分為形成雙鏈DNA後的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發生單鹼基突變。通過Farfield軟體和originlab軟體進行數據處理分析。如圖4b所示,可以清楚的區分待檢測目標鏈11號位置是否發生了單鹼基突變，從而實現單鹼基突變檢測。
[0118]實施例3:
[0119]利用雙偏振幹涉技術(DPI),在toehold協助下實時定量研究目標DNA的toehold末端反應的部分存在不同類型的單鹼基突變進程。
[0120]採用同實施例1相同的操作步驟，只是的19號位置存在鹼基突變(從左到右為5』 一3』)，同時考慮各種不同突變類型，包括鹼基錯配、鹼基缺失以及鹼基插入。
[0121]生物素修飾固定鏈的序列(從左到右為5』 一3』 )
[0122]B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0123]互補鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0124]ACCiTACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO: 2)
[0125]正確目標鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0126]Correct:CACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0127]存在單鹼基突變目標鏈的序列(從左到右為5』 一3』 )
[0128]ml9T:CACTCATTCAATACCCTA T GT(SEQ ID NO:8)
[0129]ml9A:CACTCATTCAATACCCTA A GT(SEQ ID NO:16)
[0130]ml9G:CACTCATTCAATACCCTA G GT(SEQ ID NO:17)
[0131]?19Α:CACTCATTCAATACCCTA Al CGT (SEQ ID NO: 18)
[0132]i19T:CACTCATTCAATACCCTA T CGT(SEQ ID NO:19)
[0133]i19G:CACTCATTCAATACCCTA C CGT(SEQ ID NO:20)
[0134]i19C:CACTCATTCAATACCCTA G CGT(SEQ ID NO:21)
[0135]dl9:CACTCATTCAATACCCTAGT(SEQ ID NO:22)
[0136]其中斜體並下劃線的部分為形成雙鏈DNA後的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發生單鹼基突變。通過Farfield軟體和originlab軟體進行數據處理分析。如圖4c所示,可以清楚的區分待檢測目標鏈19號位置是否發生了單鹼基突變，從而實現單鹼基突變檢測。
[0137]實施例4:
[0138]利用雙偏振幹涉技術(DPI)，在toehold協助下實時定量研究正確目標鏈5』端減少一個鹼基以及待檢測的突變目標鏈I號位置發生單鹼基突變進程。
[0139]採用同實施例1相同的操作步驟，只是將待檢測正確目標鏈5』端減少一個鹼基以及待檢測的突變目標單鏈I號位置發生突變，從而自發解離端變為6個鹼基，可稱為6/6toehold方案。研究不同toehold方案對單鹼基突變檢測的影響。
[0140]生物素修飾固定鏈的序列(從左到右為5』 一3』 )
[0141] B1tin-TTTTTGCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:1)
[0142]互補鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0143]ACGl'ACh GGTATTGAATGAGTGGATGC (SEQ ID NO:2)
[0144]正確目標鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0145]Correct:ACTCATTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO:23)
[0146]存在單鹼基突變目標鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0147]mlT: Ti CTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:24)
[0148]其中斜體並下劃線的部分為形成雙鏈DNA後的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發生單鹼基突變。通過Farfield軟體和originlab軟體進行數據處理分析。如圖4d所示,不同的toehold方案下仍然可以清楚的區分待檢測目標鏈是否發生了單鹼基突變，從而實現單鹼基突變檢測。
[0149]實施例5:
[0150]利用螢光分光光度計分別研究溶液中單鹼基突變檢測的替換效率。
[0151]溶液中單鹼基突變檢測的研究，只是將固定鏈DNA⑵分子從5』端開始第5個鹼基T上修飾上淬滅基團BHQ-2，互補鏈DNA(C)分子3』端修飾上螢光基團R0X。
