多功能螢光分析檢測參比體系的製作方法
2023-04-27 22:00:11
專利名稱：多功能螢光分析檢測參比體系的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於液體試樣中分析物的發光檢測的體系，其中該體系包含負載有針對分析物的物質和參比物質的載體。此外，本發明涉及液體試樣中分析物的檢測方法，其中使用了上述體系。除了檢測分析物，本發明所述的體系還可以適用於測定試樣含量，分析物的含量和/或確定用於檢測的載體的待用狀態(Funktionsbereitschaft)。
本發明所述的用於檢測分析物體系和方法基於發光檢測，尤其是螢光檢測。現有技術中，這種檢測體系是公知已久的。在目前的分析方法中，分析測試元素的光度測定是快速檢測或快速測定試樣中分析物濃度的最為普遍的方法之一。通常，光度測定用於分析學、環境分析學以及首選的藥物診斷學領域。特別是在血糖診斷領域中，用光度測定法測定毛細管血液中具有的測試元素是十分重要的。
在螢光光譜測定的檢測方法體系中，螢光物質的發光強度與其受激發的強度成正比。激發強度受到很多因素的影響，如光源隨時間和光路的改變的行為。特別是在沒有安裝在實驗室中用於測試的小型儀器中，光路的改變可能造成不同激發強度。因此難以可重複地進行絕對的螢光測試。
因此目前常見的螢光測試體系使用了可用來參比測試的參比物質。不同類型的參比物也已獲知。
例如，在現有技術中可以得知，在基於螢光團的檢測體系中使用可以在不同於針對分析物的特定螢光團波長的波長下發光的第二螢光團。因此這種第二螢光團可以用作參比物質。上述兩種螢光團可以通過兩個不同的濾波器(以及兩個檢測器)區分開，其中螢光團不會經歷化學反應並可以用作參比物。這種檢測體系記載在例如下列參考文獻中Principles of Fluorescence Spectroscopy，J R Lackowicz，KluverAcademic/Plenum Publisher，New York，Boston，Dordrecht，Moscow1999，第二版。
另一種方式是時間分辨(zeitaufgelsten)的和相調製(phasenmodulierten)參比方式，其中，將壽命比針對於分析物的短壽命螢光團更長的長壽命螢光團作為參比物質。壽命較長的發光物質的參數不受分析物的影響，而作為針對分析物的壽命較短的螢光團的強度則根據各分析物的濃度改變而改變。時間分辨測試首先檢測分析物螢光團，然後記錄參比值的衰減。衰減信號與分析物信號之比加上參比物信號必須總是相等，而與其強度無關。
WO99/06821公開了如下體系該體系使用了共同固定在載體上的至少兩種不同的發光材料，第一種材料至少在發光強度方面會對待檢測的分析物的參數做出響應，第二種材料至少在發光強度和衰減時間方面不會對待檢測的分析物的參數做出響應。發光物質具有不同的衰減時間。得到的發光響應的時間和相的情況可以用來產生用於確定待測試的分析物參數的基準參數。
WO02/056023公開了光學傳感器，用於檢測試樣的至少一個參數，其中使用了具有短衰減時間的會對參數做出響應的指示劑材料，以及不會對參數做出響應的長衰減時間的參比材料。上述指示材料和參比材料被固定在同一個載體上，同時試樣側面用遮光層覆蓋。
儘管如此，用在不同波長下測得的第二種螢光團進行的參比方法需要更高的設備成本。比如利用兩個濾波器代替僅只一個濾波器，以便能擋住激發光源，同時常常也需要兩個檢測器。另外，當激發光進入不同的檢測器後，由於光路被分開，兩個光路之一可能有缺陷，致使可能得到錯誤的參比結果。
時間分辨或者相分辨參比的一個缺點是對分析物的檢測通常必須在發光背景下進行。這意味著總會有限制了檢測範圍的特定偏移量或背景信號。這個原理如圖1所示。
圖1給出了有和沒有參比物情況下的分析物信號的檢測範圍。沒有參比螢光團時，測量範圍可以最佳地適應於所要覆蓋的動態範圍。有參比物螢光團時一部分測量範圍被參比物佔用。
現有技術中的上述方法中使用的參比物或者參比發光物質只能作為與分析物相比較的參比物質使用，而不能實現其他的功能。
儘管如此，在診斷學領域檢測分析物時存在一個重要的問題，那就是辨別潤溼和/或受試區域的填充控制。
