水稻抗稻瘟病Pi9基因的共顯性功能分子標記Pi9InDel2及其應用的製作方法
2023-05-17 00:53:16
本發明涉及農作物分子遺傳育種學領域，具體地說，涉及水稻抗稻瘟病pi9基因的共顯性功能分子標記pi9indel2及其應用。
背景技術：
抗稻瘟病基因pi9是第一個被克隆水稻廣譜抗稻瘟病基因(qu等2006，genetics，172(3)：1901-1914)。pi9基因對來自13個國家的43個稻瘟菌生理小種都表現高抗(liu等2002，mol.genet.genomics,267(4):472-480)。pi9基因全長編碼序列為8589bp(不含啟動子)，含2個內含子和3個外顯子(qu等2006)，如序列seqidno.1所示。pi9基因的克隆為設計開發基因內部功能分子標記，並應用於水稻抗稻瘟病分子標記輔助選擇育種培育抗病水稻新品種奠定了基礎。
目前，已報導的pi9基因的分子標記輔助育種方法主要為：一是利用pi9基因連鎖標記進行選擇(倪大虎等2005，分子植物育種3:329-334；殷得所等2011，中國水稻科學25(1)：25-30)；二是利用pi9基因內顯性功能分子標記(文婷等2012，湖南農業大學學報38:262-266)；三是在pi9基因區域內開發的snp標記(張羽等2015，雲南農業大學學報(自然科學版)，30(4)：528-534)；四是利用pi9基因第二個外顯子區域的caps標記方法(cn201510062377.4/cn104630364a)；五是利用啟動子區域插入/缺失共顯性分子標記方法(專利cn201310065310.7/cn103146695a)。
目前，已有不少pi9基因分子標記在mas育種應用。其一是，利用與pi9基因連鎖的分子標記進行育種實踐，由於連鎖標記是基於目的基因側翼序列所開發的，與目的基因存在一定的遺傳距離，在育種選擇中由於標記與目的基因存在一定頻率的重組，容易造成選擇準確性降低，或者增加選擇群體數目和工作量。第二是，在pi9基因第一個內含子區域、3』末端utr區域內開發的顯性標記雖然能準確的對目的基因進行選擇，但該類型標記不能區分區分回交育種後代是雜合體還是純合體，僅適合在育種早期進行世代選擇。第三是，在第二個外顯子區域的caps標記雖屬共顯性標記，但卻操作麻煩，需要對pcr產物進行酶切才能有效地檢測目的基因。目前，尚未見有關pi9基因第一個內含子區域共顯性功能分子標記的報導。此外，對於不同遺傳背景材料需要選擇不同的共顯性分子標記，目前可供有效利用的共顯性標記數量還甚少。
技術實現要素：
為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是開發一種新的水稻抗稻瘟病基因pi9共顯性功能分子標記，應用於水稻抗稻瘟病分子標記輔助選擇育種，快速培育廣譜高抗稻瘟病水稻新品種。
本發明針對已克隆的pi9基因第一個內含子，開發了一種新的水稻抗稻瘟病基因pi9共顯性功能分子標記pi9indel2，在分子標記輔助選擇育種中準確鑑定目標個體的基因型，大大提高育種效率。
為了實現本發明的目的，本發明的技術方案如下：
本發明首先利用clustalw序列比對程序，對pi9基因和nbs2-pi2基因核苷酸序列進行比對，比對結果如圖1所示。比對發現，pi9基因與nbs2-pi2基因序列比較，pi9基因的核苷酸序列在第一個內含子內的30bp到254bp之間存在3個插入/缺失突變，導致pi9基因在該區段比nbs2-pi2基因缺少101bp的鹼基序列，如圖1所示。
所述抗稻瘟病基因pi9(genbank登錄號：dq285630.1)的核苷酸序列如seqidno.1所示。所述nbs2-pi2基因(genbank登錄號：dq352453)為pi9基因的同源基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。pi9與nbs2-pi2基因在核苷酸序列上具有較高的同源性，pi9基因編碼區核苷酸序列共有8589個鹼基，nbs2-pi2基因編碼區核苷酸序列有8748個鹼基。
因此，本發明發現了水稻抗稻瘟病pi9基因第一個內含子內的30bp～254bp鹼基之間存在3個插入/缺失位點，導致pi9基因與非pi9功能基因在此區段存在101bp鹼基的插入/缺失變異。
進一步地，本發明根據pi9與非pi9功能基因30bp～254bp鹼基之間的插入/缺失序列差異，設計了pi9基因特異性的共顯性分子標記pi9indel2，如圖1所示。利用插入/缺失差異序列兩端的保守序列作為所發明標記的正反向引物。其中，正向引物pi9indel2-f序列位於pi9基因序列105bp至126bp間，如圖1所示，共22個鹼基；反向引物pi9indel2-r序列位於pi9基因序列389bp至410bp間，如圖1所示，共22個鹼基。
