一種海綿共生放線菌的分離篩選方法
2023-05-12 04:27:06
專利名稱：一種海綿共生放線菌的分離篩選方法
技術領域：
本發明涉及放線菌，具體地說是海洋環境中海綿共生放線菌的分離篩選的新方法。
背景技術：
放線菌屬於好氧革蘭氏細菌，通常具有類似真菌的孢子絲，它們在自然環境中廣 泛分布。放線菌是一大類有益次級代謝產物的生產者。目前所使用的抗生素中，70%是由 放線菌產生。而已知的微生物來源的抗腫瘤化合物，都源自於放線菌。另外放線菌的次級 代謝產物還表現在抗病毒、抗感染、抗寄生、酶抑制劑等。就海洋中放線菌而言，在海水、海泥和海洋生物中也廣泛存在。國際上報導的來源 於海洋微生物活性物質中，其中有一半以上來自放線菌，這說明了在海洋微生物資源和相 關產物開發過程中，放線菌仍是主力軍。而且從海洋放線菌分離得到的化合物具有不同於 陸地放線菌的特殊結構，其活性也是令人欣喜。海綿是一種原始的無脊椎動物，屬於底棲濾食性動物，生活在海洋中的巖石上，在 海綿濾食過程中，許多微生物尤其是不能被消化的微生物得以在海綿體內保留，這樣在海 綿體內和體表就富集了大量的微生物。這些微生物分布在海綿宿主細胞的胞外和胞內，如 海綿外層的胞外共生微生物和海綿中膠層的胞內共生微生物。胞內(包括細胞質內和細胞 核內)的微生物可以長久的存在於細胞和細胞核內。通過傳統培養和分子生物學方法發現 海綿中存在大量豐富的共生放線菌資源，僅有少部分放線菌獲得了純培養，絕大部分放線 菌用目前分離培養方法不能獲得純培養，尤其是一些胞內的共生微生物，分離和培養的難 度較大。為了提高海綿共生放線菌的可培養性，本方法在篩選方法上做了改進，包括樣品前 處理和選擇性培養基兩方面。
發明內容
本發明的目的在於提供一種簡便易行、快速有效的海綿共生放線菌的分離篩選新 方法。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為將採集海綿樣品，通過改進的方法對樣品前處理後，將它們塗布在特定的培養基 中培養。樣品前處理包括將採集的海綿樣品室溫乾燥後研成粉末，放入60 80°C乾燥箱 乾燥，取出樣品涼至室溫後，加入含0. 1 0. 2%脫脂奶粉IOmM的MOPS(3-嗎啉丙磺酸)， 27 28°C振蕩培養1 2小時，離心，保留上清，分成兩份備用。以HVA為基礎培養基，向 其中加入微量元素作為培養基組成成份之一(微量元素的應用是模擬海綿微環境元素組 成的含量配製微量元素加入到培養基中)，基質選擇以膠凝糖代替瓊脂，碳源選擇用腐殖酸 或幾丁質配製成海綿放線菌液體(或固體)培養基。取一份上清直接均勻塗布於海綿放線 菌固體培養基進行培養觀察，將另一份上清先用海綿放線菌液體培養基進行富集培養，然 後再塗布於海綿放線菌固體培養基進行培養觀察。用此方法篩選得到多個種屬的放線菌菌株，說明本發明方便有效性。一種海綿共生放線菌的分離篩選方法，經過上述的海綿樣品前處理和培養基的改 進，分離篩選到了多樣性的海綿共生放線菌，具體工藝步驟如下1)取採集的海綿樣品，用無菌手術刀切塊後稱重，樣品塊於裝有無菌海水的燒杯 中洗滌3 5次，洗去樣品表面附著的微生物和其它雜質；2)將樣品室溫乾燥後研成粉末，放入60 80°C乾燥箱中乾燥彡1小時，取出樣品
涼至室溫； 3)取涼至室溫的樣品，每800 IOOOmg樣品加入8 IOml含質量濃度0. 脫 脂奶粉的IOmM的MOPS (3-嗎啉丙磺酸)，27 28°C振蕩培養彡1小時，1000 1200Xg離 心10 15分鐘，取0. 1 0. 2mL的上清均勻塗布於海綿放線菌固體培養基平板上，27 28°C培養箱中倒置培養，觀察菌株生長情況；4)另取8 IOml上清加入IOOml海綿放線菌液體培養基中，在三角燒瓶中搖瓶富 集培養彡24小時，溫度為27 28°C，轉速為150 250轉/分鐘；5)取富集培養後的海綿放線菌液體培養基0. 5ml，加入裝有4. 5ml無菌海水的試 管中渦旋混勻作為原液，原液進行10_\10_2、10_3系列稀釋作為備用菌液；6)分別取上述稀釋操作中各步的備用菌液0. 1 0. 