同樣在這個領域，現有技術中提到了改進現有方法的手段。WO83/00931公開了一種檢測液體試樣的裝置和方法，其中可以檢測是否施加了足夠量的液體試樣。這可通過一個包括光源的滴液檢測器在試樣上發出位於水的吸收光譜範圍內的輻射而實現。試樣載體首先在乾燥狀態然後在潤溼狀態下被照射，由此測量溼度。試樣的水分含量通過檢測信號的差異而測算出來。
美國專利US5114350公開了一種用於檢測體液試樣中分析物濃度的裝置和方法。反應載體的潤溼度可以通過測量隨著潤溼程度增加而減少的反射光量得到。
DE10248555 A1公開了一種檢測和補償測試樣條用量不足的方法。該專利文件中描述了一種測試元件，其包括與試樣中分析物相互作用的針對分析物的試劑，以及與試樣的樣本基體相互作用的空白物質(Kontrollsubstanz)。上述針對分析物的試劑與分析物的相互作用取決於測試波長範圍內的分析物濃度。當測試區域被照射時，空白順序(Kontrollsequenz)與試樣基體的相互作用取決於施加在測試區域內的試樣量。空白物質同樣可以與試樣基體中的水反應。在DE10248555中提到的一個實施例中，氯酚紅作為與分析物無關的成色劑用於檢測試樣含量以及2，18-磷鉬酸作為針對分析物的試劑用於檢測樣本，如血樣中的葡萄糖濃度。因此在上述的文獻實施例中，必須檢測造成該測試體系設備昂貴的兩個波長範圍。
本發明的任務在於提供一種體系和方法，用於檢測液體試樣中的分析物，其可以利用參比物質和針對分析物的物質來進行，而不必耗費現有技術中所述的高昂的設備成本。
本發明的任務通過用於液體試樣中分析物的發光檢測的系統來實現，其中包括載體，所述載體又包括可以在接觸分析物時發出第一發光信號的針對分析物的物質，以及可以發出第二發光信號的參比物質，所述第二發光信號會通過與液體試樣接觸而基本被淬滅。
出乎意料的是，現有技術中已知的檢測手段可以通過本發明簡單化，即使用這樣的參比物質，該參比物質在不存在試樣條件下可以發出作為參比信號的發光信號。當加入試樣時，該發光信號會突然間基本被淬滅，也就是說，基本不再能發出信號，或者是至少強烈衰減的信號。
對於本發明，特別有利的是使針對分析物的物質的激發和發射為大致相同的波長。這意味著然後可用一個信號檢測器檢測發光信號。
由於參比物的性質，即在不存在試樣的條件下可以發出發光信號，且其稍後在與試樣接觸時會淬滅，因此參比物質不但可以用於檢測分析物，同樣還可以檢測試樣含量，確定分析物的量和/或載體的待用狀態。參比物質可以例如通過下列方式選擇，即要使得溼潤時它的發光信號發生淬滅。這使得測試體系的待用狀態可以是可見的。如果包括測試體系的載體在儲存等操作的過程中被潤溼或類似情況，或者如果其他物質與載體接觸，這種參比物質的發光信號將會淬滅，並且可以知道該測試體系未做好準備。
優選淬滅是可逆的，也就是說如果試樣尤其是潤溼被移除或者反過來，發光信號可以恢復。
除了參比，同樣可以允許潤溼檢測和/或利用本發明的體系實現填充控制。例如如果測試區域設置在載體上且其沒有完全被試樣潤溼，則就會留下剩餘的發光信號。可以經由該剩餘發光而根據分析物信號進行計算校正。
如果與環境溼度有關的發光特性是可逆的，這種參比物質同樣可以作為溼度指示劑。這種溼度指示劑為測試體系的儲存條件及其待用狀態提供信息。因此參比物質同樣可以作為用於待選的測試體系的最終數據中的指示劑。
現有技術中幾乎沒有發現發光物質尤其是螢光團有著這樣的屬性。大多數螢光團在潮溼的環境下不會增加其螢光性，也不會淬滅。
如果針對分析物的物質的發光特性取決於pH值，那麼針對分析物的物質可以用於測量pH值。因此在本發明的一個實施方案中，該體系是pH傳感器，即針對分析物的物質選自其發光信號取決於pH值的物質。在這個實施方案中的體系，優選參比物質不是發光信號會因pH值變化而基本被淬滅的物質。優選作為針對分析物的物質的是LysoSensorBlue DND-167或者其衍生物，例如用於測量範圍為大約3.5-大約7.0或者大約4.5-大約6.0的pH值。
在試樣施加前，本發明的pH傳感器的載體優選具有如下pH值，即在該pH下針對分析物的物質基本不表現出發光。在LysoSensor BlueDND-167的例子中，該pH值選自約7至約10或約8至約9的範圍。