圖1為本發明方案中pi9基因61bp～499bp核苷酸序列和nbs2-pi2基因61bp～599bp核苷酸序列比對圖。其中，「-」部分為兩個基因比對插入/缺失差異區域，黑色箭頭標註的為pi9indel2標記正反向引物的起始和終止位置，其中pi9indel2-f所在箭頭標註的為正向引物序列和位置，pi9indel2-r所在箭頭標註的為反向向引物序列和位置。
該分子標記的正反向引物序列為：
正向引物pi9indel2-f序列：5』-gaaggacatctggtacgtactg-3』，如seqidno.3；
反向引物pi9indel2-r序列：5』-gagatggcgtagcgaaggcagc-3』，如seqidno.4。
本發明進一步提供了所述分子標記在檢測pi9基因方面的應用，利用seqidno.3和seqidno.4所示的引物對待測目標進行pcr擴增，若擴增後得到長度為306bp的片段，則待測目標含pi9基因；若擴增後得到長度為407bp的片段，則待測目標不含pi9基因。
本發明利用pi9indel2分子標記檢測不同遺傳背景水稻材料中是否含有pi9基因。通過對不同水稻材料dna進行pcr擴增後，利用瓊脂糖凝膠電泳對dna擴增產物片段進行檢測，含pi9基因的水稻材料應得到一條分子量大小與pi9基因供體75-1-127一致的目的條帶，擴增dna片段長度為306bp，如圖2樣本1泳道檢測條帶所示；而不含pi9基因的水稻材料pcr擴增dna片段長度則為407bp，如圖2樣本2-19泳道檢測條帶所示。
本發明還提供了所述分子標記在選育雜交育種後代中pi9基因純合體方面的應用，利用seqidno.3和seqidno.4所示的引物對待測目標進行pcr擴增，若擴增後僅得到長度為306bp的片段，則待測目標為含有pi9基因的純合子；若擴增後僅得到長度為407bp的片段，則待測目標為不含pi9基因的純合子；若擴增後得到長度為306bp和407bp的兩個片段，則待測目標為含有pi9基因的雜合子。
即本發明所述的pi9indel2分子標記不但可以對pi9基因進行特異性的檢測，判斷不同遺傳背景水稻親本材料中是否含有pi9基因，而且可利用其進行pi9基因分子標記輔助選擇改良水稻稻瘟病抗性，利用pi9indel2標記引物對雜交或回交後代進行快速pcr檢測，判斷pi9基因是否導入雜交後代中，以及雜交後代中pi9基因是否已是純合狀態。
進一步地，由seqidno.3和seqidno.4所示的引物組成的引物組合，以及含有所述引物組合的試劑或試劑盒、pcr反應體系及熱循環參數也屬於本發明的保護範圍。
基於前述發明構思，本發明還提供了檢測水稻抗稻瘟病pi9基因的方法，以及選育雜交育種後代中pi9基因純合體的方法。
進一步地，本發明對前述pcr擴增的反應體系及反應條件進行了進一步優化。
優化後的pcr擴增反應體系如下：
優化後的pcr擴增反應條件為：94℃變性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，擴增35個循環；72℃延伸7min。
本發明涉及到的原料或試劑均為普通市售產品，涉及到的操作如無特殊說明均為本領域常規操作。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。
本發明的有益效果在於：
本發明開發了一種水稻抗稻瘟病基因pi9共顯性功能分子標記及其應用。本發明發現pi9基因第一個內含子內第30bp～254bp鹼基間與其它非pi9功能基因間存在101bp鹼基的插入/缺失變異，根據該插入/缺失變異開發了pi9基因的共顯性功能分子標記pi9indel2及應用方法，具體步驟如下：利用pi9indel2標記引物，對不同遺傳背景水稻親本基因組dna、及其與pi9基因供體親本的雜交後代基因組dna進行pcr擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑑定不同水稻親本及雜交後代中是否含有pi9功能基因，以及雜交育種選育後代中的pi9基因是否純合。本發明可準確鑑定不同遺傳背景水稻親本及雜交後代中是否含有pi9基因以及該基因位點是否已經純合，適用於pi9功能基因的檢測和利用分子標記輔助選擇育種方法快速培育抗稻瘟病水稻新品種。
附圖說明
圖1為本發明pi9與nbs2-pi2基因序列比對圖。
圖2為本發明實施例1中pi9indel2標記多態性檢測。
圖3為本發明實施例2中pi9indel2標記對雜交種f1代的分子檢測。
圖4為本發明實施例3中pi9indel2標記檢測回交自交群體中pi9基因純合子。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，並不是用於對本發明的範圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1利用pi9indel2標記檢測不同遺傳背景水稻親本中是否含有pi9基因