2ml均勻塗布於海綿放線菌固 體培養基平板，每種稀釋度的備用菌液塗5 10個平板；27 28°C培養箱中倒置培養，觀 察菌株生長情況；當平板上出現螺旋形氣生菌絲或堅硬光滑的典型放線菌菌落後，挑取單 菌落在海綿放線菌固體培養基平板上劃線；劃線後的平板再於27 28°C培養箱中倒置培 養5 7天，挑取單菌落繼續在海綿放線菌固體培養基平板上劃線培養，重複這一過程3 5次；直到菌落長成純的單菌落；7)挑取純的單菌落接種海綿放線菌液體培養基在試管中27 28°C，150 250 轉/分鐘培養48 72小時，觀察培養液出現明顯菌絲體成球後，取菌液加入裝有體積濃度 15 20%甘油水溶液的凍存管中，顛倒混勻，_70°C放置保存備用。所述海綿樣品為大連黃渤海海域潮間帶的繁茂海綿(Hymeniacidonperleve)或 腎指海綿(Reniochalina sp.)，海南三亞小軸海綿(Axinella sp.)，採自50 4800米深的 南極海域海綿Myxilla mollis,Rossella nuda,Rossellaracovitzae,Homaxinella sp.或 Polymastia sp.。所述海綿放線菌液體培養基配製過程如下將腐殖酸或幾丁質0.5 lg、 MgSO4O. 5g、KCl 1. 7g、CaCl2O. 02g、Na2HPO4O. 5g、微量元素 1 2ml、NaCl 20g 加入到 IL 去 離子水中，調PH值到7. 0 7. 2，110 120°C蒸汽滅菌15 20分鐘，放置冷卻到50 60°C，加入經0. 22uM濾膜過濾除菌的複合維生素液1 2ml。所述海綿放線菌固體培養基配製過程如下將腐殖酸或幾丁質0.5 lg、 MgSO4O. 5g、KCl 1. 7g、CaCl20. 02g,Na2HPO4O. 5g、微量元素 1 2ml、膠凝糖 18g、NaCl 20g 力口 入IL去離子水中，調pH值到7. 0 7. 2，110 120°C蒸汽滅菌15 20分鐘，放置冷卻到 50 60°C，加入經0. 22uM濾膜過濾除菌的複合維生素液1 2ml，倒平板。所述微量元素是模擬海綿體內元素組成配製，其成份為於0. IN HCl溶液中， Na2Si035Mm ；FeCl3 『 6H20 ImM ；MnSO4 『 H2O 2. 5mM ；KAL (SO4)2O. 2mM ；CaCl 『 2H20 IOmM ； MgSO4ImM ；CoCl · 6H20 0. ImM ；TiCl3O. 5mM ；禾口 Na2MoO4 · 2H20 0. ImM0
所述複合維生素的組成為去離子水中含0. 5mg/ml VB1、0. 5mg/mlVB2、0. 5mg/ml VB6、對氨基苯甲酸0. 5mg/ml、煙酸0. 5mg/ml、肌醇0. 5mg/ml、泛酸鈣0. 5mg/ml和生物素 0. 25mg/ml。本發明的優點在於由於放線菌是一類具有分枝菌絲的特殊細菌，其生長比一般細菌緩慢，在篩選當中它的生長常會受到快速生長菌的抑制，因此放線菌的分離篩選比較 困難。對於海綿共生放線菌，尤其是一些胞內的共生菌，分離和培養的難度就更大。現有和 經典的分離、培養技術還不能滿足對海綿共生放線菌的分離。因此本方法在富集培養階段 採用了創新設計的海綿放線菌培養基，以HVA為基礎培養基，加入模擬海綿體內元素組成 配製的微量元素作為培養基組成成份之一，並加複合維生素做為生長因子以利於放線菌的 生長。在樣品預處理時採用室溫與乾燥箱乾燥相結合，可以很大程度地抑制一般的細菌孢 子，而對抗逆性較強的放線菌孢子抑制較小，方法簡便易行。本發明適用於不同環境的海綿共生放線菌的分離培養，為醫藥中間體、農藥化學 等工業領域提供活性化合物。
具體實施例方式實施例11)取採集的海綿樣品，用無菌手術刀切塊後稱重，樣品塊於裝有無菌海水的燒杯 中洗滌5次，洗去樣品表面附著的微生物和其它雜質；2)將樣品室溫乾燥後研成粉末，放入80°C乾燥箱中乾燥1小時，取出樣品涼至室 溫；3)取涼至室溫的樣品，每Ig樣品加入IOml含質量濃度0. 1 %脫脂奶粉的IOmM的 MOPS (3-嗎啉丙磺酸)，28°C振蕩培養1小時，1000 X g離心10分鐘，取0. Iml的上清均勻塗 布於海綿放線菌固體培養基平板上，28°C培養箱中倒置培養，觀察菌株生長情況；4)另取8ml上清加入IOOml海綿放線菌液體培養基中，在三角燒瓶中搖瓶富集培 養24小時，溫度為28°C，轉速為200轉/分鐘；5)取富集培養後的海綿放線菌液體培養基0. 