[0152]淬滅基團修飾固定鏈的序列(從左到右為5』一3』)
[0153]TTTTT-BHQ-2- GCATCCACTCATTCAATACC(SEQ ID NO:25)
[0154]螢光基團修飾互補鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0155]A( X Π? (l.GGTATTGAATGAGTGGATGC-ROX (SEQ ID NO:26)
[0156]正確目標單鏈的序列(從左到右為5』 一3』)
[0157]Correct:ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:3)
[0158]存在單鹼基突變目標單鏈的序列(從左到右為5』 一3』 )
[0159]mlT: T ACTCATTCAATACCCTACGT(SEQ ID NO:4)
[0160]m6T: CACTC T TTCAATACCCTACGT (SEQ ID NO:5)
[0161]ml6T: CACTCATTCAATACC T TACGT (SEQ ID NO:7)
[0162]ml IT: CACTCATTCA T TACCCTACGT (SEQ ID NO:6)
[0163]iIIA: CACTCATTCA A ATACCCTACGT (SEQ ID NO: 11)
[0164]dll:CACTCATTCATACCCTACGT(SEQ ID NO:15)
[0165]ml9T:CACTCATTCAATACCCTA T GT(SEQ ID NO:8)
[0166]i19A:CACTCATTCAATACCCTA A CGT(SEQ ID NO:18)
[0167]dl9:CACTCATTCAATACCCTAGT(SEQ ID NO:22)
[0168]其中斜體並下劃線的部分為形成雙鏈DNA後的toehold端，只下劃線的部分為目標單鏈DNA與雙鏈DNA的toehold端反應的部分，加粗的字體表示發生單鹼基突變。利用originlab數據處理，得到界面和溶液中單鹼基突變檢測的效率對比圖，結果見下表。其中Φ表示界面或溶液的單鹼基突變替換效率，Λ Φ表示正確目標鏈與突變鏈替換效率的差值。分析可知界面單鹼基突變替換效率遠遠高於溶液中單鹼基突變，採用界面單鹼基突變檢測方法可以大大提高檢測信號。
[0169]

【權利要求】
1.一種配體修飾的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子，其特徵在於:所述分子由N端帶有配體的固定鏈和C端與固定鏈C端互補的互補鏈退火得到，從而固定鏈和互補鏈的互補區形成雙鏈DNA剛性端，所述雙鏈DNA剛性端靠近配體側具有自發解離端，互補鏈的N端非互補部分形成粘性toehold末端。
2.根據權利要求1所述的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子，其中所述配體選自由生物素，抗體，抗原組成的組。
3.根據權利要求1所述的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子，其中所述雙鏈DNA剛性端為10-50個鹼基對，優選20個鹼基對。
4.根據權利要求1所述的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子，所述自發解離端為2_20個鹼基對，優選5個鹼基對。
5.根據權利要求1所述的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子，所述粘性toehold末端為2-20個鹼基，優選6個鹼基。
6.—種DNA晶片，其特徵在於:所述晶片由權利要求1-5任一項所述的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子通過晶片表面的受體接枝於晶片表面形成。
7.根據權利要求6所述的DNA晶片,其中，所述受體選自由NeutrAvidin蛋白，抗原,抗體組成的組，所述晶片為微陣列晶片，其可以包含任意數量的反應池。
8.權利要求1-5任一項所述的雙鏈DNA「toehold交換探針」分子和/或權利要求6_7任一項所述的晶片用於 檢測單鹼基突變的用途。
9.一種檢測單鹼基突變的方法，其中包括以下步驟: 1)將不同種類待檢測目標鏈DNA，與如權利要求1-5任一項所述的或如權利要求6或7中所述的晶片上接枝的雙鏈DNA 「toehold交換探針」分子發生鏈替換反應； 2)進行定性和/或定量檢測。
10.根據權利要求9所述的方法，所述定性和/或定量檢測包括: 1)加入螢光基團標記的報告鏈DNA，用螢光顯微鏡定性檢測；其中所述螢光基團優選FAM ； 2)使用雙偏振幹涉技術(DPI)實時定量檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK104164487SQ201410313153
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月2日 優先權日:2014年7月2日
【發明者】梁好均, 徐華國, 黃福建 申請人:中國科學技術大學