供試材料：pi9基因供體材料75-1-127、23份不同遺傳背景水稻親本材料：gm4、fyb、fya、ii32b、ii32a、co1403、co1404、桃1b、桃1a、p102、p88s、he-88、he-127、he-130、he-159、he-160、黃華佔、玉針香、玉晶軟佔、馬壩銀佔、16hz-164、16h凡、r288。
所需試劑：10×pcr緩衝液(含mg2+)、dntps、pi9indel2-f正向引物、pi9indel2-r反向引物、taqdna聚合酶、水稻基因組dna模板、ddh2o。
實驗程序：分別以供試水稻材料基因組dna為模板，配置10μlpcr反應體系，然後進行pcr擴增，擴增產物用濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。實驗結果如圖2所示。
圖2為本發明實例1中利用pi9indel2標記在不同遺傳背景水稻親本中檢測pi9基因及標記多態性分析pcr擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，m為dnamarker，左側標註為對應dnamarker標記條帶分子量大小；各泳道分別為：1：75-1-127；2：gm4；3：fyb；4：fya；5：ii32b；6：ii32a；7：co1403；8：co1404；9：桃1b；10：桃1a；11：p102；12：p88s；13：he-88；14：he-127；15：he-130；16：he-159；17：he-160；18：黃華佔；19：玉針香；20：玉晶軟佔；21：馬壩銀佔；22：16hz-164；23：16h凡；24：r288。
其中，pcr反應體系配置為：
上述pcr擴增反應條件為：94℃變性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，擴增35個循環；72℃延伸7min。
實施例2利用pi9indel2標記檢測雜交種f1代中pi9目的基因
供試材料：pi9基因供體材料75-1-127、1份與75-1-127遺傳背景不同的水稻親本材料15s002、及其以75-1-127作為供體親本雜交獲得的10個f1代群體。
所需試劑：同實例1。
實驗程序：分別以各供試水稻材料基因組dna為模板，配置10μlpcr反應體系，然後進行pcr擴增，擴增產物用濃度為1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。pcr反應體系配置和pcr反應條件同實例1。實驗結果如圖3所示。
圖3為本發明實例2中利用pi9indel2標記檢測雜交種f1代中，pi9基因的pcr擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，m為dnamarker標記，左側標註為對應dnamarker條帶分子量大小；各泳道分別為：1：75-1-127；2：15s002；3-12：15s002/75-1-127f1株系，其中僅9泳道為不含有pi9基因的純合子(即為假雜種)，其餘為含有pi9基因的雜合子。
實施例3利用pi9indel2標記檢測回交自交育種群體中pi9基因純合狀態
供試材料：pi9基因供體材料75-1-127、1份不含pi9基因的水稻親本材料lh422和10份該親本材料與75-1-127雜交後的bc6f2代回交自交分離群體株系。
所需試劑：同實例1。
實驗程序：分別以各供試水稻材料基因組dna為模板，配置10μlpcr反應體系，然後進行pcr擴增，擴增產物用濃度為1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。pcr反應體系配置和pcr反應條件同實例1。實驗結果如圖4所示。
圖4為本發明實例3中利用pi9indel2標記檢測bc6f2代回交自交育種群體中，pi9基因純合狀態的pcr擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，m為dnamarker，左側標註為對應dnamarker條帶分子量大小；各泳道分別為：1：75-1-127；2：lh422；3-12：lh422/75-1-127bc6f2株系，其中4、7、8均為含有pi9基因的純合子，10為不含有pi9基因的純合子，其餘為雜合子。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
序列表
湖南農業大學
水稻抗稻瘟病pi9基因的共顯性功能分子標記pi9indel2及其應用
khp171111046.2
4
patentinversion3.5
1
8589
dna
pi9
1
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