5ml，加入裝有4. 5ml無菌海水的試 管中渦旋混勻作為原液，原液進行10_\10_2、10_3系列稀釋作為備用菌液；6)分別取上述稀釋操作中各步的備用菌液0. Iml均勻塗布於海綿放線菌固體培 養基平板，每種稀釋度的備用菌液塗6個平板；28°C培養箱中倒置培養，觀察菌株生長情 況；當平板上出現螺旋形氣生菌絲或堅硬光滑的典型放線菌菌落後，挑取單菌落在海綿放 線菌固體培養基平板上劃線；劃線後的平板再於28°C培養箱中倒置培養7天，挑取單菌落 繼續在海綿放線菌固體培養基平板上劃線培養，重複這一過程3次；直到菌落長成純的單 菌落；7)挑取純的單菌落接種海綿放線菌液體培養基在試管中28°C，200轉/分鐘培養 72小時，觀察培養液出現明顯菌絲體成球後，取菌液加入裝有體積濃度20%甘油水溶液的 凍存管中，顛倒混勻，-70°C放置保存備用。實施例1所述海綿樣品為大連黃海海域潮間帶的繁茂海綿。實施例1所使用的海綿放線菌液體培養基配製過程如下將腐殖酸0.5g、 MgSO4O. 5g、KCl 1. 7g、CaCl2O. 02g、Na2HPO4O. 5g、微量元素 lml、NaCl 20g 加入 IL 去離子水中，調pH值到7. 2，120°C蒸汽滅菌20分鐘，放置冷卻到60°C，加入經0. 22uM濾膜過濾除菌 的複合維生素液2ml，倒平板。實施例1所使用的海綿放線菌固體培養基配製過程如下將腐殖酸0.5g、 MgSO4O. 5g、KCl 1. 7g、CaCl2O. 02g、Na2HPO4O. 5g、微量元素 1ml、膠凝糖 18g、NaCl 20g 加入 IL去離子水中，調pH值到7. 2，120°C蒸汽滅菌20分鐘，放置冷卻到60°C，加入經0. 22uM濾 膜過濾除菌的複合維生素液2ml，倒平板。共分離獲得純化的放線菌菌株108株，通過分子生物學(16SrDNA序列比對) t Hi另U M 方if _ 白勺 + f M :Streptomyces, Nocardiopsis, Micromonospora,
Ce 11u1 οsimicrobium, Gordonia, Nocardia, Prauseria, PseudonOcardia, Saccharomonospora, Microbacteriu ；這些分離到的海綿共生放線菌菌株分別與NCBI上發 表的來源於海洋的菌株相似性為99 100%，它們廣泛分布於海洋環境中。實施例2與實施例1不同之處在於，其所選用的海綿樣品為熱帶南海小軸海綿。分離獲得 菌株15株。包括方文線菌的三個屬Streptomyces, Nocardiopsis, Pseudonocardia0這些分 離到的海綿共生放線菌菌株分別與NCBI上發表的來源於海洋的菌株相似性為99 100%， 它們廣泛分布於海洋環境中。實施例3與實施例1、2不同之處在於，其所選用的海綿樣品為南極海域50 4800米 深的海綿。分離獲得菌株42株，包括放線菌的五個屬Str印tomyces，Nocardiopsis, Pseudonocardia，Nocardia，Dietzia 禾口 Brevibacterium。這些分離至Ij的海綿共生放線菌菌 株分別與NCBI上發表的來源於海洋的菌株相似性為99 100%，它們廣泛分布於海洋環境中。
權利要求
一種海綿共生放線菌的分離篩選方法，具體工藝步驟如下1)取採集的海綿樣品，用無菌手術刀切塊後稱重，樣品塊於裝有無菌海水的燒杯中洗滌3～5次，洗去樣品表面附著的微生物和其它雜質；2)將樣品室溫乾燥後研成粉末，放入60～80℃乾燥箱中乾燥≥1小時，取出樣品涼至室溫；3)取涼至室溫的樣品，每800～1000mg樣品加入8～10ml含質量濃度0.1％脫脂奶粉的1OmM的MOPS(3-嗎啉丙磺酸)，27～28℃振蕩培養≥1小時，1000～1200×g離心10～15分鐘，取0.1～0.2mL的上清均勻塗布於海綿放線菌固體培養基平板上，27～28℃培養箱中倒置培養，觀察菌株生長情況；4)另取8～10ml上清加入100ml海綿放線菌液體培養基中，在三角燒瓶中搖瓶富集培養≥24小時，溫度為27～28℃，轉速為150