此外，預設載體的緩衝力使得載體基本上能完全再被緩衝至試樣的pH值。本領域技術人員熟知，應該如何調節載體的這種緩衝力。
原則上，能夠發出在接觸試樣時基本被淬滅的發光信號的所有物質都可以考慮用作為參比物質。在此可使用其發光信號在接觸試樣中任一成分時會淬滅的所有類型的物質。待檢試樣中可引發淬滅的成分可以是如水、鈣、鎂或者其他金屬或它們的離子，pH值和其他因素。
如果水是一個引發淬滅的因素，這個參比物質優選選自如式I所述的查耳酮類物質。
查耳酮類物質在現有技術中已公開(B.M.Krasovitskii，D.G.Pereyaslova，ZH.Vsesoyuznogo Obscchestva in D.I.Mendeleeva，10(6)，704(1965)；G.E.Dobretsov，V.A.Petrov，Yu.A.Vladimirov，StudiaBiophysica Berlin，71(3)，181-187(1978))。
優選的是如通式I所示的結構， 其中R2、R3和R5之一優選選自NR11R12和SO3Na。其他取代基R1、R4、R6、R7、R8、R9和R10可以是任何取代基，優選為氫和滷素，特別是F、Cl、Br和I。
R11和R12優選選自氫、C1-C4烷基，特別是甲基、乙基、丙基和丁基，其中C1-C4烷基可由下列基團取代-OH，-SH、磷酸根、-COOH，-NH2，-SO3Na，-NO2、滷素特別是F、Cl、Br和I。優選的被取代的烷基殘基是-CH2CH2-SO3Na。
適合作為本發明的參比物質的特別優選物質是氨基查耳酮類和氯代查耳酮類，尤其是具有通式II，III和IV結構的物質。
氯代查耳酮根據Krasovitskii的方法製備而成(B.M.Krasovitskii，D.G.Pereyaslova，ZH.Vsesoyuznogo Obscchestva in D.I.Mendeleeva，10(6)，704(1965))。
R11和R12是甲基的氨基查耳酮是可商購得的，並且可用於確定性試驗。
R11和R12兩個均為CH2CH2-SO3Na的通式V的氨基查耳酮可由多步合成法製備而成。
此外另一個優選物質如式V所示。
淬滅反應同樣可以由金屬離子引起。其發光信號在接觸金屬離子時基本被淬滅的化合物同樣適合作為本發明的參比物質。
特別地，可以選擇如下參比物質，即其發光信號在接觸鈣或鎂離子時基本被淬滅。為此可考慮例如螢光染料，它們與Ca2+和/或Mg2+形成絡合物時可以阻止螢光或使螢光大為衰減。
上述螢光染料的一個例子是可從Molprobes公司得到的FuraRED。FuraRED具有下列結構式 根據本發明，第三種適宜的參比物質是對pH的變化有響應的物質。這裡指的是當pH值改變時其發光信號基本被淬滅的物質。
這對於試樣例如血液來說是尤為有益的。血液具有很強的緩衝力，因此可以改變測試體系中預先設定的pH值。如果測試體系設定為一個較低的pH值(如pH5)，則在施加血樣時測試體系會重新緩衝至pH為7。
上述參比物質的一個例子是Molprobes公司的LysoSensor BlueDND-167(目錄No.L7533，ABS/EM』(nm)373/425，PKA5，1，適合的pH範圍4.5-6.0)。
LysoSensor Blue DND-167 另外，對於本發明的體系或本發明方法，可以使用LysoSensor BlueDND-167的衍生物，其比LysoSensor Blue DND-167具有更好的水溶性。增加的水溶性可以提高與包括分析物的試樣的反應速率。
在本發明的LysoSensor Blue DND-167的衍生物中，一個或多個氫原子是相互獨立地為取代基取代，其中一個碳原子可以接有多於一個取代基。特別合適的取代基是可以帶有至少一個正或/和負電荷的極性取代基。
LysoSensor Blue DND-167的蒽骨架、兩個嗎啉基和兩個亞甲基上所有被氫佔有的位置，都適合於本發明的取代。
根據本發明，優選的LysoSensor Blue DND-167的衍生物接有1，2，3或者4個取代基。
優選的取代基包括-OH，-SH、磷酸根、-COOR11，-NR11R12，-SO3Na，-NO2、滷素特別是F、Cl、Br和I。R11和R12優選選自氫、C1-C4烷基，特別是甲基、乙基、丙基和丁基，其中C1-C4烷基可由下列基團取代-OH，-SH、磷酸根、-COOH，-NH2，-SO3Na，-NO2、滷素特別是F、Cl、Br和I。更優選的被取代的烷基殘基是-CH2CH2-SO3Na。