～250轉/分鐘；5)取富集培養後的海綿放線菌液體培養基0.5ml，加入裝有4.5ml無菌海水的試管中渦旋混勻作為原液，原液進行10-1、10-2、10-3系列稀釋作為備用菌液；6)分別取上述稀釋操作中各步的備用菌液0.1～0.2ml均勻塗布於海綿放線菌固體培養基平板，每種稀釋度的備用菌液塗5～10個平板；27～28℃培養箱中倒置培養，觀察菌株生長情況；當平板上出現螺旋形、放線狀氣生菌絲或堅硬光滑的典型放線菌菌落後，挑取單菌落在海綿放線菌固體培養基平板上劃線；劃線後的平板再於27～28℃培養箱中倒置培養5～7天，挑取單菌落繼續在海綿放線菌固體培養基平板上劃線培養，重複這一過程3～5次；直到菌落長成純的單菌落；7)挑取純的單菌落接種海綿放線菌液體培養基在試管中27～28℃，150～250轉/分鐘培養48～72小時，觀察培養液出現明顯菌絲體成球後，取菌液加入裝有體積濃度15～20％甘油水溶液的凍存管中，顛倒混勻，-70℃放置保存備用。
2.根據權利要求1所述的分離篩選方法，其特徵在於所述海綿樣品為大連黃渤海海 域潮間帶的繁茂海綿(Hymeniacidon perleve)或腎指海綿(Reniochalina sp.)，海南三亞 小軸海綿(Axinella sp.)，採自50 4800米深的南極海域海綿Myxilla mollis,Rossella nuda, Rossella racovitzae, Homaxinella sp.或Polymastia sp.。
3.根據權利要求1所述的分離篩選方法，其特徵在於所述海綿放線菌液體培養基配 制過程如下將腐殖酸或幾丁質 0. 5 lg、MgSO4O. 5g、KCl 1. 7g、CaCl2O. 02g、Na2HPO4O. 5g、 微量元素1 2ml、NaCl 15 20g加入到IL去離子水中，調pH值到7. 0 7. 2，110 120°C蒸汽滅菌15 20分鐘，放置冷卻到50 60°C，加入經0. 22uM濾膜過濾除菌的複合 維生素液1 2ml。
4.根據權利要求1所述的分離篩選方法，其特徵在於所述海綿放線菌固體培養基配 制過程如下將腐殖酸或幾丁質 0. 5 lg、MgSO4O. 5g、KCl 1. 7g、CaCl2O. 02g、Na2HPO4O. 5g、 微量元素1 2ml、膠凝糖18g、NaCl 20g加入IL去離子水中，調pH值到7. 0 7. 2，110 120°C蒸汽滅菌15 20分鐘，放置冷卻到50 60°C，加入經0. 22uM濾膜過濾除菌的複合 維生素液1 2ml，倒平板。
5.根據權利要求3或4所述的分離篩選方法，其特徵在於所述微量元素是模擬海綿 體內元素組成配製，其成份為於0. IN HCl溶液中，Na2Si035Mm ；FeCl3 ·6Η20 ImM ；MnSO4 ·Η20 2. 5mM ；KAL (SO4)2O. 2mM ；CaCl · 2H20 IOmM ；MgSO4ImM ；CoCl · 6H20 0. ImM ；TiCl3O. 5mM ；禾口Na2MoO4 · 2H20 0. ImM0
6.根據權利要求3或4所述的分離篩選方法，其特徵在於所述複合維生素液的組成 為去離子水中含 0. 5mg/ml VB 1,0. 5mg/ml VB2、0. 5mg/mlVB6、對氨基苯甲酸 0. 5mg/ml、煙 酸 0. 5mg/ml、肌醇 0. 5mg/ml、泛酸鈣 0. 5mg/ml 和生物素 0. 25mg/ml。
全文摘要
本發明涉及放線菌，具體地說是一種海綿共生放線菌的分離篩選方法，其以海綿樣品為分離源，通過樣品前預處理和模擬海綿體內元素組成配製微量元素作為培養基配方之一，以複合維生素作為生長因子促進放線菌生長，配製海綿放線菌液體(或固體)培養基，通過富集培養、平板篩選、菌株的分離純化等步驟可以最終得到海綿共生放線菌。本發明適用於不同環境的海綿共生放線菌的分離培養，為醫藥中間體、農藥化學等工業領域提供活性化合物。
文檔編號C12N1/20GK101845406SQ200910010870
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者信豔娟, 張衛, 黃劍宇 申請人:中國科學院大連化學物理研究所