LysoSensor Blue DND-167的衍生物的一個例子是如式VII的化合物 在一個優選實施方式中，本發明的體系是用於測量葡萄糖，特別是血糖的體系。例如NAD或者NADP可以用於作為針對分析物的物質，其在合適的酶如葡萄糖脫氫酶的存在下，可以形成能顯示螢光的NADH或者NADPH。在本發明的用作測量葡萄糖的體系中，使用當pH值改變時其發光信號基本上淬滅的物質作為參比物質，如LysoSensor BlueDND-167及其衍生物。
本發明的另一個主題在於提供一種用發光來檢測液體試樣中分析物方法，包括(i)提供載體，包括接觸分析物時能發出第一發光信號的針對分析物的物質，和包括能發出第二發光信號的參比物質，且該第二發光信號會由於接觸液體試樣而基本被淬滅，(ii)將載體與含有待測分析物的液體試樣接觸，和(iii)測量發光信號，並且通過比較發光信號來檢測分析物。
如上所述，在該方法中，同樣優選使用可以基本激發和發出大致相同的波長範圍的參比物質和針對分析物的物質。優選該參比物質的發光信號首先在沒有試樣的存在下測量，接下來施加液體試樣，並且測量由該試樣引起的發光信號。這可以優選使用單個檢測器來實施。但當參比物與針對分析物的物質的波長範圍不同時，也可使用不同的檢測器。
圖1示出了根據現有技術中所述方法，採用或不採用參比物質來測量分析物的發光信號的測量範圍。
圖2示出了潤溼時二甲基氨基查耳酮的淬滅過程的動力學曲線。
圖3示出了使用了固含量為0.05％的查耳酮的測試體系。作為試樣使用4種溶液，其分別含有0mg/dl、100mg/dl，300mg/dl和700mg/dl的葡萄糖。測量發光物質的強度，並且與源於葡萄糖濃度0mg/dl的對照試樣的淬滅信號相比較。該差值當施加了充足的試樣時為最大。該值隨試樣施加量減少而越來越減小。
圖4示出了如圖3描述的同一測試形式中單位體積的計數數目。約為1μl起即達穩定水平，在其之下不能得到可靠的測量結果。
圖5示出了FuraRED的吸收和發射光譜。
圖6和圖7示出了Lysosensor Blue DND-167的螢光發射與pH值的關係。
圖8示出了使用了Lysosensor Blue DND-167，NAD和pH＝5的緩衝液的測試體系。用作試樣的是分別含有0mg/dl，1mg/dl和2mg/dl葡萄糖的三種溶液和pH＝7的緩衝液。發光強度在施加試樣24秒後測量。pH＝7的試樣溶液起到重新緩衝包含LysoSensor Blue DND-167的層的作用。可以觀察到發光隨著時間而減少。基本在24秒以後測量的話發光不再會有變化。
圖9示出了使用了Lysosensor Blue DND-167，NAD和pH＝5的緩衝液的測試體系。用作試樣的是分別含有0mg/dl，90mg/dl，300mg/dl和700mg/dl的葡萄糖的四種溶液和pH＝7的緩衝液。發光強度在施加試樣24秒後測量。pH＝7的試樣溶液起到重新緩衝包含Lysosensor BlueDND-167的層的作用。所含葡萄糖濃度為0mg/dl的試樣結果與圖8中結果相符。隨著葡萄糖濃度增加，根據時間的發光減少量也隨之減小(90mg/dl)，或者發光值升高超過初始值(300mg/dl和700mg/dl葡萄糖)。受Lysosensor Blue DND-167和NADH影響的發光的不同時間行為可以很清楚的區分開。
實施例實施例1二甲基查耳酮的作用通過簡單受體來檢驗，因為該查耳酮為非水溶性的，因此用甲醇代替水。
其中已可看到，在UV光照射且於乾燥狀態下會強烈發螢光的查耳酮當塗上一滴甲醇時就再不會發螢光。
測試受體I
將查耳酮溶於MeOH中並加入Transpafill。向混合物中加入Propiofan，並均勻混合該漿料。隨後，將混合物刮塗到Pokalon膜上，並且在50℃下乾燥5分鐘。
圖2示出的測試顯示了當向刮塗到Pokalon膜上的綠色發光層上塗一滴甲醇時的淬滅的動力學。可以清楚的看到施加甲醇時會出現突然淬滅，但當甲醇從查耳酮層上揮發，即重新乾燥時，這種淬滅就會逆向進行的。
實施例21.螢光團的對pH值的依賴性將Lysosensor Blue DND-167染料溶於不同pH值的緩衝劑中，並將這些溶液施塗於僅包括作為滴落表面的空白膜的測試條上。在測試儀器中進行檢測。
激發波長375nm(Roithner公司的UV-LED)，從420nm起進行檢測並藉助於螢光濾波器，Schott公司的Langpass，KV418，BPW34型檢測器。
結果如圖7所示(空白值＝無染料的溶液)，螢光隨著pH值增加而減少。當pH＝8時，幾乎達到空白值。
2.pH為5的層中的LysoSensor Blue DND-167染料製備包括葡萄糖脫氫酶、NAD和緩衝物的層，其pH為5。
圖8顯示了當滴加pH為7的緩衝物時螢光的減少。在此過程中，這個層的pH值被從5重新緩衝到7。在重新緩衝的過程中，螢光會減少。
在另外一個實驗中，將緩衝的葡萄糖溶液滴加到該層。可以看到疊加反應；一方面由於染料的重新緩衝，螢光減少(比較圖8)；另一方面，通過葡萄糖反應而形成對應於葡萄糖濃度的螢光的NADH。結果如圖9所示。
權利要求
1.一種用於液體試樣中分析物的發光檢測的體系，其中包括載體、該載體又包括可以在接觸分析物時發出第一發光信號的針對分析物的物質，以及可以發出第二發光信號的參比物質，該第二發光信號會由於接觸液體試樣而基本被淬滅。
2.權利要求1所述的體系，另外還包括至少一種用於測量針對分析物的物質和參比物質的發光信號的檢測器。
3.權利要求1或2所述的體系，另外還包括用於確定試樣量、分析物量和/或載體待用狀態的評價單元。
4.前述權利要求之一所述的體系，其中針對分析物的物質和參比物質是螢光團。
5.前述權利要求之一所述的體系，其中所述參比物質選自其發光信號在與水接觸時基本被淬滅的物質。
6.權利要求5所述的體系，其中所述參比物質是式I的化合物。
7.權利要求1至4之一所述的體系，其中所述參比物質選自其發光信號在與金屬離子接觸時基本被淬滅的物質。
8.權利要求7所述的體系，其中所述參比物質是FuraRed。
9.權利要求1至4之一所述的體系，其中所述參比物質選自其發光信號在pH值改變時基本被淬滅的物質。
10.權利要求9所述的體系，其中參比物質是LysoSensor Blue DND-167或其衍生物。
11.權利要求1至4之一所述的體系，其中針對分析物的物質選自發光信號取決於pH值的物質。
12.權利要求12所述的體系，其中針對分析物的物質是LysoSensorBlue DND-167或其衍生物。
13.前述權利要求之一所述的體系，其中，針對分析物的物質和參比物質在基本相同的波長範圍內受激和發光。
14.前述權利要求之一所述的體系，其中僅使用一個檢測器來測量針對分析物的物質和參比物質的發光信號。
15.能夠發出在與液體接觸時基本被淬滅的發光信號的物質的用途，用於在檢測分析物的方法中作為參比物質。
16.能夠發出在與液體接觸時基本被淬滅的發光信號的物質的用途，用作用以確定試樣量的參比物質。
17.能夠發出在與液體接觸時基本被淬滅的發光信號的物質的用途，用作用以確定檢驗分析物的體系的待用狀態的參比物質。
18.通過發光來檢驗液體試樣中分析物的方法，其包括(i)提供載體，包括接觸分析物時能發出第一發光信號的針對分析物的物質，和包括能發出第二發光信號的參比物質，且該第二發光信號會由於接觸液體試樣而基本被淬滅，(ii)將載體與含有待檢測分析物的液體試樣接觸，和(iii)測量發光信號，並且通過比較發光信號來檢測分析物。
19.權利要求18所述的方法，其中，在載體與液體試樣接觸之前測量參比物質的發光信號。
全文摘要
本發明涉及液體試樣中分析物的發光檢測的體系，其中體系包含負載有針對分析物的物質和參比物質的載體。此外，本發明涉及使用所述體系的液體試樣中分析物的檢測方法。除了檢測分析物，本發明所述的體系還可以適用於測定試樣含量，分析物的含量和/或確定用於檢測的載體的待用狀態。
文檔編號G01N33/542GK101048651SQ200580036606
公開日2007年10月3日 申請日期2005年10月25日 優先權日2004年10月25日
發明者C·霍恩 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司